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Quel est le volume de culture recommandé pour les cellules HeLa et le nombre d'ensemencement pour les puits de plaque à 384 puits ?


Pour les puits des plaques à 24 puits, thermofischer recommande d'ensemencer les cellules 0,05E6 avec 0,5 à 1 ml de milieu. Quels sont les nombres recommandés pour un puits de plaque à 384 puits ?


Le Privalsky [email protected] écrit :

Zone de croissance des plaques et boîtes de culture tissulaire

Surface de croissance (cm2) Volume du milieu (ml) Volume maximum (ml) Plaques 35 mm 8 1,6- 2,4 60 mm 21 4,2- 6,3 100 mm 44 11 -16,5 150 mm 148 30 -45 245 mm (carré) 500 100-150 Boîtes 6 puits 9,5 1,9 -2,0 16,8 12 puits 3,8 0,76 -1,14 6,9 24 puits 1,9 0,38 -0,57 3,4 48 puits 0,95 0,19 -0,28 1,6 96 puits 0,32 0,1 -0,2 0,36 384 puits 0,056 0,025-0,05 0,125 Flacons T25 25 5- 7,5 T75 75 15-22,5 T150 150 30-45

Densité d'ensemencement cellulaire - (29 septembre 2008 )

Salut tout le monde,
Je suis nouveau dans la culture cellulaire et je travaille avec des cellules musculaires lisses.
Quelqu'un peut-il me dire comment calculer la densité d'ensemencement des cellules? Pour être plus précis, disons que je récolte des cellules dans un flacon T 75 et que le nombre est de 500 000/ml. Maintenant, comment dois-je calculer le nombre de cellules par puits si elles sont ensemencées dans des plaques à 12 puits.
Sil te plait aide moi.
Merci

Salut, merci Minnie Mouse. Le pdf est vraiment bon et utile. Mais je veux savoir comment calculer le nombre de cellules par puits. N'importe qui svp.

Si vous avez 20 ml en flacon T75, alors vous aurez un total de 1x10^7 (500 000 x 20 = 10 000 000)

Si vous avez ensemencé toutes les cellules dans 12 puits, alors

1x10^7 cellules/12puits = 833,333cellules/puits

Je pense que c'est trop de cellules par puits.

Pouvez-vous me dire le volume de la suspension cellulaire dans le flacon T75 et la densité d'ensemencement requise dans la plaque à 12 puits ?

Le vol. de milieu dans T75 était de 10 ml. Les cellules ont été trypsinisées, culottées et mises en suspension dans 4 ml de milieu. Compté par le compteur de socs et le comptage était de 500 000/ml. Je veux mettre ces cellules en quantité égale dans chaque puits dans des plaques à 12 puits (1 ml/puits) ou disons des plaques à 96 puits (200 ul/puits). Que dois-je faire ?

Maintenant, Minnie mouse, tu as divisé le nombre de cellules par 12 puits. Alors c'est non. de puits qui compte ou quantité de suspension (en ml/ul).

Merci pour votre réponse, mais j'ai besoin de plus

Si vous avez 20 ml dans un flacon T75, alors vous aurez un total de 1x10^7 (500 000 x 20 = 10 000 000)

Si vous avez ensemencé toutes les cellules dans 12 puits, alors

1x10^7 cellules/12puits = 833,333cellules/puits

Je pense que c'est trop de cellules par puits.

Pouvez-vous me dire le volume de la suspension cellulaire dans le flacon T75 et la densité d'ensemencement requise dans la plaque à 12 puits ?

. [Le vol. de milieu dans T75 était de 10 ml. Les cellules ont été trypsinisées, culottées et mises en suspension dans 4 ml de milieu. Compté par le compteur de socs et le comptage était de 500 000/ml. Je veux mettre ces cellules en quantité égale dans chaque puits dans des plaques à 12 puits (1 ml/puits) ou disons des plaques à 96 puits (200 ul/puits). Que dois-je faire ?

salut,
Je suggère ce que Minnie Mouse a suggéré, mais en d'autres termes :
vous avez 500.000X4ml = 2000000 cellules.
pour les plaques 12 puits :
amener les cellules de 4 ml à 12,5 ml.
puis mettre 1 ml dans chaque puits. jeter les 0,5 ml restants. vous aurez 166.666 cellules/puits

pour plaques 96 puits :
porter les cellules de 4 ml à 20 ml.
mettre 200ul dans chaque puits. jeter les 800ul restants. vous aurez 20,8 cellules/bien

Hé merci mec pour vos efforts, mais comment obtenez-vous 166,666 cellules/puits et 20,8 cellules/puits. Pouvez-vous l'expliquer un peu plus. Plz.

. [Le vol. de milieu dans T75 était de 10 ml. Les cellules ont été trypsinisées, culottées et mises en suspension dans 4 ml de milieu. Compté par le compteur de socs et le comptage était de 500 000/ml. Je veux mettre ces cellules en quantité égale dans chaque puits dans des plaques à 12 puits (1 ml/puits) ou disons des plaques à 96 puits (200 ul/puits). Que dois-je faire ?

salut,
Je suggère ce que Minnie Mouse a suggéré, mais en d'autres termes :
vous avez 500.000X4ml = 2000000 cellules.
pour les plaques 12 puits :
amener les cellules de 4 ml à 12,5 ml.
puis mettre 1 ml dans chaque puits. jeter les 0,5 ml restants. vous aurez 166.666 cellules/puits

pour plaques 96 puits :
porter les cellules de 4 ml à 20 ml.
mettre 200ul dans chaque puits. jeter les 800ul restants. vous aurez 20,8 cellules/bien

[cite name='ambition' date='Sep 30 2008, 13:00' post=�']
Hé merci mec pour vos efforts, mais comment obtenez-vous 166,666 cellules/puits et 20,8 cellules/puits. Pouvez-vous l'expliquer un peu plus. Plz.

vous devez choisir une cellule et la recracher en 1000 parties. puis vous choisissez 666 pièces et les mettez dans le puits.
allez.
ce n'est que le résultat du calcul. c'est comme dire : à Springfield 1,3 hommes/10 sont gays ou 13 hommes/100 ou 130/1000. etc.

Veuillez consulter cet article pour le protocole de culture cellulaire Sigma

Merci les gars, pour votre patience, c'est peut-être la chose la plus stupide à demander mais ce n'est toujours pas très clair.
Permettez-moi de mettre mes mots, pour le calcul non. de cellules par puits, je dois diviser le nombre de cellules par ml (disons 10 000 cellules par ml) par la quantité totale de milieu (disons 12,5 ml pour une plaque à 12 puits) requise. Est-ce la bonne façon.


Comment calculer la densité d'ensemencement cellulaire

Pour rendre les données de croissance et de prolifération cellulaires homogènes et indépendantes du vaisseau utilisé, la référence a ne pas à faire sur le nombre total de cellules dans un puits mais plutôt sur la densité de cellules (cellules / cm 2 ), c'est-à-dire le nombre de cellules dans 1 cm 2 de surface de croissance.

J'explique mieux avec un exemple : dans un 96 puits, qui a généralement une surface de 0,3 cm 2 , le nombre total de cellules à plaquer sera beaucoup plus petit que le nombre de cellules à plaquer dans un flacon de 25 si la même cellule la densité doit être maintenue. Donc si pour un certain type cellulaire vous établissez que vous devez ensemencer 10000 cellules dans un puits de 96, alors dans un flacon de 25 vous devrez ensemencer 10000/0,3 * 25 cellules au total. De cette façon, la densité des cellules sera maintenue constante.

Si vous savez que dans un puits de 96 à la confluence vous avez environ 40 000 cellules, alors dans un flacon de 25 vous aurez environ 3 millions de cellules. Cela peut être utile pour calculer le rendement en termes de nombre de cellules, puis faire une expérience ultérieure.

La formule pour calculer le nombre de cellules en 1 cm 2 , c'est-à-dire la densité de semis (SD) est :

où N = nombre total de cellules (PAS de cellule/ml)

A = surface (exprimée en cm 2 ) du puits dans lequel les cellules sont cultivées

S'il est nécessaire de calculer le nombre de cellules à plaquer dans un puits de format différent, alors la formule à utiliser pour maintenir la même densité d'ensemencement (SD) sera :

où N = nombre total de cellules

A1 = surface (exprimée en cm 2 ) du puits dans lequel les cellules sont actuellement cultivées

A2 = surface (exprimée en cm 2 ) du puits dans lequel je veux faire pousser les cellules (à l'avenir) afin que la même densité cellulaire soit maintenue.


