Informations

Faible nombre de copies de plasmides


J'ai un plasmide avec l'origine P15A qui a apparemment un faible nombre de copies (voir ici). Cela expliquerait pourquoi mes rendements de purification pour la digestion ultérieure sont faibles (le gel montre le plasmide après digestion et nettoyage avec 5 µl chargés). Je cultive actuellement mon plasmide contenant E. coli dans 5 ml pendant la nuit avant de faire une miniprep. Ma question est de savoir si je dois faire pousser mes cultures de 5 ml plus longtemps (2 jours) ou simplement les abandonner et en faire une plus grande quantité pour Midiprep.

Je suis également curieux de savoir ce qui contrôle réellement le nombre de copies de plasmide à l'intérieur des cellules. Une explication de la régulation du nombre de copies de plasmide serait très appréciée.


  • Je suis sûr que vous l'avez fait ; juste une note aux autres : faites un criblage PCR pour vérifier que le plasmide est là.
  • Pour les minipreps, vous n'avez généralement pas besoin d'une culture de démarrage.
  • Si vous avez criblé vos clones et que vous souhaitez maintenant simplement amplifier et conserver le plasmide à des fins de clonage, optez pour un maxiprep avec des cultures de 200 à 400 ml.
  • Ne surchargez pas les cellules, votre extraction devient difficile et vous obtiendriez des rendements encore pires. Il suffit de mettre en place une énorme culture et de regrouper les cellules avant l'extraction. Toujours semer et récolter les cellules qui sont en phase de croissance exponentielle.
  • Si vous avez besoin de cribler le plasmide pour des clones ou quelque chose, faites une PCR de colonie, gardez la colonie inoculée dans une petite culture (faites un stock de glycérol temporaire si votre criblage prend du temps). Si l'écran est positif alors incoulez le culture de départ pour la culture maxiprep/gigaprep avec ce stock.

Amélioration du rendement des plasmides E. coli à faible nombre de copies par l'optimisation des milieux de croissance cellulaire

Les minipréparations plasmidiques sont couramment utilisées pour purifier les ADN plasmidiques circulaires à partir de petites cultures de cellules bactériennes. Les plasmides à nombre de copies élevé produisent des rendements élevés d'ADN en utilisant cette procédure. Cependant, les préparations de plasmides à faible copie et à copie unique entraînent un faible titre d'ADN souhaité et sont parfois accompagnées d'ADN chromosomique indésirable. Des travaux antérieurs effectués dans ce laboratoire ont démontré que l'utilisation de Terrific Broth (TB) pour cultiver des cellules E. coli améliorait le rendement en ADN plasmidique par rapport au bouillon Lysogeny (LB) et à plusieurs autres bouillons couramment utilisés. La tuberculose contient du glycérol et du tampon phosphate de potassium qui ne sont pas présents dans la LB, et contient également cinq fois plus d'extrait de levure. Étonnamment, les rendements de plasmide plus élevés avec la TB n'étaient pas dus à la présence de glycérol ou de tampon. Les principaux objectifs de l'étude actuelle sont de déterminer le ou les composants précis de la tuberculose qui en font un bouillon supérieur et de développer de nouvelles méthodes pour améliorer les rendements des plasmides à faible copie et à copie unique isolés à partir de minipreps. Les premières expériences ont tenté de déterminer si l'augmentation de la quantité d'extrait de levure dans la LB pouvait la rendre équivalente ou supérieure à la TB. Les préparations de plasmides ont été effectuées avec des concentrations supplémentaires croissantes d'extrait de levure dans le bouillon LB (LBX)e, et comparées aux rendements des préparations effectuées avec les bouillons LB et TB traditionnels. Les densités cellulaires ont été surveillées à l'aide de mesures de DO550 sur des gels d'agarose et la fluorométrie d'ADN a été utilisée pour déterminer l'efficacité des protocoles de préparation à l'aide de bouillons LBX. Il a été constaté que des quantités plus élevées d'extrait de levure augmentaient à la fois les densités cellulaires et les rendements en ADN d'une manière dose-dépendante. Les résultats indiquent que la supériorité de la TB est due à sa teneur en extrait de levure et non aux ingrédients supplémentaires qui distinguent le bouillon de la LB. Des expériences supplémentaires sont en cours pour essayer d'améliorer davantage les rendements en ADN et pour déterminer si l'utilisation de ce bouillon pendant la transformation de l'ADN dans des cellules d'E. coli pourrait également générer des rendements plus élevés.

Reconnaissance du bailleur de fonds : NIH, Fondation Robert A. Welch, Alliance Houston-Louis Stokes pour les participants des minorités


Amélioration des rendements d'ADN plasmidiques à faible nombre de copies et à nombre de copies uniques à partir de cellules d'Escherichia coli

De nombreux plasmides utilisés pour le clonage de gènes et l'expression de protéines hétérologues dans les cellules d'Escherichia coli sont des plasmides à faible nombre de copies ou à un seul nombre de copies. L'extraction de ces types de plasmides à partir de petites cultures cellulaires bactériennes produit de faibles rendements en ADN. Dans cette étude, nous avons quantifié les rendements d'ADN plasmidiques à faible nombre de copies et de copies uniques après croissance de cellules dans quatre bouillons largement utilisés (SB, SOC, TB et 2xYT) et comparé les résultats à ceux obtenus avec LB, l'E. milieu de croissance de cellules coli. La TB (bouillon formidable) a généré systématiquement la plus grande quantité d'ADN plasmidique, en accord avec sa capacité à produire des titres cellulaires plus élevés. La supériorité de la TB était principalement due à ses niveaux élevés d'extrait de levure (24g/L) et était indépendante du glycérol, un composant unique de ce bouillon. Fait intéressant, la simple préparation de LB avec des niveaux tout aussi élevés d'extrait de levure (bouillon LB24) a donné des rendements en plasmides équivalents à ceux de la TB. En revanche, l'augmentation de la concentration d'ampicilline pour améliorer la rétention du plasmide n'a pas amélioré la récupération de l'ADN plasmidique. Ces expériences démontrent que les rendements d'ADN plasmidiques à nombre de copies faible et unique à partir de minipreps peuvent être fortement améliorés en utilisant des supports simples et peu coûteux.