Résultats

L'optimisation de la densité d'ensemencement cellulaire, de la concentration d'EDTA et de la densité cellulaire au cours de l'analyse entraîne une augmentation de 12 fois de la récupération de cellules uniques

Le premier objectif du développement de ce protocole HTFC était de trouver une stratégie pour optimiser la récupération cellulaire reproductible, en utilisant la lignée cellulaire de neuroblastome GIMEN adhérente. Initialement, nous avons adapté le protocole de détachement cellulaire de Kaur et Esau à un format de 384 puits 10, mais nous n'avons pas pu obtenir une récupération cellulaire suffisante et reproductible (Fig. 1A, avant optimisation).

Premièrement, la densité d'ensemencement cellulaire a été évaluée en ensemençant un nombre croissant de cellules par puits. Comme prévu, la récupération des cellules s'est nettement améliorée lorsque plus de cellules ont été plaquées (Fig. 1B). Cependant, la reproductibilité de la récupération cellulaire diminuait lorsque la densité d'ensemencement dépassait 5 000 cellules/puits, comme observé par une augmentation de SD. Sur la base de ces données, il a été conclu qu'une densité d'ensemencement cellulaire de 4 500 cellules/puits était optimale. Deuxièmement, l'évaluation microscopique des suspensions cellulaires après différentes durées de périodes d'incubation avec des concentrations croissantes d'EDTA a révélé un temps d'incubation minimum de 45 min et une concentration minimum d'EDTA de 3 mM (données non présentées). Une augmentation supplémentaire de la concentration d'EDTA à 3,2 et 3,4 mM n'a pas entraîné d'amélioration supplémentaire de la récupération des cellules (Fig. 1C). Enfin, nous avons évalué l'effet de la dilution de l'échantillon avant l'analyse par cytométrie en flux. La dilution des échantillons avec 50 L de PBS additionné de 2% de FCS + 2 M d'EDTA a entraîné une augmentation de 3,8 fois de la récupération cellulaire (Fig. 1D). La densité d'ensemencement cellulaire optimale, la concentration de détachement des cellules EDTA et les temps d'incubation, et la densité de suspension cellulaire finale de l'échantillon de cytométrie en flux par puits ont entraîné une augmentation de plus de 12 fois de la récupération de cellules uniques (Fig. 1A). Plus de 90 % de la population cellulaire sans débris étaient des cellules uniques et le débit était constant. Les colorations 7-AAD et TMRM ont confirmé que les cellules étaient vivantes (informations justificatives S1).

La reproductibilité des nombres de cellules récupérées avec le protocole peut être conclue à partir d'un écran de composé HTFC que nous avons effectué à l'aide de ce protocole, dans lequel plus de 10 000 puits ont été analysés avec une récupération moyenne de 1 600 (± SD 294) cellules uniques vivantes/puits. Cela correspond à 74% de récupération de cellules uniques vivantes une fois corrigé pour le volume échantillonné.

La coloration optimisée des anticorps permet une coloration (multiplexée) avec un signal de fond non spécifique minimal

L'élimination de toutes les étapes de lavage du protocole HTFC contribue à la nature HT du protocole en diminuant l'intensité du travail, tout en minimisant la perte de cellules inhérente au lavage. D'autre part, l'élimination de ces étapes indique également clairement la nécessité d'un titrage de la concentration en anticorps. Le TNF-α et l'IFN-γ sont impliqués dans la régulation positive de l'expression des protéines de surface cellulaire de MHC-I 11, CD54 (ICAM-1) (13, 14) et CD274 (PD-L1) 15 dans plusieurs types de cellules tumorales. Les effets de ces cytokines sur l'expression des protéines ont été validés pour toutes les lignées cellulaires utilisées à l'aide de la cytométrie en flux conventionnelle (illustrée pour GIMEN Fig. 2A et Informations complémentaires S2).

La diminution de la concentration d'anticorps a provoqué une nette diminution de la coloration de fond dans les cellules MHC-I colorées par HLA-ABC traitées au milieu dépourvues de cellules GIMEN (figure 2B). Cependant, une diminution marquée de l'indice de coloration entre les échantillons non traités et traités par TNF-α + IFN-γ a été observée lors de la diminution de la concentration d'anticorps (Fig. 2C). Cela indiquait un équilibre délicat entre la coloration de fond non spécifique et la capacité discriminante de la coloration de l'anticorps. Le titrage a montré que la concentration en anticorps HLA-ABC était optimale à une concentration de 8 ng/puits (concentration finale de 0,27 ng/μL). Le protocole de coloration HTFC permet une discrimination distincte entre l'expression de HLA-ABC dans les non-traités par rapport aux TNF-α-traités (Z = 49) et versus cellules traitées par TNF-α + IFN-γ (Z = 94) (m = 8 par groupe), comparable aux résultats d'un protocole de coloration classique typique (Fig. 2A). Le même effet est observé pour les autres anticorps utilisés (Supporting Information S2).

Un aspect unique de la cytométrie en flux est la possibilité de multiplexer l'analyse de l'expression des protéines sur/dans la même cellule. La combinaison de cet aspect avec HTS permet d'augmenter les possibilités et l'informativité de l'analyse HTS. La combinaison de la coloration d'anticorps de HLA-ABC avec le colorant d'acide nucléique 7-AAD et la coloration d'anticorps contre PD-L1 et ICAM-1 n'a révélé aucune différence notable dans l'efficacité de coloration individuelle du protocole HTFC, comme indiqué pour la coloration d'anticorps HLA-ABC (Fig. 3A).

Nous avons précédemment généré une lignée cellulaire rapporteur GIMEN NFkB et découvert que le TNF-α régule positivement l'expression du MHC-I d'une manière dépendante de NFkB, tandis que la régulation positive du MHC-I induite par l'IFN-γ est indépendante de NFkB 11 . L'utilisation de notre protocole HTFC combinant la coloration des anticorps HLA-ABC avec l'évaluation de l'expression intrinsèque du rapporteur NFkB a confirmé la dépendance (in) de NFkB des régulations positives du CMH-I observées (Fig. 3B). Cela montre que le protocole est également adapté pour étudier les effets des composés sur les facteurs de transcription intracellulaires à l'aide de lignées cellulaires rapporteurs.

Le protocole de coloration est traduisible en plusieurs lignées cellulaires sans aucune modification

Le protocole HTFC optimisé a ensuite été réalisé à l'aide de cinq lignées cellulaires supplémentaires, notamment le cancer du sein, le cancer du col de l'utérus, le cancer hépatocellulaire et les cellules rénales embryonnaires humaines. Les comptes de cellules individuelles récupérés étaient inférieurs (HepG2), comparables (MCF-7, SKBR3) ou supérieurs (HeLa, HEK293T) aux comptes obtenus dans les cellules de neuroblastome GIMEN (Informations complémentaires S3). Une coloration HTFC individuelle et multiplex a été réalisée et validée avec une coloration conventionnelle par cytométrie en flux (données non présentées). Les lignées cellulaires HepG2 et MCF-7 ont été sélectionnées en fonction de leur nature résistante à la trypsinisation. La lignée MCF-7 montre une récupération cellulaire suffisamment élevée et reproductible, même si nous observons plus de doublets, qui ont été exclus de l'analyse (Supporting Information S3A). En revanche, les cellules HepG2 à croissance plus lente et agglomérantes présentaient une diminution du nombre de cellules, avec une récupération moyenne de 814 cellules (m = 44, deux expériences individuelles), mais les comptes étaient encore suffisamment élevés et reproductibles pour des résultats fiables (Informations à l'appui S3E). Cela indique le potentiel de traduire le protocole HTFC universellement à d'autres lignées cellulaires adhérentes d'intérêt, contribuant à la polyvalence du protocole.


Discussion

Le test avec lequel nous avons commencé cette étude n'a pas réussi à démontrer d'effets constants de l'inhibition de la glutaminase sur le métabolisme ou la prolifération de la glutamine dans ces deux lignées cellulaires cancéreuses : l'ajout de l'inhibiteur aux cellules (A549) connues pour être sensibles à l'inhibiteur, n'avait aucune effet sur leur prolifération (Figure supplémentaire S2a). A l'inverse, le métabolisme de la glutamine par les cellules (H358) qui sont danssensible au même inhibiteur a été réduite dans une mesure beaucoup plus importante que celle des cellules sensibles (A549) (Fig. 2). Nous avons ensuite démontré que ces incohérences étaient des artefacts, d'une part, car la plupart de la glutamine avait été épuisée pendant la période de pré-incubation (figures 2b et 3b) laissant trop peu de glutamine pour que les effets de l'inhibiteur deviennent statistiquement notables.

Grâce à nos conditions de dosage améliorées, nous avons pu montrer que l'inhibiteur de la glutaminase (GLS1i) a un effet sur le métabolisme de la glutamine des deux lignées cellulaires, mais que seule la prolifération des cellules A549 est réduite (Fig. 5). Pour les inhibiteurs de cibles intracellulaires, la question se pose toujours de savoir si celles-ci sont absorbées par les cellules. Notre inhibiteur a entraîné une augmentation de la glutamine intracellulaire et une diminution de la glutamine intracellulaire (Fig. 6a et b), suggérant que le composé est entré dans les cellules et a affecté sa cible : l'enzyme glutaminase.

Que l'inhibiteur utilisé dans cet article ait été conçu pour être un inhibiteur de la glutaminase, travaillant à une concentration de 1 micromolaire, n'a pas beaucoup d'importance : il suffit de savoir que l'inhibiteur affecte la prolifération cellulaire. En effet, nous nous attendons à ce que les inhibiteurs de la prolifération cellulaire qui agissent à travers n'importe quelle cible soient compromis par les changements dans l'environnement des cellules pendant le test, si les conditions ne sont pas conçues pour les maintenir au minimum. Nous avons utilisé un inhibiteur important pour l'industrie pharmaceutique, car il met en évidence les implications probables de nos découvertes. Pour pouvoir le faire, nous avons dû accepter que nous ne pouvons pas maintenant divulguer l'identité chimique de l'inhibiteur que nous avons utilisé.

Nos résultats soulignent l'importance de in vitro optimisation du dosage pour l'évaluation du potentiel des inhibiteurs métaboliques, et probablement aussi d'autres, en tant que médicaments anticancéreux ayant un impact sur le métabolisme cellulaire. La variabilité de l'état métabolique au cours du test peut très bien créer des faux positifs et des faux négatifs car le métabolisme intermédiaire et énergétique est plein d'implications pléiotropiques. Il est peut-être important de noter que les implications de nos résultats ne se limiteront probablement pas aux études sur les inhibiteurs métaboliques. Notre observation selon laquelle les tests de prolifération cellulaire pour l'efficacité des médicaments sont facilement compromis parce que les conditions métaboliques autour des cellules changent au cours de ces tests ne devraient pas seulement avoir un impact sur les tests de médicaments qui agissent sur le métabolisme. Les dosages de médicaments ciblant d'autres aspects de la biologie cellulaire tels que la division cellulaire ou l'anatomie cellulaire seront également compromis lorsque les cellules meurent ou changent d'état métabolique au cours du dosage : changements dans l'état métabolique, par ex. dans les niveaux d'ATP, affectera la dépendance de la viabilité sur presque n'importe quel médicament. Cela touche deux concepts importants : (i) les différentes « couches » de la fonction cellulaire sont fortement connectées, de sorte qu'il faut toujours considérer les autres couches lorsque l'on manipule une seule couche et (ii) une grande partie de « l'irreproductibilité » de la science qui est signalée n'est pas due à des erreurs expérimentales, mais à un manque de contrôle suffisant pour ces interactions fortes, en particulier une rétroaction via des effets sur l'état physiologique plus large du système à l'étude.

D'autres inhibiteurs, tels que ceux de la signalisation cellulaire ou de la transcription nécessitent des incubations cellulaires encore plus longues et peuvent donc être encore plus compromis par des changements dans les niveaux de métabolites tels que l'ATP, le NADH, l'acétyl-CoA et le glutamate qui interagissent largement. Même si le métabolisme peut ne pas être la cible du médicament dans de nombreux cas, sa perturbation due à des conditions de culture inappropriées peut produire une fausse réponse. Et puisque le médicament peut très bien affecter le métabolisme indirectement, l'impact du statut métabolique pourrait être négligé à la fois dans les conditions de contrôle et dans les conditions traitées. Nos résultats suggèrent que les analyses cellulaires sont encore plus facilement compromises par les changements métaboliques lorsque les cellules sont métaboliquement très actives. Naturellement, cela crée encore plus de problèmes pour les types de cellules pertinents pour le cancer. Pour les tests de lignées cellulaires robustes, il peut être justifié que de nouvelles technologies à haut débit soient développées qui maintiennent le milieu extracellulaire constant au fil du temps. Les technologies microfluidiques peuvent s'avérer adaptées pour cela.

Bien sûr, comme le souligne Haanstra et al. 35 trouver des médicaments qui tuent de manière robuste les cellules cancéreuses n'est pas nécessairement une bonne idée. Premièrement, toutes les actions des médicaments doivent être dépendantes de la concentration et, deuxièmement, les médicaments affecteront également les cellules normales (non cancéreuses). En ce sens, aucun médicament ne tuera les cellules cancéreuses à des concentrations qui n'affectent pas les cellules normales 36 . Les bons médicaments sont ceux qui tuent les cellules cancéreuses à des concentrations plus faibles que les cellules normales. Par conséquent, les dosages des médicaments anticancéreux doivent être à la fois précis et robustes.

Peut-être encore plus que cela, nos résultats devraient mettre en garde contre la mise en œuvre directe d'ensembles de conditions historiquement fixés pour les dosages de médicaments dans les lignées cellulaires. Les cellules vivantes sont suffisamment complexes pour s'engager dans toutes sortes de changements métaboliques, ces changements peuvent très bien différer entre les lignées cellulaires individuelles, et le métabolome est sensible à de tels changements bien avant que les flux métaboliques produits par les cellules soient 37 . Nous préconisons donc que les rapports sur les dosages de médicaments soient accompagnés d'une description approfondie de la procédure expérimentale utilisée ainsi que d'une caractérisation métabolique des cellules pendant le dosage, comme dans le flux de travail que nous avons démontré ici. Après tout, une telle caractérisation est devenue possible ces dernières années.

En effet, les rapports dans la littérature concernant les caractéristiques des lignées cellulaires dans des conditions basales et perturbées peuvent avoir négligé des changements dans l'environnement métabolique des cellules ou une densité cellulaire élevée. De tels aspects ne sont généralement pas rapportés ou mesurés et peuvent contribuer à l'irreproductibilité des résultats lors de la répétition du test dans un laboratoire différent. Une telle irréproductibilité alimente le débat sur la reproductibilité 1,2.

Non seulement nos résultats mettent en évidence la nécessité de rapporter des « détails » expérimentaux concernant les conditions de culture, mais ils montrent également un moyen de rationaliser et de standardiser celles-ci. Les détails requis incluraient, mais sans s'y limiter, des informations sur la source des lignées cellulaires et le numéro de passage (ou au moins si toutes les cellules utilisées étaient inférieures à un certain nombre de passage), le nombre de cellules par puits au moment de l'ensemencement et tout au long de la dosage, densité/confluence tout au long du dosage, volume de milieu de culture utilisé, détails des flacons de culture cellulaire utilisés, durée du dosage (à partir du moment de l'ensemencement), choix du milieu de culture cellulaire (y compris les concentrations de tous les composants) et des sérums (concentration utilisée et source), et comment les concentrations de nutriments clés (par exemple le glucose et la glutamine) et le pH changent tout au long du test. Cela compléterait les efforts existants pour la standardisation de la recherche biomédicale 38,39,40 et améliorerait la reproductibilité, la transparence et l'évaluation des données expérimentales, des points qui sont d'une importance critique 41 .

Un certain nombre de lignes directrices pour la communication des résultats d'essais biologiques existent depuis un certain temps, par ex. la norme MIAME (Minimum Information About a Microarray Experiment). MIAME est désormais une exigence de déclaration pour un certain nombre d'agences de financement et de revues 42 . De même, des normes minimales de déclaration sont désormais utilisées pour les modèles de métabolomique 39 , de protéomique 40 et de biologie des systèmes 43 . Depuis 2008, le projet Minimum Information for Biological and Biomedical Investigations (MIBBI) a servi de référentiel pour les nombreuses directives minimales de déclaration qui ont depuis été créées, il y en a maintenant plus de 40 pour les sciences biologiques et biomédicales (https://biosharing.org /standards/, consulté le 4 juillet 2016).

Le test développé et discuté ici, ainsi que l'affirmation selon laquelle il devrait être accompagné d'analyses métaboliques des lignées cellulaires du test, devrait contribuer à améliorer la reproductibilité du test en biologie cellulaire et dans la découverte de médicaments.