Mots clés: Numéro de copie Purification de l'ADN LB Miniprep Plasmid TB.


Le problème de partitionnement

L'incompatibilité plasmidique se produit également en raison de la partition des plasmides (Schumacher, 2012). Ce concept est un peu plus complexe que la simple compétition pour les facteurs de contrôle de la réplication et a tendance à être plus préoccupant avec les plasmides à faible nombre de copies, bien que le problème de partitionnement se produise dans les plasmides à nombre élevé de copies (Diaz et al., 2015). Les plasmides contiennent un système pour se diviser en chaque cellule fille pendant la division cellulaire. Ils ne comptent pas simplement sur le hasard (ou la diffusion aléatoire) pour que cela se produise.

Il existe plusieurs versions différentes du système de partitionnement du plasmide dans les bactéries, mais il se compose généralement d'une région de type centromère sur le plasmide, d'une protéine de liaison à la région de type centromère (la CBP) et d'une NTPase de partition (Schumacher, 2012). Au cours de la division cellulaire, les CBP se lient à la région de type centromère sur chaque plasmide et associent les plasmides (semblables aux chromatides sœurs se réunissant dans les cellules eucaryotes). La NTPase de partition est recrutée et « fait marcher » chaque plasmide vers une cellule fille distincte. Lorsque les plasmides sont compatibles, différents CBP se lient à chaque type de plasmide et différentes NTPases séparent les paires de plasmides dans les nouvelles cellules filles.

Pour les plasmides à nombre élevé de copies, l'incompatibilité due au partitionnement est similaire à l'incompatibilité due au fait d'avoir la même machinerie de réplication. Les plasmides à copie élevée avec la même région de liaison de type centromère rivalisent pour les mêmes CBP et NTPase pour partitionner correctement les plasmides dans chaque cellule fille. Lorsqu'il n'y a pas assez de CBP et de NTPase pour tout le monde, les plasmides sont positionnés de manière aléatoire, ce qui entraîne une perte de plasmide (Diaz et al., 2015).

Figure 2 : Le problème de partitionnement.

Pour les plasmides à faible nombre de copies, la théorie principale de l'incompatibilité des plasmides est due à un problème d'identification : les CBP dans la cellule ne peuvent pas faire la différence entre les plasmides s'ils ont la même région de type centromère, et les NTPases finissent par "marcher" le mêmes plasmides à une cellule fille, au lieu de partitionner chaque type de plasmide dans des cellules filles distinctes (Figure 2) (Ebersbach et al., 2005). Cependant, des études plus récentes suggèrent que la réplication tardive qui se produit pour certains types de plasmides à faible nombre de copies au cours de la division cellulaire ne laisse tout simplement pas suffisamment de temps pour qu'un partitionnement correct se produise (Diaz et al., 2015).

Il convient également de noter que les plasmides peuvent être symétriquement incompatibles, ce qui signifie que les deux plasmides sont perdus de la cellule avec la même probabilité, ou asymétrique, où un plasmide est perdu de la cellule à un taux plus élevé que le plasmide corésident. La perte asymétrique de plasmide se produit pour plusieurs raisons, y compris un plasmide bloquant la réplication d'un autre et un plasmide supplantant l'autre plasmide pour la machinerie de réplication ou de partition (Novick, 1987). Dans les cas où un plasmide l'emporte sur l'autre, généralement un plasmide plus petit et à copie plus élevée peut titrer plus efficacement les machines de réplication ou de partitionnement loin d'un plasmide plus grand et à faible copie et le plasmide plus grand et à faible copie est plus susceptible d'être perdu avec le temps.


2. Quand le nombre de copies élevé est-il bon ?

  • Expression des protéines : Bien qu'il ne semble pas y avoir d'avantage significatif à utiliser des plasmides à plus grand nombre de copies par rapport aux vecteurs basés sur pBR322 en termes de rendements de production de protéines, un plasmide à nombre élevé de copies pourrait être votre première escale si vous rencontrez de faibles rendements en protéines. Gardez à l'esprit qu'un nombre de copies très élevé peut entraîner une agrégation des protéines et une modification post-traductionnelle déficiente, probablement parce que la charge métabolique est trop élevée.
  • Clonage: L'utilisation d'un plasmide à copie élevée se traduira généralement par de meilleurs rendements des préparations de plasmides.

Quand le nombre de copies inférieur est-il bon ?

  • Expression d'un produit toxique : Supposons que vous souhaitiez étudier une protéine fongique pour ses propriétés antibactériennes et que vous souhaitiez l'exprimer dans des bactéries. Une faible copie pourrait être préférable pour minimiser les effets toxiques et éviter de tuer vos cultures bactériennes !
  • Études de mutants : Vous avez muté votre enzyme d'intérêt. Vous voulez maintenant comparer son activité à l'enzyme de type sauvage dans un contexte physiologique (c'est-à-dire la transformer en cellules hôtes natives). Pour augmenter les chances de mesures physiologiquement pertinentes et/ou pour évaluer in vivo phénotypes, l'expression de bas niveau à partir d'une seule copie est généralement une meilleure option. Les protéines surexprimées peuvent générer des phénotypes artificiels, de fausses interactions protéine-protéine et des problèmes structurels au sein de la protéine elle-même, conduisant à des résultats confus et peu fiables. (Nous savons tous que les résultats peuvent être assez déroutants à eux seuls sans compliquer davantage les choses !)