Conseils pratiques pour l'ensemencement des cellules

Commencez les préparatifs une semaine à l'avance. Pour les cellules HEK293, la confluence à 100 % est d'environ 10 à 12 millions/flacon de 75 cm 2 . Suggestion d'ensemencement : ensemencer 1 million de cellules (à partir du passage) dans 15 ml de DMEM + 10 % de FBS un vendredi de manière à avoir 90 % de confluence après le week-end.

Le lundi, trypsiniser les cellules et diluer à une densité de 1 million de cellules/ml. Mettre en place quatre flacons de culture cellulaire :

  • Le premier flacon est utilisé pour tester les densités cellulaires avec la forskoline et pour déterminer la meilleure concentration de forskoline. Ce flacon va être utilisé mardi. Semer un nombre suffisant de cellules afin d'atteindre une confluence de 80 à 90 % pendant la nuit. Ceci peut être réalisé en ajoutant 4 ml de cellules HEK293 à une densité de 1 million de cellules/ml à 11 ml de DMEM + 10 % de FBS.
  • Le deuxième flacon sera utilisé pour l'expérience proprement dite (traitement) avec les traitements agonistes et antagonistes. Ce flacon va être utilisé mercredi. Ajouter 2,5 ml de 1 million de cellules/ml de cellules HEK293 dans 12,5 ml de DMEM + 10 % de FBS.
  • Le troisième flacon est un flacon de réserve. Mélanger 1,5 ml de 1 million de cellules/ml de cellules HEK293 dans 13,5 ml de DMEM + 10 % de FBS.
  • Le quatrième flacon est utilisé pour le passage des cellules du vendredi au lundi suivant. Ajouter 0,75 ml de cellules à une densité de 1 million de cellules/ml à 14,25 ml de DMEM + 10 % FBS.

Ce protocole décrit la production de cellules de type hépatocyte (HLC) à partir de cellules souches pluripotentes humaines et comment induire la stéatose hépatique, une condition caractérisée par l'accumulation de lipides intracellulaires. Après la différenciation en un phénotype HLC, l'accumulation intracellulaire de lipides est induite avec un cocktail d'induction de stéatose, permettant à l'utilisateur d'examiner les processus cellulaires qui sous-tendent la stéatose hépatique. De plus, le caractère renouvelable de notre système, sur un fond génétique défini, permet une analyse mécanistique approfondie, ce qui peut faciliter l'identification de cibles thérapeutiques à l'avenir.

Pour plus de détails sur l'utilisation et l'exécution de ce protocole, veuillez vous référer à Sinton et al. (2021).


Préparation d'échantillons pour la microscopie à fluorescence : une introduction - Concepts et astuces pour de meilleurs résultats d'imagerie d'échantillons fixes

Plusieurs étapes de traitement sont nécessaires pour préparer des cellules de culture tissulaire pour la microscopie à fluorescence. Les expériences sont généralement classées en microscopie à cellules vivantes ou à cellules fixes. La microscopie à fluorescence de cellules vivantes utilise soit des protéines fluorescentes génétiquement codées (par exemple GFP, mcherry, YFP, RFP, etc.) soit des colorants fluorescents non toxiques perméables à la membrane cellulaire. La microscopie à fluorescence des cellules fixées utilise un agent fixateur qui rend les cellules mortes, mais maintient la structure cellulaire, permettant l'utilisation d'anticorps et de colorants spécifiques pour étudier la morphologie et la structure des cellules. Une préparation appropriée des échantillons est nécessaire pour garantir la capture d'images de haute qualité. Nous décrivons ici un certain nombre de concepts et de considérations concernant le processus de préparation des échantillons qui peuvent aider à la microscopie à fluorescence numérique automatisée de cellules fixes.

Fixation cellulaire

L'objectif de la fixation est de maintenir la structure cellulaire autant que possible à celle de l'état natif ou non fixé pendant les étapes de traitement et l'imagerie ultérieure. Il existe un certain nombre de méthodes de fixation adaptées à la microscopie à fluorescence qui se répartissent en deux catégories de base : les fixateurs à l'aldéhyde et les fixateurs à l'alcool. Les solvants organiques tels que les alcools et l'acétone éliminent les lipides et déshydratent les cellules, tout en précipitant les protéines sur l'architecture cellulaire. Les réactifs aldéhydes de réticulation forment des ponts intermoléculaires, normalement via des groupes amino libres, créant un réseau d'antigènes liés. Les agents de réticulation préservent mieux la structure cellulaire que les solvants organiques, mais peuvent réduire l'antigénicité de certains composants cellulaires et nécessitent une étape de perméabilisation pour permettre à l'anticorps d'accéder à l'échantillon. La fixation avec les deux méthodes peut dénaturer les antigènes protéiques, et pour cette raison, les anticorps préparés contre les protéines dénaturées peuvent être plus utiles pour la coloration cellulaire. Comme chaque méthode a ses avantages et ses inconvénients et parce que différentes méthodes de fixation peuvent détruire ou masquer différents épitopes, plusieurs méthodes différentes peuvent devoir être testées pour des résultats optimaux.

Les fixateurs d'aldéhydes réticulent les protéines et font généralement un excellent travail de préservation de la morphologie cellulaire. Bien qu'ils agissent généralement plus lentement que les fixateurs à base organique, 4% de formaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante est un bon point de départ. Le glutaraldéhyde réticulera également les protéines, mais entraîne une autofluorescence significative et doit généralement être évité ou utilisé en faible concentration en conjonction avec le formaldéhyde. Notez que le glutaraldéhyde est le fixateur préféré de choix pour la microscopie électronique.

Formaldéhyde vs Paraformaldéhyde vs Formol

Le paraformaldéhyde est un polymère du formaldéhyde. Il existe sous forme de poudre sèche adaptée au stockage et doit être décomposé en son composant monomère, le formaldéhyde. Ceci est accompli en chauffant dans des conditions basiques jusqu'à ce qu'il soit solubilisé. Les solutions commerciales de formaldéhyde, généralement appelées formol, contiennent souvent du méthanol pour empêcher la repolymérisation en paraformaldéhyde. Une solution de formol saturée a une teneur en formaldéhyde dans l'eau ou un tampon de 37 à 40 % et est parfois appelée « formol à 100 % ». Par conséquent, utiliser du formol à 10 % (dilution 1:10) équivaut à utiliser du formaldéhyde à 3,7 à 4 % pour la fixation. Étant donné que le &ldquo100% formol &rdquo contient jusqu'à 15% de méthanol comme stabilisant, il peut avoir un impact significatif sur la fixation. Ceci est principalement le résultat de la perméabilisation membranaire par le méthanol, ce qui entraîne une interférence dans la coloration des protéines liées à la membrane.

Préparez une nouvelle solution de formaldéhyde à 4% en dissolvant la poudre de paraformaldéhyde dans du PBS (PH 7,4) à l'aide d'une plaque chauffante en agitant avec le chauffage réglé à un réglage moyen jusqu'à ce que le liquide atteigne environ 60 °C. Au fur et à mesure que le paraformaldéhyde se décompose en formaldéhyde, il se dissoudra. Une fois la solution complètement dissoute (environ 30 min), la solution est rapidement refroidie sur de la glace à température ambiante avant utilisation. Typiquement, les cellules de culture tissulaire sont fixées pendant 10 minutes à température ambiante avec du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS suivi de 2 à 3 lavages avec du PBS pour éliminer l'excès de formaldéhyde et arrêter la réaction de fixation.

Les solvants organiques tels que le méthanol précipitent rapidement les protéines, maintenant ainsi leur structure. Alors que la structure cytosquelettique de la protéine cellulaire est maintenue avec la fixation du méthanol, les petites molécules à l'intérieur seront perdues au cours des étapes de traitement ultérieures car elles ne sont pas précipitées. Étant donné que le méthanol précipite les protéines, n'utilisez jamais cette méthode si des protéines fluorescentes codées génétiquement doivent être imagées ou détectées - l'activité de ces protéines sera abolie avec la fixation du méthanol. Le méthanol est utilisé à froid (-20 °C) pendant 10-20 minutes. L'utilisation d'une combinaison de méthanol et d'acétone (1:1) peut parfois améliorer les résultats. Le méthanol est le meilleur pour préserver la structure tandis que l'acétone améliore la perméabilisation. Après la fixation, les échantillons sont lavés avec du PBS 2 à 3 fois pour éliminer l'alcool et réhydrater l'échantillon.

Une autre considération importante d'un protocole de fixation est la sélection du tampon. Idéalement, le tampon est de nature isotonique afin de ne pas perturber la structure cellulaire, tout en maintenant un pH aussi proche que possible du physiologique. Le tampon le plus fréquemment utilisé est une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Lorsque vous utilisez des aldéhydes comme fixateurs, évitez d'utiliser des tampons contenant des amines, tels que le Tris, car ils réagiront avec le fixateur.

Perméabilisation

La fixation avec l'utilisation d'agents de réticulation ne diminue pas efficacement la structure de la membrane cellulaire. Par conséquent, la fixation du formaldéhyde nécessite que les cellules soient perméabilisées pour permettre aux anticorps d'accéder à l'intérieur des cellules. La grande taille et la nature ionique des protéines d'anticorps les empêchent d'accéder sans rupture de la membrane (Figure 1-2). La fixation à base d'alcool et d'acétone ne nécessite généralement pas cette étape.

La digitonine, le leucoperm et la saponine sont des détergents relativement doux qui génèrent des pores suffisamment grands pour que les anticorps passent à travers sans dissoudre complètement la membrane plasmique. Ceux-ci conviennent aux antigènes du cytoplasme ou de la face cytoplasmique de la membrane plasmique (Figure 1). La saponine agit en dissolvant le cholestérol présent dans la membrane plasmique. Lorsqu'elles sont utilisées à de faibles concentrations, les membranes internes restent intactes, il est donc utile pour marquer des molécules plus petites qui existent à l'état soluble dans le cytoplasme. Il doit être préparé sous forme de stock dans du DMSO et est généralement utilisé à raison de 0,5 à 1 mg/mL à température ambiante pendant 10 à 30 minutes.

Le Triton X-100 est probablement l'agent de perméabilisation le plus couramment utilisé pour la coloration immunofluorescente. Ce détergent dissout efficacement les membranes cellulaires sans perturber les interactions protéine-protéine (Figure 1). Le triton est généralement utilisé à des concentrations allant de 0,1 à 1 % pour la perméabilisation. Nous utilisons généralement du Triton X-100 ou du NP-40 à 0,1% dans du PBS à température ambiante pendant 10 minutes. Outre la perméabilisation de la membrane cellulaire, ces détergents dissoudront partiellement la membrane nucléaire, ce qui les rend adaptés à la coloration de l'antigène nucléaire.

Figure 1. Accessibilité des anticorps avec cellules non perméabilisées et Digitonine ou Triton X-100 perméabilisées. Les anticorps ne peuvent accéder qu'à l'extérieur des cellules non perméabilisées fixées par des aldéhydes, tandis que des agents doux tels que la digitonine perméabilisent la membrane plasmique, permettant l'accès à l'intérieur du cytoplasme, mais pas aux organites liés à la membrane intérieure tels que le noyau des mitochondries. Des détergents non ioniques plus puissants, tels que le Triton X-100, perméabilisent à la fois la membrane plasmique et les membranes intérieures, permettant un accès complet tout en préservant la structure cellulaire.

Le SDS est un détergent anionique couramment utilisé pour dénaturer les protéines et leur fournir une charge négative importante pour l'électrophorèse. It is useful as a permeabilizing agent to induce slight denaturation of fixed cells in order to reveal epitopes which may normally be masked from an antibody. It may extract small, poorly cross-linked proteins from fixed specimens, and should not be used on samples fixed by precipitation (e.g. methanol).

When using antibodies to stain cellular objects in specimens, it is necessary to &ldquoblock&rdquo the sample in order to reduce non-specific binding. Non-specific binding may occur for several reasons: unreacted fixative aldehydes may crosslink antibodies to inappropriate structures structures within the samples may &lsquotrap&rsquo antibodies or, if using polyclonal antibodies, low affinity IgG molecules may bind to inappropriate structures. These potential issues may be prevented by treating the specimens with a protein solution that will compete for non-specific binding sites prior to staining with antibodies. Commonly used blocking agents are bovine serum albumin (BSA), casein (or a solution of non-fat dry milk), gelatin, or normal serum obtained from the species of animal in which the secondary antibodies are made. Avoid using serum of the same species as the primary antibodies. Typically, the protein solutions are used at concentrations of 1 to 10% in buffer and the samples are treated after permeabilization for 10 to 30 minutes. It is also advisable to include a small amount of detergent (if the sample is to be permeabilized) to compete for hydrophobic interactions with the antibodies. In this case, low (around 0.1%) concentrations of Triton X-100 should be used, for example 3% BSA in PBS with 0.1% Triton X-100 or 5% fetal calf serum (FBS) in PBS with 0.1% Triton X-100 for 30 minutes at room temperature works well.

Antibodies for immunofluorescence are divided into two categories: primary and secondary antibodies. These two groups are classified based on whether they bind to antigens or proteins directly or target another (primary) antibody that, in turn, is bound to an antigen or protein. Primary antibodies can be labeled or unlabeled. Primary antibodies that have been covalently linked with a fluorescent moiety will have specificity and bind directly to the target as well as the tag necessary for imaging. This is known as direct immunofluorescence (Figure 2). By coupling the primary antibody with a fluorophore, direct immunofluorescence is faster than the indirect version because time-consuming washing and incubation steps are omitted. Thus, direct immunofluorescence is easier to handle and therefore suitable for the rapid analysis of samples in standardized experiments, for example in clinical practice. Unlabeled primary antibodies on the other hand will bind to the target but require a secondary antibody that will specifically recognize the antibody. This situation is called indirect immunofluorescence.

Figure 2. Directly labeled antibody fluorescence on unpermeabilized SK-BR-3 Cells. Anti-EGFR antibody covalently labeled with FITC and incubated with unpermeabilized SK-BR-3 cells counter stained with Hoechst 33342. Cells were imaged with a Cytation&trade 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader (BioTek Instruments). Green fluorescence is located only on outer cell periphery as EGFR is a plasma membrane receptor.

Primary antibody binding to the specific antigen involves the Fab domain of the antibody, which in turn leaves the Fc domain exposed (Figure 3). The secondary antibody&rsquos Fab has been developed to recognize the Fc domain of the primary antibody. Since antibody&rsquos Fc domain is constant within the same animal class, only one type of secondary antibody is required to bind to many types of primary antibodies. This reduces the cost by labeling only one type of secondary antibody, rather than labeling various types of primary antibodies.


Figure 3. Structure of IgG Protein.

Primary antibodies can be either polyclonal or monoclonal in nature. Polyclonal antibodies are a heterogeneous mixture of antibodies directed against various epitopes of the same antigen. As they are generated from different B-cell clones they are immunochemically dissimilar and can have different specificities and affinities. While a number of different animal species, including goat, swine, guinea pig and cow, are routinely used to produce polyclonal antibodies, rabbits are most frequently used. Monoclonal antibodies are a homogeneous population of immunoglobulin directed against a single epitope. These antibodies are generated from a single B-cell clone isolated from a single animal and as such have the same Fab structure. While the vast majority of monoclonal antibodies are produced from mice, increasingly, they are being produced from rabbits as well.

Binding affinity and the resultant titer towards its antigen is different for every antibody. The use of monoclonal antibodies removes much of the variability, but batch to batch concentrations can vary even with the same monoclonal due to aggregation or denaturation. As a result the antibody concentration required and the incubation time used can vary lot to lot. Optimal assay development requires that the primary antibody be titrated for best results. Too little antibody results in an artificially low signal, due to a lack of target saturation. Too much antibody can result in nonspecific binding despite have used a blocking step. Because of the reagent cost, it is paramount that only as much antibody as required be used. However, for a one-off experiment, or a small series of experiments the time, effort and expense required for a full antibody titration is often not warranted. Typically, a dilution of 1:1000 for the commercially available monoclonal antibodies is used. Because of the low amounts of protein in the sample, it is best to use a buffer containing BSA to dilute the antibody, for example, PBS 0.1% Triton X-100 supplemented with 30 mg/mL of BSA. This can be made in bulk, filter sterilized and aliquoted. Use only enough antibody dilution to cover the sample, - for a typical well in a 96-well microplate this is 20-25 &muL. Most of the commercially available antibodies have sufficient titer to bind high copy number targets in 30-60 minutes at room temperature. Results with low copy number targets often are improved by overnight incubation at 4 °C, and shaking can help as well. An incubation time of 60 minutes at room temperature works well for most experiments, but an overnight incubation can be used as a convenient end of the day stopping point for sample processing even with high target number epitopes.

Figure 4. Direct vs. Indirect Antibody Labeling.