Construction de plasmides avec des nombres de copies accordables dans Saccharomyces cerevisiae et leurs applications dans l'optimisation des voies et l'intégration du génome multiplex

Les plasmides à faible copie basés sur CEN/ARS et 2 plasmides à copie élevée basés sur μ ont été largement utilisés à la fois pour des études fondamentales et des applications pratiques dans Saccharomyces cerevisiae. Cependant, le nombre de copies relativement faible et la plage dynamique étroite limitent leurs applications dans de nombreux cas. Dans cette étude, le niveau d'expression des protéines marqueurs de sélection a été conçu pour augmenter le nombre de copies de plasmide. Une série de plasmides avec des nombres de copies augmentés par étapes ont été construits. Le nombre de copies des plasmides avec des marqueurs dominants modifiés (5 à 100 copies par cellule) a montré une corrélation positive avec la concentration d'antibiotiques ajoutés au milieu de croissance. Sur la base de cette découverte, nous avons développé une stratégie simple mais très efficace, nommée Pathway Optimization by Tuning Antibiotic Concentrations (POTAC) pour équilibrer rapidement le flux des voies multigéniques au niveau de l'ADN dans S. cerevisiae. Comme preuve de concept, POTAC a été utilisé pour optimiser le lycopène et m-voies de biosynthèse du butanol, augmentant la production de lycopène et m-butanol par 10 et 100 fois, respectivement. De plus, l'intégration du génome multiplex avec des nombres de copies contrôlables a été tentée en combinant les marqueurs dominants conçus avec le système CRISPR/Cas9. Biotechnologie. Bioeng. 2016113 : 2462-2473. © 2016 Wiley Periodicals, Inc.

Des informations complémentaires peuvent être trouvées dans la version en ligne de cet article sur le site Web de l'éditeur.

Remarque : L'éditeur n'est pas responsable du contenu ou de la fonctionnalité des informations fournies par les auteurs. Toute question (autre que le contenu manquant) doit être adressée à l'auteur correspondant à l'article.


Caractéristiques des plasmides et des bactéries

Les plasmides sont des éléments d'ADN extrachromosomiques qui maintiennent une proportion importante du génome global et du gène nécessaire à l'expansion de la cellule. Les plasmides ont tendance à être circulaires, cependant, beaucoup sont linéaires, ils peuvent avoir une structure d'ADN superenroulée qui subit le processus de sous-enroulement des brins d'ADN afin de comprimer les molécules d'ADN. En outre, les plasmides peuvent également être classés en deux groupes : les plasmides à faible nombre de copies et les plasmides à nombre de sauvegarde élevé. Par exemple, le plasmide F, alias plasmide de fertilité, est un plasmide à faible nombre de copies, il se révèle sous la forme d'une seule copie dans une cellule, un partitionnement productif plutôt qu'une distribution aléatoire s'est produit dans le but de stabiliser le plasmide dans la section cellulaire. Après la section cellulaire du plasmide F, il a fini par obtenir deux copies pour chaque cycle. Col E1 est un plasmide à grande quantité de copies, dans le département cellulaire, circulation aléatoire entre deux cellules de la peau princesse qui se traduit par au moins une copie du plasmide contenue dans chaque cellule. Il est indiqué qu'un bon partitionnement au niveau de la division cellulaire est vital, car un mauvais partitionnement entraîne une ségrégation des plasmides.

Lorsque l'on compare le plasmide à l'ADN chromosomique, le plasmide est plus petit que l'ADN chromosomique, même le plus grand plasmide est également plus petit que l'ADN chromosomique. Ainsi, lors de l'exécution d'un gel d'agarose, le plasmide fonctionnera plus rapidement et se trouvera avant le chromosomique. Bien qu'il y ait une circonstance où le plasmide sera plus gros qu'un ADN chromosomique, c'est que l'ADN chromosomique est craqué en brefs fragments linéaires tandis que le plasmide est toujours resté sous la forme d'une molécule circulaire intacte. Les plasmides sont généralement de petites molécules qui ont quelques kilobases de longueur, cependant, de nombreux plasmides exclusivement du genre Pseudomonas ont plusieurs centaines de kilobases de long. ColE1 qui est le prototype d'E. coli, un petit plasmide dont la taille est de 6,4 kb est souvent utilisé comme vecteur de clonage pour contrôler en partie la réplication du plasmide. Comme indiqué ci-dessus, ColEl est un plasmide à nombre de copies plus élevé, de sorte que la cellule qui comprend ce plasmide est généralement de petite taille. Une quantité élevée de copies de plasmides produit de multiples copies dans la cellule, ce qui augmente la quantité d'énergie cellulaire requise pour la réplication et la manifestation des plasmides, entraînant une charge métabolique et altérant le fonctionnement cellulaire normal. Les conséquences de l'augmentation de la charge métabolique sont la perte de plasmide recombinant ou de gène recombinant d'un plasmide. ColE1 est non conjugatif, il n'est pas capable de se transférer d'une cellule à l'autre car le plasmide est petit.

Le plasmide F est un énorme plasmide d'environ 100 kb de long, donc la conjugaison a eu lieu, 30 kb sur 100 kb sont transférés de l'un à l'autre. Ce plasmide a neuf répétitions de vos séquences de 17 pb appelées interons auxquelles la protéine nécessaire à RepA se lie pour l'application commerciale.

Certaines caractéristiques bactériennes peuvent être déterminées par des plasmides tels que le niveau de résistance aux antibiotiques, les colicines et les bactériocines, les déterminants de la virulence, les plasmides dans les bactéries associées aux plantes et les activités métaboliques. Le degré de résistance aux antibiotiques est le moyen le plus pertinent pour caractériser les bactéries. Une bactérie devient immunisée contre les antibiotiques en adoptant un plasmide qui code avec un gène antibiotique d'une bactérie à une autre. D'un autre côté, les bactéries qui incluent la capacité de résister à certains médicaments tels que la solution d'acide nalidoc et la rifampcine sont le résultat d'une mutation du gène qui régit la protéine cible. Certaines bactéries sont non seulement résistantes à 1 antibiotique, mais ont un niveau de résistance à de nombreux antibiotiques en même temps, soit ont plusieurs plasmides indépendants dans une cellule ou possèdent un seul plasmide avec de nombreux déterminants de résistance. Par exemple, lorsque des bactéries qui ont des plasmides codés pour le gène kanr alias le niveau de gène de résistance à la kanamycine sont pipetées dans un milieu comprenant des antibiotiques à la kanamycine, car les bactéries résistent à la kanamycine, après une certaine période d'incubation, elles ont survécu et des colonies sont observées dans le milieu .

Les plasmides sont capables de produire des protéines de santé telles que les colicines et les bactériocines qui ont une action antimicrobienne contre les organismes soigneusement apparentés. ColE1 a pris un gène appelé colicinogène pour la synthèse des colicines E1 et un autre gène pour conférer une immunité à l'action des colicines afin de pouvoir protéger la cellule contre les ramifications mortelles de son produit. Les colicines rejetées dans l'environnement sont toxiques pour certaines souches d'Escherichia coli et peuvent réduire la concurrence d'autres souches d'E. coli.