A secondary antibody is required with indirect immunofluorescence, where the primary antibody provides no means of detection and works by binding to a primary antibody, which directly binds to the target antigen. The use of secondary antibodies to indirectly detect target antigens requires additional process steps but can also offer significant advantages over labeled primary antibodies. Secondary antibodies increase the sensitivity through the signal amplification that occurs as multiple secondary antibodies bind to a single primary antibody (Figure 4). In addition, a given secondary antibody can be used with any primary antibody of the same isotype and target species, making it a more versatile reagent than individually labeled primary antibodies. This flexibility is a significant advantage of indirect immunofluorescence. Because the vast majority of primary antibodies are produced in just a few host animal species and most are of the IgG class, it is economical to produce and supply ready-to-use secondary antibodies for many methods and detection systems. From a relatively small number of secondary antibodies, many options are available for purity level, specificity and label type for a given application. A dilution of 1:500 for some commercially available secondary antibodies (Figure 5). As with primary antibodies, the low amounts of protein in the reagent makes it imperative that a buffer containing BSA or other non-specific protein be used to dilute the antibody, for example PBS 0.1% Triton X-100 supplemented with 30 mg/mL of BSA can be used for the dilution of secondary antibodies.

Figure 5. Fixed and three color fixed and stained HeLa cells. Mitochondria identified by a mouse anti-mitofilin primary antibody followed with a Rabbit antimouse IgG monoclonal antibody labeled with Texas Red (Red). Nuclei and actin filaments are identified by DAPI (blue) and AlexaFluor®-488-phalloidin (green) counterstaining respectively. Scale bar indicates 30 &mum.

It is important that the secondary antibody employed in the experiment is raised against the host species used to generate the primary antibody. Polyclonal primary antibodies are usually raised in rabbit, goat, sheep or donkey and are generally IgG isotypes. The secondary antibody therefore, will typically be an anti-IgG antibody. Monoclonal primary antibodies are commonly raised in mouse, rabbit and rat. For example, if the primary monoclonal antibody is a mouse IgG, you will need an anti-mouse IgG.

The use of pre-absorbed secondary antibodies reduces the risk of cross reactivity with other antibodies and should be used with multi-color experiments when several primary antibodies and their corresponding secondary antibodies are used simultaneously.

Pre-adsorption is an additional processing step where the secondary antibodies are passed through a column matrix containing immobilized serum proteins from potentially cross reactive agents. For example, only antibodies specific to rabbit IgG will pass through a pre-absorbing column containing immobilized mouse, human and horse IgG whereas, antibodies cross reacting will bind and stay adsorbed to the matrix.

Between each process step, there is usually a wash step to remove unbound excess reagents. The buffer used for these steps should take into account the buffer used for the process steps. As described previously, it is best to use a buffer system that is isotonic to preserve cellular structure and close to physiological pH. Washing, as the name implies is a series of aspiration and buffer reagent additions performed in sequence. Depending on the volume used, 2-3 cycles is sufficient for washing, with the final step being an aspiration to remove the fluid prior to the addition of the next processing reagent. PBS is commonly used, and a surfactant such as 0.1% Triton X-100 or 0.05% Tween&trade 20 can also be added. Note that it is important to make these steps in a timely fashion to prevent the sample from drying out.

Counter Stains

Counter stains are used for two different purposes reduction of background fluorescence or the identification of cellular organelles. Blue dyes, such as Evans blue can be used to reduce non-specific background fluorescence with fluorescein labeled samples. Because these dyes can mask weakly fluorescent desired binding they are not recommended for routine use. More importantly is the use of counter stains to identify cellular organelles and provide information regarding signal localization.

Figure 6. NIH 3T3 cell nuclei stained with DAPI.

The nucleus is the predominately targeted cellular organelle and can be identified through the use of stains that bind DNA (Figure 6). DAPI (diamidino-2-phenylindole) is a nuclear counter stain useful with multicolor fluorescent experiments. Its blue fluorescence differs significantly from fluorescein (green) or Texas red fluorescent probes used for other structures. It fluoresces brightly upon selectively binding to the minor groove of double stranded DNA. Its selectivity for DNA allows efficient staining of nuclei with little background from the cytoplasm. Other nuclear stains include Hoechst 33342, which is cell permanent and can be used with live as well as fixed cells, and propidium iodide, long used as a nuclear marker for flow cytometry which fluoresces in the red range. Far red dyes such as Draq5 can also be used a nuclear counter stain.

Fluorescently labeled phalloidin can be used as a counter stain for actin (Figure 7). This cyclic peptide isolated from the death cap mushroom (Amanita phalloides) has a very high affinity towards F-actin filaments. Because of its relatively small size and chemical stability, fluorescent derivatives are enormously useful in identifying actin filaments with high density labeling of the cytoskeleton which provides a means for the assessment of cellular morphology. As they are commercially available in a multitude of different colors they can be multiplexed with several other cellular probes.

Fluorescently tagged wheat germ agglutinin (WGA) can be used to stain for cell membranes. WGA is a carbohydratebinding protein that selectively recognizes sialic acid and N-acetylglucosaminyl sugar residues which are predominantly found on plasma membrane proteins.

Unlike antibodies, counter stains usually do not have cross reactivity with one another and often can be combined into a single process step - the only limitation would be buffer compatibility. For example, DAPI (5-10 &mug/mL) and phalloidin (20 nM) counter stains can be combined in a mixture of PBS 0.1% Triton X-100 from concentrated stock solution, freshly made on the day of the experiment. A 10-minute incubation at room temperature is sufficient to adequately stain fixed tissue culture cells.

Figure 7. Fixed NIH 3T3 cells expressing GFP counterstained with DAPI and Texas Red labeled phalloidin. NIH3T3 cells cultured in 96-well plates were formaldehyde fixed then counter stained with DAPI and Texas red labeled phalloidin. Cells were imaged with a Cytation&trade 3 using configured with DAPI, GFP and Texas Red light cubes.

Fixation and staining of slides or microplates is a multistep process with a number of reagent additions, wash steps and incubations (Figure 8). The processing of slides or coverslips is generally a low throughput operation and can usually be accomplished with a manual operation. Both fixtures can be treated using small dishes or in the case of slides dedicated Coplin jars can be used to store reagents or as vessels for wash media. Microplates, particularly 96- and 384- well plates with cells are much more amenable to automation. Because microplates have standardized well size, spacing and footprint, automation can be used to provide reagent addition and washing (aspiration and dispense). The small size of coverslips also allows them to be placed in the wells of low-density plates (6- and 12-well) for processing prior to adhering them to a slide.

Figure 8. Automated Workflow for Cell Seeding, Fixation, Permeabilization and Three Color Staining Process. An EL406&trade Combination Washer Dispenser (BioTek Instruments) was used to carry out the process steps for cell fixation, permeabilization and staining with three colors (DAPI, Alexa-Fluor® 488 phalloidin stain, and Texas red labeled secondary antibody) are indicated in red.

Storage of fixed and stained specimens can vary depending on the sample. Specimens on slides (or coverslips) can be treated with a mounting medium and sealed for long term storage. Mounting medium helps preserve the sample and raises the refractive index, which will improve performance with oil objectives. Mounting medium often has added agents to scavenge free radicals and reduce photobleaching. Prolong Gold (Life Technologies) and Fluoromount&ndashG (SouthernBiotech) are examples of commercially available mounting media. It is important to rinse the slide/coverslip in distilled water prior to sealing as the salt from the PBS wash will precipitate out as crystals as it dries. After adhering the coverslip to the slide, allow the slide to dry overnight prior to sealing. Seal the edges of each coverslip with regular transparent nail polish and allow drying for 3 minutes cells are now ready for imaging. Slides should be stored in a light tight container to prevent photobleaching. This will provide semi-permanent preparations that will last months if kept in the dark.

Microplates storage is more challenging. The small well size and well depth makes it almost impossible to seal the sample through the use of a coverslip. Microplates are better stored wet at 4 °C - PBS with 0.1% sodium azide can be used as a preservative. Plates are sealed with an adhesive plate seal and the plates wrapped in aluminum foil. While they will lose resolution over time, clear images can be obtained after one month in storage.

Commentaires finaux

There is no &ldquobest&rdquo procedure for immunostaining and counter staining fixed cells on slides or microplates. There are numerous methods to fix, permeabilize, and stain cells, each with strengths and weaknesses. Immunostaining intracellularly involves detecting small molecules on interior cell structures often using much larger molecules, such as antibodies. Structures need to be stabilized, while at the same time holes need to be opened in membranes large enough to allow antibodies access to the interior. Different antibodies have different affinities and will often recognize different epitopes on the same protein, while different fixative methods will expose or mask different epitopes within the cell. While there is no one-size-fit-all technique for immunostaining, there are a number of different techniques that can be tested in order to optimize results.


Résumé

Cancer is a complex disease caused by multiple types of interactions. To simplify and normalize the assessment of drug effects, spheroid microenvironments have been utilized. Research models that involve agent measurement with the examination of clonogenic survival by monitoring culture process with image analysis have been developed for spheroid-based screening. Meanwhile, computer simulations using various models have enabled better predictions for phenomena in cancer. However, user-based parameters that are specific to a researcher’s own experimental conditions must be inputted. In order to bridge the gap between experimental and simulated conditions, we have developed an in silico analysis method with virtual three-dimensional embodiment computed using the researcher’s own samples. The present work focused on HeLa spheroid growth in soft agar culture, with spheroids being modeled in silico based on time-lapse images capturing spheroid growth. The spheroids in silico were optimized by adjusting the growth curves to those obtained from time-lapse images of spheroids and were then assigned virtual inner proliferative activity by using generations assigned to each cellular particle. The ratio and distribution of the virtual inner proliferative activities were confirmed to be similar to the proliferation zone ratio and histochemical profiles of HeLa spheroids, which were also consistent with those identified in an earlier study. We validated that time-lapse images of HeLa spheroids provided virtual inner proliferative activity for spheroids in vitro. The present work has achieved the first step toward an in silico analysis method using computational simulation based on a researcher’s own samples, helping to bridge the gap between experiment and simulation.

Citation: Minamikawa-Tachino R, Ogura K, Ito A, Nagayama K (2020) Time-lapse imaging of HeLa spheroids in soft agar culture provides virtual inner proliferative activity. PLoS ONE 15(4): e0231774. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0231774

Éditeur: Donald Gullberg, University of Bergen, NORWAY

A reçu: November 11, 2019 Accepté: March 31, 2020 Publié : April 17, 2020

Droits d'auteur: © 2020 Minamikawa-Tachino et al. Il s'agit d'un article en libre accès distribué selon les termes de la licence d'attribution Creative Commons, qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur tout support, à condition que l'auteur et la source d'origine soient crédités.

Data Availability: Toutes les données pertinentes se trouvent dans le manuscrit et ses fichiers d'informations à l'appui.

Le financement: This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number JP24650156.

Intérêts concurrents : The authors have no conflicts of interests to declare.


Introduction

While current in vitro models do not fully recapitulate all aspects of the in vivo microenvironment, there is a strong body of literature indicating the physiologically relevant cues that guide tissue function it is believed inclusion of such cues in an in vitro model will improve its ability to predict drug effects on humans. For instance, fluid flow in vivo influences tissue function by providing perfusion at lower flow rates 20–23 and by additionally generating a flow-induced shear stress (FSS) 24–27 at higher flow rates, highlighting the importance of including the capability to generate a range of flow rates 9 in OOC models. In addition, the spatial organization and chemical environment of cells influence tissue function examples include heterotypic cell organization, 28 extra-cellular matrix (ECM) composition, 29 and spatial control of media composition and biochemical gradients to create distinct in vivo phenotypic zones. 30,31 Additionally, maintaining near physiologic concentrations of autocrine and paracrine signals requires a low media-to-cell ratio within in vitro culture systems. 32 OOCs that allow for integration of a diverse range of cell types, including those from various organs and with different qualification status, can increase the range of tissue model applications and cell sources. Incorporating these cues and features in an OOC enables selection of conditions to drive tissues toward physiologically accurate and, therefore, clinically predictive models.

The next generation of OOCs should improve upon standard in vitro models by integrating both new and established sensing modalities while maintaining compatibility with state-of-the-art data collection tools. Integrated sensors in OOCs can obtain real-time data over the course of an experiment 17,18,33–35 without disturbing the microenvironment. While large data sets can be generated in vitro via high-throughput screening tools such as high-content screening (HCS) and RNA sequencing (RNA-seq), current OOC systems only interrogate one or a few tissue culture conditions 32 in each experiment. We aimed to produce a next generation OOC system with on-line integrated sensing capabilities that maintains downstream compatibility with HCS and RNA-seq while enabling high-throughput interrogation of many tissue culture conditions simultaneously (or allows for a large number of replicates for a few culture conditions). Such a system will enable rapid parallel screening of many drug candidates and the generation of highly robust and complete data sets, including the ability to measure dynamic tissue behavior with previously inaccessible temporal resolution.

Here we present an advanced OOC platform technology that combines programmable flow control, integrated real-time sensors, and an ability to include heterotypic cell-type complexity within a high-throughput layout that readily interfaces with industry-standard infrastructure and state-of-the-art data collection tools. The platform comprises 96 individual OOC devices in one cell culture plate, up to 192 individual and actively-controlled micropumps contained within the plate lid, and 384 electrical contacts to make electrical measurements within each of the 96 devices. 36 Each OOC device contains two microchannels separated by a semi-permeable scaffold capable of supporting a range of cell types in mono- or co-culture to generate various tissue-relevant models. Fluid flow in each individual channel is controlled by a separate micropump with low fluid circuit dead volume to minimize dilution of cell-secreted factors. The platform employs optically clear thermoplastic materials chosen to minimize drug sorption and enable histological analysis using standard microscopy techniques. The format is compatible with existing life science tools, including liquid and plate handling tools and assays, such as multiplex immunoassays, HCS and RNA-seq. In this manuscript, we demonstrate the versatility and broad capabilities of the platform by presenting a series of proof-of-concept experiments comprised of data from human kidney, vascular, liver, and intestine tissue models with relevant physiological readouts.

The models demonstrate distinct organ/tissue functionality, which is enabled by the novel features of the platform technology. Specifically, we demonstrate (a) two physiologically relevant flow regimes: perfusion flow that enhances hepatic tissue function and high-shear stress flow that aligns endothelial monolayers (b) integrated electrical sensors that quantify barrier function of primary gut colon tissue in real-time (c) optical access to the tissues that enables direct quantification of renal active transport and oxygen consumption and (d) a format compatible with HCS and RNA-seq. These features, combined with the throughput capabilities, result in a platform that can both generate and interrogate microscale tissues and is expected to increase predictive accuracy of in vitro drug screening.


COMMENTAIRE

Informations d'arrière-plan

Mitophagy is a type of selective autophagy event that specifically removes damaged and dysfunctional mitochondria caused by accumulation of mitochondrial DNA (mtDNA) mutations or misfolded proteins, loss of mitochondrial membrane potential, and production of reactive oxygen species (ROS). Seminal work by Narendra et al. ( 2010 ) discovered that PINK1 kinase, which is normally degraded via the N-end rule under normal conditions (Yamano & Youle, 2013 ), is stabilized and activated on damaged mitochondria. PINK1 activation triggers phosphorylation of both ubiquitin and Parkin, a E3-ligase, which promotes Parkin to translocate to damaged mitochondria and ubiquitinate many mitochondrial outer membrane proteins. Ubiquitin chains on mitochondrial proteins are bound by autophagy adaptors such as NDP52, OPTN, and TAX1BP1 to mitochondria, which in turn bind and recruit the general autophagy machinery to mitochondria to initiate the mitophagy.

Initially, the mitochondrial outer membrane protein Tom20 was used to monitor the clearance of mitochondria by confocal imaging or Western blot (Narendra, Tanaka, Suen, & Youle, 2008 ). Later on, it was revealed that many mitochondrial outer membrane proteins that are ubiquitinated by Parkin undergo ubiquitin/proteasome system (UPS)-mediated degradation rather than autophagic degradation (Chan et al., 2011 Sarraf et al., 2013 Tanaka et al., 2010 ), making them unsuitable for monitoring mitophagy.