Les plasmides peuvent porter des types de gènes dangereux qui sont essentiels à la virulence. Le plasmide d'E. coli possède un gène appelé gène de la toxine labile ou gène LT qui produit une toxine labile fortement liée à la toxine cholérique. Ainsi, les plasmides comprenant des gènes LT ont la capacité de ressembler au choléra et de déclencher une maladie. Un autre exemple est le plasmide de virulence de 70 kb des types Yersinia, en particulier Yersinia pestis qui est le micro-organisme responsable de la peste. Ces plasmides synthétisent des protéines et attaquent la réponse immunitaire des cellules afin de perturber la communication cellulaire ou d'éliminer les cellules de la peau de notre corps. En plus de cela, Bacillus anthracis, le micro-organisme qui cause la fièvre charbonneuse, possède deux grands plasmides importants connus sous le nom de pOX1 et pOX2. Le plasmide pOX1 code les gènes qui synthétisent la toxine du charbon et pOX2 code les gènes qui synthétisent la capsule pour protéger la bactérie de la réponse immunitaire. L'absence de pOX1 et le maintien de la pOX2 dans les cellules de la peau entraînent une perte de virulence, l'apparition de pOX1 et une pOX2 insuffisante telle que le stress de Sterne peut devenir une utilisation médicale en tant que vaccin vivant atténué pour les bovins. Les types de bacilles tels que Bacillus cereus et Bacillus thuringiensis n'ont pas de souches de charbon, donc ces bactéries qui ont des plasmides de virulence pOX1 et pOX2 ne peuvent que causer des problèmes de santé semblables à ceux du charbon, tels que des problèmes de santé légers d'origine alimentaire.

Un autre attribut des bactéries est la pathogénicité. La pathogénicité est associée au transfert d'un ADN plasmidique spécifique des plasmides Ti d'Agrobacterium tumefaciens dans les cellules végétales, ces plasmides Ti particuliers induisent une croissance de type tumoral appelée galle du collet chez quelques plantes. Les espèces du genre Rhizobium ont le partenariat de symbiose avec les cultures, elles fixent l'azote en une source d'azote réduit utilisable pour la fleur en formant des nodules sur les racines des légumineuses.

Une partie des activités métaboliques sont manipulées par des plasmides, par exemple, un plasmide qui a les gènes de fermentation du lactose dévoilés dans une tension non fermentante, aura la capacité de travailler avec le lactose. Le manque de plasmide de fermentation du lactose du genre Salmonella provoque l'attente de l'infection, en raison des besoins en plasmide de fermentation du lactose pour les agents responsables de Salmonella. Les plasmides ont non seulement les gènes pour la fermentation du lactose, mais aussi les gènes pour la fermentation d'autres sucres tels que le saccharose, l'hydrolyse de l'urée, la production d'hydrogène sulfuré, la capacité de dégrader des produits chimiques potentiellement nocifs et d'autres activités métaboliques. Le plasmide pWWO de Pseudomonas putida est un plasmide qui médie l'activité métabolique pour la dégradation des produits chimiques nocifs. Dans la voie supérieure, pWWO contient des enzymes qui convertissent les hydrocarbures cycliques tels que le toluène et le xylène en benzoate et la dégradation du benzoate en catéchol. catéchol. Les enzymes de la voie supérieure sont spécialisées, différents plasmides ont des spécificités différentes, l'autre dégradation à médiation plasmidique comprend le naphtalène, l'acidité dichlorophénoxyacétique, le camphre et les composés aromatiques chlorés tels que le 3-chlorobenzoate. La bioremédiation est une technique de gestion des traitements abusifs qui utilise des micro-organismes manifestement présents pour nettoyer les sites pollués. Les micro-organismes qui contiennent des hydrocarbures cycliques comme seule source de carbone sont utilisés pour dégrader les contaminants organiques et naturels dans le sol du jardin, les eaux souterraines, les boues et les solides.

Les plasmides ont tendance à être perdus par la mutation à un taux plus élevé d'une société, le plasmide en développement est normalement stable et meilleur à trouver pour isoler un stress spécifique tandis que le plasmide fabriqué artificiellement est généralement imprévisible et plus difficile à trouver. Les plasmides imprévisibles sont un problème coûteux et gênant dans l'utilisation professionnelle car ils pourraient être facilement perdus au cours du processus de création. L'instabilité des plasmides est clairement liée à l'intégrité des plasmides, aux taux de croissance différentiels et à la partition lors de la division cellulaire.

L'intégrité du plasmide fait référence à la conservation de la structure du plasmide, les plasmides présents ont des points chauds de recombinaison, ce qui permet au plasmide de devenir instable et de perdre des gènes. La recombinaison entre vos séquences répétées telles que les transposons ou les séquences d'insertion peut provoquer la délétion ou l'inversion de gènes. Pour être en mesure d'identifier la délétion d'un gène dans un plasmide, l'électrophorèse sur gel d'agarose peut être utilisée pour déterminer la taille du plasmide ou pipeter les plasmides dans un milieu d'antibiotiques spécifiques pour tester le degré de résistance des plasmides à quels antibiotiques. L'identification des plasmides qui passe par l'inversion est plus difficile que la délétion dans le plasmide car les plasmides ne changent pas de taille et restent peut-être les caractéristiques phénotypiques d'origine, il peut donc y avoir un moyen d'identifier l'existence d'une inversion, c'est par séquençage le plasmide.

Il existe une différence notable dans le taux de progression entre vos cellules qui produisent le plasmide de manière imprévisible ou qui a entraîné l'élimination du plasmide. Tout en utilisant un taux de progression élevé, le poids métabolique produit par la réplication des plasmides et la manifestation des gènes augmentera et le défi de l'instabilité est plus critique.

Une partition correcte est importante car l'échec de la partition entraînera l'augmentation du pourcentage de cellules cutanées sans plasmide ou l'éradication des cellules cutanées. Les plasmides à grande quantité de copies choisissent de posséder un partitionnement aléatoire tandis que les plasmides à faible nombre de sauvegardes choisissent de posséder un partitionnement actif, le nombre de copies de plasmide est manipulé en comptant le nombre de régions de réplication plutôt que le nombre de substances. Un plasmide à nombre de sauvegarde élevé aura des constructions multimères ou une recombinaison entre les monomères pour le processus de réplication car les multimères possèdent plus d'une origine de réplication. Il est indiqué que les plasmides sont car les multimères ne sont pas trop efficaces pour que chaque cellule fille puisse recevoir un duplicata du plasmide que sous forme de monomères, dimères ou trimères pendant le département cellulaire. Pour pouvoir stabiliser le plasmide, la recombinaison spécifique au site a été utilisée, par exemple, ColE1 a un site de niche de cer qui est un objectif pour l'action des protéines hôtes Web appelées XerC et XerD. Lorsqu'un dimère plasmidique qui possède deux copies de la collection cer doit être transformé en deux monomères, le XerC et le XerD déclencheront une recombinaison spécifique au site entre eux, les croise et casse les deux substances, les rejoint. La résolution d'image de plasmides dimères ou de plasmides multimères en plasmide monomère stabilise les plasmides dans la section cellulaire.

Le processus d'élimination post-ségrégation est le processus d'élimination de toutes les cellules qui ont perdu le plasmide dont l'élimination nécessite deux gènes plasmidiques, l'un spécifiant un agent toxique bien équilibré et à longue durée de vie et l'autre spécifiant un antidote instable pour éviter l'impact mortel action de la toxine. La toxine est généralement une protéine nécessaire tandis que l'antidote est un ARN antisens qui inhibe la traduction des protéines de la toxine. Par exemple, le plasmide F a un opéron qui code pour deux gènes, il y a CcdA qui sert d'antidote et CcdB qui fonctionne comme une toxine. Les protéines CcdB obstruent la réplication de l'ADN via l'interférence sur le superenroulement médié par l'ADN gyrase, car le CcdA neutralise la toxicité du CcB. Pour un autre exemple, le plasmide R1 implique deux gènes : hok et sok. L'agent nocif est le hok qui interfère avec la membrane cellulaire comme le sok, une molécule d'ARN antisens pour la suppression de l'éradication en se liant à la même région du hok mais transcrit dans le sens contraire. Une fois que l'ARN sok antisens se lie à l'ARN hok, la traduction est évitée. Ainsi, si le plasmide R1 est perdu, la molécule d'ARN sok imprévisible se désintègre rapidement, dans le ségrégeant sans plasmide, la molécule d'ARN hok stable est traduite et contribue à la fatalité du cellule. Il peut y avoir des avantages et des inconvénients à se débarrasser de la ségrégation post-ségrégationnelle, l'inconvénient est la mort des cellules de la peau et l'avantage est que si les cellules de la peau sont dans un état de famine, la mort de certaines cellules peut aider à promouvoir le succès de les cellules restantes.

Jeremy W. D. & Simon F. P. (2010) Génétique moléculaire des bactéries. 5e éd. , Amérique : John Wiley & Sons, Ltd.


Vecteurs de clonage : Types & Caractéristiques

Un vecteur est une molécule d'ADN qui est utilisée pour transporter l'ADN exogène dans la cellule hôte. Un vecteur est capable d'auto-réplication et d'intégration stable à l'intérieur de la cellule hôte.

L'analyse moléculaire de l'ADN n'a été rendue possible qu'après la découverte des vecteurs. L'ensemble du processus de clonage moléculaire comprend les étapes suivantes :

  1. Digestion des fragments d'ADN du segment cible et de l'ADN vecteur à l'aide d'enzymes de restriction,
  2. Ligature du segment cible avec l'ADN vecteur à l'aide d'ADN ligases, et
  3. Introduction du segment ligaturé dans la cellule hôte pour la propagation.

Caractéristiques générales d'un vecteur :

  • Il doit avoir une origine de réplication, appelée ori, de sorte que le vecteur soit capable de se répliquer de manière autonome à l'intérieur de l'organisme hôte.
  • Il doit posséder un site de restriction compatible pour l'insertion de la molécule d'ADN.
  • Un vecteur doit toujours héberger un marqueur sélectionnable pour cribler l'organisme recombinant. Ce marqueur sélectionnable peut être un gène de résistance aux antibiotiques.
  • Pour une incorporation aisée dans la machinerie hôte, un vecteur doit lui-même être de petite taille et pouvoir intégrer une grande taille de l'insert.

VECTEUR DE CLONAGE

Un vecteur de clonage est également un fragment d'ADN capable d'auto-réplication et de maintien stable à l'intérieur de l'organisme hôte. Il peut être extrait d'un virus, d'un plasmide ou de cellules d'un organisme supérieur. La plupart des vecteurs de clonage sont génétiquement modifiés. Il est sélectionné en fonction de la taille et du type de segment d'ADN à cloner.

Les vecteurs de clonage doivent posséder les caractéristiques générales suivantes :

  • Il doit être de petite taille.
  • Il doit avoir une origine de réplication.
  • Il doit également être compatible avec l'organisme hôte.
  • Il doit posséder un site de restriction.
  • L'introduction de fragment donneur ne doit pas intervenir avec la propriété d'auto-réplication du vecteur de clonage.
  • Un marqueur sélectionnable, éventuellement un gène de résistance aux antibiotiques, doit être présent pour cribler les cellules recombinantes.
  • Il devrait être capable de fonctionner aussi bien sous le système procaryote que sous le système eucaryote.
  • Plusieurs sites de clonage doivent être présents.

Importance des vecteurs de clonage

Les vecteurs de clonage sont utilisés comme véhicule pour transporter du matériel génétique étranger dans une autre cellule. Ce segment étranger d'ADN est répliqué et exprimé à l'aide de la machinerie de l'organisme hôte.

Un vecteur de clonage facilite l'amplification d'une molécule d'ADN à copie unique en plusieurs copies. Le clonage de gènes moléculaires est difficile sans l'utilisation des vecteurs de clonage.