One of the widely used mitophagy reporters, mito-QC, which mimics the GFP-RFP-LC3 for autophagy flux, was created by fusing mCherry-GFP in tandem with the C-terminal tail (101-152) of the outer membrane protein Fis1 (Allen, Toth, James, & Ganley, 2013 ). Under normal conditions, mito-QC fluoresces both red and green to appear yellow together. Upon induction of mitophagy, mitochondria are engulfed by autophagsosomes, which then fuse with lysosomes to form autolysosomes. In this acidic environment, the GFP signal gets quenched but mCherry signal remains stable to make mito-QC appear to be red-only. The percentage of red-only mito-QC signal can be used to measure mitophagy. As mentioned above, mito-QC itself can be degraded at least partially via the UPS and may result in an underestimation of the mitophagy events. In addition, factors involved in the UPS pathway may inadvertently influence mito-QC readings.

mKeima belongs to a class of fluorescent proteins with large Stokes shifts (the difference in wavelength between the peak excitation and emission spectra). It was originally identified from the stony coral Montipora sp. with degenerate primers and semi-random mutagenesis (Kogure et al., 2006 ). The first identified clone was a violet-colored GFP-like chromoprotein that did not fluoresce. However, a red fluorescent protein was successfully created with five substitutions (H94N, N142S, N157D, K202R and F206S) and the addition of a valine residue at the second amino-acid position. Subsequently, four more mutations (S61F, I92T, F158Y, and S213A) were introduced to generate the Keima protein, a shogi (Japanese chess) piece that hops in the manner of the knight in chess, owing to the large Stokes shift. Keima shows a bimodal excitation spectrum peaking at 440 and 580 nm and emission spectrum peaking at 606 nm. This Keima is homotetrameric, which was further converted into a dimeric dKeima with introduction of V123T and V191I mutations. Additional mutations (L60Q, F61L, V79F, T92S, T123E, Y188R, and Y190E) led to the monomeric mKeima protein, which now shows maximal emission at 620 nm. The two excitation peaks somehow correspond to the neutral and acidic pH. Violot, Carpentier, Blanchoin, and Bourgeois ( 2009 ) used X-ray crystallography to discover that the large Stokes shift of mKeima is due to the reverse pH-dependence of chromophore protonation.

Katayama, Kogure, Mizushima, Yoshimori, and Miiyawaki ( 2011 ) first reported the use of mKeima and mito-mKeima for autophagy and mitophagy measurements. They showed that mKeima has a pKune value of 6.5 and excitation peak ratio (586/440) of more than 6. Unlike mito-QC, mito-mKeima can be used together with GFP/YFP tagged proteins. By measuring the proportion of the high ratio (550/438) signal area to the total mitochondria area as an index of mitophagy (IM) in 30 transfected cells, IM of 60% can be detected in MEF cells treated with CCCP + oligomycin. There is an obvious limitation with this imaging-based method as only 30 cells are examined. To improve the speed and sensitivity, we explored the possibility of using flow cytometry (FACS) to quantitatively and quickly measure mitophagy with mito-mKeima (Lazarou et al., 2015 ). We successfully detected as low as 5% mitophagy events when PINK1 was artificially tethered on mitochondria via chemically-induced dimerization, which is crucial to the newly proposed model: PINK1-generated phosphor-ubiquitin itself serves as the mitophagy signal and Parkin is a mere amplifier of this signal. By using FACS to detect mitophagy, over 50,000-100,000 events can be collected and analyzed, which increases the detection threshold of mitophagic events for better data representation.

Critical Parameters

For viral packaging, the most critical factor is the health and behavior of 293T cells, as transfection efficiency is rarely an issue for them. 293T cells must be split regularly, preferably at 1:5 ratio and with increased attention on how they attach and spread. Right after thawing, especially when seeded at a low density, 293T cells tend to form clumps.

We tried several different transfection reagents and did not observe any difference in virus titer when similar transfection efficiency was obtained. Occasionally, we encountered an issue of low virus titer and traced the problem back to the helper plasmids. Some of the helper plasmids have the potential to rearrange, causing small deletions, which can be detected by agarose gel electrophoresis even without digestion. We solved the problem by re-transforming the correct plasmids in NEB or Thermofisher's Stable competent cells. Therefore, it is very important to retain original helper plasmid stocks either in bacteria or in solution as backup for future amplification.

In terms of transduction or infection, forgetting to add polybrene is the most likely cause of low transduction rate, followed closely by over-seeding too many cells for infection. Freeze-thaw cycles of viruses can lead to 5-fold reduction in virus titer. We found virus can be stored for at least 1 month at 4°C without losing significant titer. Otherwise, virus should be divided into aliquots and kept for long-term storage at −80°C. When thawing the virus, the frozen virus should be incubated for a few minutes at 37°C and used quickly. Furthermore, the addition of too much virus with a high titer could be toxic. Sometimes, culture medium for target cells differ from medium for 293T cells. In this case, virus volume should be at least less than half of the final medium volume for infection.

For mitophagy assays, the most crucial element is to have proper controls. With FACS analysis, DAPI, or DRAQ7 (far-red) should be used to gate out the dead cells. When gating either the mKeima or YFP channel, compensation might be needed to avoid interference between each channel. This is often the issue when either mKeima or YFP signal is too high. Reducing laser power could help to limit the interference but sometimes still does not solve the problem. Therefore, it is always better to do a pilot experiment to find out the optimal virus titer for infection. It is better to begin with a weak signal, as re-infection can be done to enhance the signal. For the final gating of mKeima ratio (pH4, 561 nm/pH7 488 nm), always re-normalize the untreated control of each sample set to around 1%. This is because different cell lines may have different basal mitophagy level to begin with. In addition, mKeima and YFP intensity are not identical in different cell lines even after sorting to obtain similar intensity level. Therefore, applying the same mKeima ratio gating to different cell lines is not practical and also not advised.

Dépannage

For possible problems and their solutions, see Table 1.

Problème Solution
Low virus titer Make sure 293T cells never grow confluent, split when they reach 80%-90% confluence. Sometimes, splitting cells several times after thawing may help, too.
Seed cells so that they are 70%-90% confluent the day before transfection. Make sure cells adhere well and spread nicely. Do not attempt transfection if cells are clumpy.
293T cells do not attach well, so be gentle when moving plates in and out the incubator. After transfection mix is added to the cells, swirl the plates very gently a couple of times to mix so that cells do not get dispersed and come off the plates.
Check the size of helper plasmids. Some helper plasmids tend to undergo recombination and small deletions might occur, which can be detected on agarose gels. Transform the helper plasmids in NEB's Stable cells (NEB, cat. no. C3040I) or similar competent cells defective in recombination for mini or midi prep.
Low transduction rate Seed cells so that they are less than 20% confluent on the day of infection. 5%-10% confluent could be used if virus titer is not high.
Make sure polybrene is added during infection. 4-8 µg/ml works well for most cell lines. Some cell lines are sensitive and lower polybrene concentration has to be used if cells die quickly after infection.
Use more virus.
mito-mKeima or YFP-Parkin signal is not even Retrovirus seems to produce more even gene expression than lentivirus. If an even signal is needed, FACS sort the cells
Mitophagy in wild type cells is not robust Different cell lines may require different concentrations of oligomycin, antimycin A for robust mitophagy response. Treatment time can also be a factor. Make sure fresh chemicals are used since they may lose activity over time or not properly stored.
Parkin expression is too low. While robust mitophagy does not require maximal Parkin expression, detectable Parkin expression level is indeed needed. It is ideal to use YFP-Parkin so that Parkin expression level can be readily monitored. Untagged or HA-Parkin can be used when YFP-Parkin is not an option.

Understanding Results

Anticipated results are shown in Figure 5. In untreated wild-type HeLa cells, mitophagy (shown as the upper box) is gated to around 1%. With OAQ treatment for 24 hr, 86.1% mitophagy is detected. In WIPI2 KO cells, mitophagy is gated to around 1% in the untreated cells, only 1.68% mitophagy is observed after 24 hr of OAQ treatment, indicating that WIPI2 KO completely blocks Parkin-mediated mitophagy. In ATG16L1 KO cells, 21.5% mitophagy is seen with OAQ treatment for 24 hr, comparing to 1.18% in untreated cells, suggesting that ATG16L1 strongly inhibits Parkin-mediated mitophagy. Different cell lines can have different cell size and mKeima signal, which reflects the different distribution patterns of cell population. When the triangle box is drawn to delineate the upper portion (mitophagy), make sure the diagonal line is parallel to the red/orange area (peak of the cell population) in the untreated control cells. See the video for details (Video 2).

Time Considerations

It takes 3-4 days to package virus from plating 293T cells for transfection to harvest virus on Day 2 and Day 3. For transduction/infection, 2-3 days are also required from seeding target cells to see optimal gene expression. For FACS analysis or confocal imaging, depending on the treatment time, 2-3 days should be planned.

Remerciements

I thank all members of Youle lab for critical comments, Dragan Maric for guidance on FACS analysis from NINDS Flow Cytometry Core Facilities. This work was supported by the Intramural Research Program of the NINDS, NIH.

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