Histoire des vecteurs de clonage

Herbert Boyer, Keiichi Itakura et Arthur Riggs étaient trois scientifiques travaillant dans le laboratoire de Boyer, Université de Californie, où ils ont reconnu un vecteur de clonage général. Ce vecteur de clonage avait des sites de restriction pour le clonage d'ADN étranger et également l'expression de gènes de résistance aux antibiotiques pour le criblage de cellules recombinantes/transformées. Le premier vecteur utilisé à des fins de clonage était pBR322, un plasmide. Il était de petite taille, près de 4 Ko, et avait deux marqueurs sélectionnables.

Caractéristiques des vecteurs de clonage

1. Origine de la réplication (ori)

  • Un ensemble/séquence spécifique de nucléotides où la réplication commence.
  • Pour une réplication autonome à l'intérieur de la cellule hôte.
  • L'ADN étranger attaché à ori commence également à se répliquer.

2. Site de clonage

  • Point d'entrée ou d'analyse pour le génie génétique.
  • L'ADN vecteur à ce site est digéré et l'ADN étranger est inséré à l'aide d'enzymes de restriction.
  • Des travaux récents ont découvert des plasmides à sites de clonage multiples (MCS) qui hébergent jusqu'à 20 sites de restriction.

3. Marqueur sélectionnable

  • Gène qui confère une résistance à des antibiotiques particuliers ou à un agent sélectif qui, dans des conditions normales, est fatal pour l'organisme hôte.
  • Confère à la cellule hôte la propriété de survivre et de se propager dans un milieu de culture contenant les antibiotiques particuliers.

4. Gène marqueur ou rapporteur

  • Permet le criblage de clones réussis ou de cellules recombinantes.
  • Largement utilisé dans la sélection bleu-blanc.

5. Incapacité de transfert via la conjugaison

  • Les vecteurs ne doivent pas permettre à l'ADN recombinant de s'échapper vers la population naturelle de cellules bactériennes.

Types de vecteurs de clonage

E. Chromosome artificiel bactérien (BAC)

F. Chromosome artificiel de levure (YAC)

G. Chromosome Humain Artificiel (HAC)

A. Les plasmides

  • Les plasmides ont été les premiers vecteurs à être utilisés dans le clonage de gènes.
  • Ils sont d'origine naturelle et se répliquent de manière autonome, des molécules d'ADN circulaire double brin extrachromosomiques. Cependant, tous les plasmides ne sont pas d'origine circulaire.

  • Ils sont présents chez les bactéries, les archées et les eucaryotes.
  • La taille des plasmides varie de 1,0 kb à 250 kb.
  • Un insert d'ADN allant jusqu'à 10 kb peut être cloné dans les plasmides.
  • Les plasmides ont un nombre de copies élevé qui est utile pour la production d'un plus grand rendement de plasmide recombinant pour des expériences ultérieures.
  • Les plasmides à faible nombre de copies sont exploités dans certaines conditions comme le gène cloné produit la protéine qui est toxique pour les cellules.
  • Les plasmides ne codent que pour les protéines essentielles à leur propre réplication. Ces gènes codant pour les protéines sont situés près de l'ori.

Exemples: pBR322, pUC18, plasmide F, plasmide Col.

Nomenclature du vecteur de clonage plasmidique : Le vecteur de clonage pBR322 possède les éléments suivants :


Pourquoi le rendement de ma préparation de plasmide est-il si faible ? Le nombre de copies de plasmide par cellule bactérienne est déterminé par l'origine de réplication sur le plasmide. Certaines origines ont un faible nombre d'exemplaires inhérent. Vérifiez le numéro de copie de l'origine de réplication sur votre plasmide. Pour les plasmides à faible nombre de copies, augmentez la quantité de culture d'E. coli pour la préparation d'ADN plasmidique afin d'obtenir un rendement d'ADN satisfaisant.

Le volume de culture bactérienne est trop faible pour la colonne de préparation de plasmide

Veuillez vérifier la capacité de liaison de votre colonne de préparation de plasmide et si votre plasmide est un plasmide à copie élevée ou faible. Pour les mini préparations, nous vous recommandons de récolter 1 à 5 ml de culture bactérienne pendant la nuit. Pour les préparations maxi, si le plasmide est un plasmide à copie élevée, nous recommandons d'utiliser 100-150 ml de culture bactérienne pendant la nuit si le plasmide est un plasmide à faible copie, nous recommandons d'utiliser 300-500 ml de culture bactérienne pendant la nuit. Typiquement, pour le plasmide à copie élevée,

5 ug d'ADN plasmidique peuvent être extraits de chaque 1 ml de culture en mini prep et

500 ug d'ADN plasmidique peuvent être obtenus à partir de 150 ml de culture pour un plasmide à faible nombre de copies (par exemple pET), 1,5-2,5 ug d'ADN plasmidique peuvent être récoltés à partir de chaque 1 ml de culture en mini préparation et 150-200 ug d'ADN plasmidique peut être obtenu à partir de 150 ml de culture.

Seule une fraction des bactéries dans la culture liquide contient des plasmides

Certains antibiotiques, en particulier l'ampicilline, se dégradent rapidement en culture liquide. As a result, bacteria that do not contain plasmids can propagate to a significant fraction of the culture, causing poor yield of the plasmid prep. To avoid this, please prepare ampicillin containing growth medium freshly before use and make sure that enough ampicillin is supplied. Also, when culturing ampicillin-resistant bacteria, do not let the liquid culture saturate for too long before harvesting. Besides insufficient antibiotics in the culture, extracting plasmid DNA from very old culture can also result in low yield, since many bacterial cells are dead and plasmid DNA they contain is degraded. Therefore, try to extract plasmid DNA from fresh culture. If plasmid prep cannot be performed immediately, you can spin down the bacteria and store the pellet in -80 ° C freezer for later plasmid prep.

The liquid culture is directly inoculated from E. coli stab culture

Direct inoculation of a liquid culture from the E. coli liquid stock or stab culture you have received from VectorBuilder can very occasionally result in low yield. We recommend streaking the stock onto an LB agar plate containing the appropriate antibiotic first, and then inoculating a liquid culture with a fresh colony growing from that plate. Detailed user instructions can be found by going to menu item Learning Center > Documentation > Stab Culture.

You have not carefully followed the manual of the plasmid prep kit

If you use a plasmid prep kit, please carefully read the manual before use. Improper operations can often lead to poor performance of the kit.

The mini/maxi prep column is low-quality

Some brands of plasmid DNA prep columns perform poorly or inconsistently for DNA preparation.


Méthodes

Bacterial strains, plasmids and materials

The bacterial strains and plasmids used in this study are listed in Additional file 2: Table S1. E. coli DH5α was used in plasmids construction and amplification. B. sutilis 168 were used in the determinations of plasmids properties. B. subtilis WB600 was employed in gene expressions. The sequences of the alkaline pectate lyase from Paenibacillus sp. 0602 (pelN, GenBank: KC351190.1), the alkaline protease gene spro1 from alkaliphilic Bacille sp. 221 (spro1, Sequence ID: D13157.1) and the pullulanase gene pulA11 de Anoxybacillus sp. LM18-11 (GeneBnak ID: HQ844266.1) were deposited in NCBI. The restriction endonucleases and DNA polymerase were commercially supplied by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. All other enzymes, chemicals and reagents were purchased from TaKaRa Biotechnology (Dalian, China) Co., Ltd.

Cultivation conditions

All cells were routinely grown at 37 °C and 200 rpm in Luria–Bertani (LB) medium or fermentation medium. LB medium (1 L) consisted of tryptone 10 g, yeast extract 5 g and NaCl 5 g. 1 L of fermentation medium consisted of tryptone 16 g, soluble starch 37 g, CaCl2 1.5 g, NaCl 2 g, MgSO4·7H2O 0.2 g, KH2Bon de commande4 1 g, FeSO4·7H2O 0.05 g and (NH4)2DONC4 1.5 g. Different antibiotics (50 μg/mL kanamycin and 25 μg/mL kanamycin) were added in the medium for the relevant recombinant strains.

B. subtilis WB600 strains containing recombinant plasmids were cultured in Shake flask (SHUNIU, GG-17, Sichuan SHUBO Co., LTD, China) or in a 10-L fermenter (5BG, bxbio, China) to produce foreign proteins. The shake-flask culturing was performed as followed. A 5 mL aliquot of LB medium supplemented with 25 μg/mL kanamycin was inoculated with a frozen glycerol stock of recombinant strain (20 μL), and then incubated for up to 14 h at 37 °C and 200 rpm in a rotary shaker (ZQWY-200G, Shanghai Zhichu Instruments Co., Ltd., China). An aliquot of this preculture (0.5 mL) was transferred into a 250 mL shake-flask that was loaded with 50 mL of LB medium supplemented with 25 μg/mL kanamycin, which was then shaken in the rotary shaker (200 rpm) at 37 °C. After culturing for 48 h, samples of each culture were collected and analyzed for enzyme activities. The culture was harvested by centrifugation at 12,000×g for 10 min at 4 °C to obtain the culture supernatant. Enzyme activities in the supernatant were determined with corresponding assays. Then the culture supernatant was analyzed with SDS-PAGE. The percentages of the produced extracellular proteins were calculated by a software Gel-Pro analyzer 4.0 (Media Cybernetics, CA, USA).

Fermentation of the recombinant B. subtilis WB600 strain was performed in a 10-L fementer. The seed culture was prepared as described in the above section and then used to inoculate an initial batch of fermentation medium supplemented with 25 μg/mL kanamycin. The biomass and enzyme activities were analyzed at designated time intervals. The cell density was determined by measuring the OD600nm with a UV-1800/PC spectrophotometer (Epoch 2, BioTek, USA). To determine the wet cell weight (WCW), a 2-mL sample of the culture broth were centrifuged at 12,000×g for 10 min at 4 °C. The resulting pellet was collected and weighed. The enzyme activities in the culture supernatant were further determined with corresponding methods. The whole fermentation process was stopped and finished when continuous reductions of biomass and enzyme activities were observed.

Shuttle plasmids construction

Construction of shuttle plasmids is schematically presented in Fig. 1. All plasmids were constructed through the method of MEGAWHOP [51]. All of the specific primers used for PCR amplification were synthesized by the Beijing Genomics Institute (BGI) and listed in Table 1 and the isolation and manipulation of recombinant DNA were performed according to the previously published protocol [52]. 1.5 mL of culture was poured into a 2 mL EP tube and centrifuged at 12,000×g for 10 min at 4 °C. The supernatant was discarded and the bacterial pellet was collected. The bacterial samples were treated with solution I (100 mL of solution I consisted of 1 M pH 8.0 Tris–HCl, 2.5 mL 0.5 M EDTA 2 mL ddH2O 91 mL 20% sterile glucose 4.5 mL), solution II (100 mL of solution II consisted of 10% SDS 50 mL 2 M NaOH 50 mL), solution III (500 mL of solution III consisted of KAc 147 g HAc 57.5 mL, ddH2O was added to 500 mL), mixture of phenol: chloroform (volume ration 1:1) and 70% ethanol successively according to the protocol. The DNA sample was dissolved with 80 μL ddH2O and stored in − 20 °C for further experiments.

According to the map obtained after sequencing, the 169 bp fragment of the membrane-binding region BA3 originating from pUB110 was deleted during construction of pWB980. In order to be mentioned conveniently, the remaining 346 bp fragment of BA3 was named BA3-1 in this work as shown in Fig. 1. pWB980 is consist of five parts: BA3-1, P43 promoter cohered with a signal-peptide sequence, the replicase-coding gene représentant dans B. subtilis, the kanamycin-resistance gene kanR and the bleomycin gene bleoR gene (Fig. 1). Dans ce travail, le bleoR was deleted with primers DB-1/DB-2. The plasmid replication origin ou Je (888 bp) from pUC19 was inserted at the four sites up- and down-stream BA3-1 region and représentant gene in pWB980-DB (3388 bp) separately. With primer pairs P1-S/P1-A and P2-S/P2-A, ou Je integrated into the site (659 bp) upstream the BA3-1 with forward and reverse directions. The recombinant plasmids were named as pUC980-1 and pUC980-2 respectively. At the site (169 bp) downstream the BA3-1, primers P3-S/P3-A and P4-S/P4-A were used in ou Je-insertions, resulting plasmids pUC980-3 and pUC980-4 in forward and reverse directions. Upstream the représentant gene, the ou Je was inserted at the 3118 site using primers P5-S/P5-A and P6-S/P6-A. The recombinant plasmids were named as pUC980-5 and pUC980-6 with forward and reverse ou Je-insertions respectively. Ori was put into the 1722 site downstream the représentant by using primers P7-S/P7-A and P8-S/P8-A. The plasmid with forward ou Je insertion was pUC980-7 and the other one was pUC980-8.

With primer pair 62-S/62-A, the alkaline pectate lyase gene pelN was inserted into the sites after the P43 promoter of plasmids pWB980, pWB980-DB and all pUC980-serial plasmids except pUC980-8. The recombinant plasmids were pWB980-pelN, pWB980-DB-pelN, pUC980-1-pelN, pUC980-2-pelN, pUC980-3-pelN, pUC980-4-pelN, pUC980-5-pelN, pUC980-6-pelN and pUC980-7-pelN correspondently.

Determination of plasmid copy number by quantitative real time PCR (qPCR)

The quantitative real-time PCR (qPCR) was performed using iQ™ SYBR ® Green Supermix (Bio-Rad) as described by Turgeon [53]. Les adn et kanR genes were chosen as a single copy reference gene on the B. subtilis chromosome and the test gene in plasmids correspondingly [54,55,56]. Specific primer pairs dnaNS/dnaNA and kanS/kanA (Table 1) were designed to generate products of approximately 150 bp. The standard curves were prepared based on the pMD-18-T vector. The PCR mixtures (total volume 20 μL) contained 10 μL 2xTakara SYBR Green Real-Time PCR Master Mix, 1.5 μL forward and reverse primers (10 μM) and 1 μL diluted (10 −1 to 10 −4 ) sample DNA. The reaction condition was as followed: 95 °C for 10 min, 45 cycles of 95 °C for 10 s, 62 °C for 20 s, and 72 °C for 30 s, followed by a gradient temperature from 55 °C to 95 °C. The calculated mean of the kanR gene in each compared plasmid was divided by the adn gene (single-copy reference), resulting the copy number. All experiments were performed with three independent biological replicates.

Plasmid stability assay

Plasmid segregational stability in B. subtilis 168 was detected according to the method of Bron and Luxen [39] with minor modifications. Single colonies on kanamycin selective (25 μg/mL) LB agar plate were used to inoculate 5 mL kanamycin selective (25 μg/mL) LB medium. After 24 h culturing at 37 °C, the cultures were diluted 1:1000 in fresh LB media without antibiotics and incubated at 37 °C. This iterative subculturing process was repeated every 24 h for 30 consecutive days. Samples taken at appropriate intervals were checked for the fraction of plasmid-containing cells by replica plating on LB agar plates containing 25 μg/mL kanamycin.

N: Total amount of colonies on the selectable plate.

Plasmids were extracted from host cells after 30-days continuously culturing and detected the structural stability by EcoRI/HindIII enzyme-digestion verifications.

Alkaline pectate lyase assay

The pectate lyase activity was measured using the method described previously by Wang et al. [57]. 20 μL of the diluted enzyme solutions were added to 400 μL of 0.2% pectin in 50 mmol/L glycine–NaOH buffer (with 50 μmol/L CaCl2) at pH 9.0. The reaction mixture was incubated at 65 °C for 10 min, and the reaction was terminated by adding 580 μL of 30 mmol/L H3Bon de commande4. The product yields were detected using a spectrophotometer at 235 nm (Epoch 2, BioTek, USA). One standard enzyme unit was defined as the yield of 1 μmol unsaturated pectin per minute under the above-mentioned conditions.

Alkaline protease assay

The alkaline protease activity was measured using the modified method described by Tjalsma et al. [28]. One standard enzyme unit was defined as the as the amount of enzyme that hydrolyzes 1 μg casein minute under the situation of pH 9.0, 50 °C. 250 μL of the diluted enzyme solution were mixed with 250 μL solution containing 2% casein in pH 9.0 buffer. The mixture was incubated at 50 °C for 10 min, and the reaction was terminated by adding 500 μL 0.4 M TCA. The productions were detected using a spectrophotometer (Epoch 2, BioTek, USA) at 280 nm. Casein with concentrations from 0 to 500 μg/mL were used as standard.

Pullulanase assay

Pullulanase activity was measured using the modified dinitrosalicylic acid (DNS) method [58]. One standard enzyme unit was defined as the amount of enzyme that releases 1 μmol reducing sugar per minute under the assay conditions. Glucose with concentrations from 0 to 400 mg/mL were used as standard. 50 μL of the diluted enzyme solutions were added into the 450 μL reaction mixture containing 5% pullulan solutions and the pH 6.0 buffer at the volume ratio of 1:8. After incubations at pH 6.0, 60 °C for 30 min, 500 μL DNS were used to stop the reactions. The productions were detected using a spectrophotometer (Epoch 2, BioTek, USA) at 540 nm. The amount of reducing sugar released during incubations were tested as the enzyme-index.

SDS-PAGE

B. subtilis WB600 transformant cells harboring recombinant plasmids were cultured in LB medium containing 25 μg/mL kanamycin at 37 °C for 48 h. The cultures (0.5 mL respectively) were centrifuged at 5000 rpm, 4 °C for 10 min and the supernatant solutions were reserved. The cell pellets were re-suspended in 0.5 mL ddH2O, followed by sonication to release intracellular content. Extracellular proteins were precipitated with 13% (w/v) TCA for 30 min on ice, then the precipitates which were collected by 10 min centrifugation at 4 °C and 13,000×g, were carefully washed with ice-cold acetone and dried under vacuum. The collective proteins were dissolved in 20 μL urea (6 M) and mixed with appropriate volume of 4 × SDS loading buffer. Samples were then heated in boiling water bath for 10 min and centrifuged at 13,000×g for 10 s. 12 μL of the samples were loaded onto 10% SDS-PAGE and run at 20 mA for around 1 h. Gel was stained using Coomassie brilliant blue dye.