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Mesure de la teneur en protéines par UV Vis


L'expérience consiste à déterminer la teneur en protéines de la solution. J'ai suivi la procédure du test de Bradford mais le réactif nécessaire n'est pas disponible et nous utilisons donc une alternative en utilisant de l'éthanol pur froid. Étant donné que l'éthanol précipite la protéine, puis-je encore déterminer la teneur en protéines de mon échantillon en utilisant UV Vis à une absorbance de 260 nm ? ou la teneur en protéines peut-elle être mesurée par son précipité en utilisant une méthode différente ?


Laboratoire 8 : Quantification de la concentration en protéines

L'absorption moléculaire dans la région ultraviolette et visible dépend de la structure électronique de la molécule absorbante. L'énergie lumineuse est absorbée dans les quanta, élevant les électrons des orbitales remplies dans l'état fondamental aux orbitales vides. Les molécules excitées retournent à l'état fondamental, le plus souvent par transition sans rayonnement, l'énergie absorbée apparaît dans le système sous forme de chaleur. Puisque la fréquence (ou longueur d'onde) de la lumière absorbée est caractéristique des niveaux d'énergie dans une molécule, le spectre UV-visible est souvent utilisé comme méthode d'analyse qualitative. Cependant, une analyse quantitative peut également être effectuée en utilisant cette technique comme cela est démontré dans cette expérience.


Mesure de la teneur en protéines par UV Vis - Biologie

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Hier, je vous ai parlé de la façon dont je passe beaucoup de temps à me concentrer sur la concentration des protéines que je purifie. Et je vous ai dit pourquoi (pour les préparer pour la prochaine étape de purification ou pour les rendre plus stables à la congélation). Mais comment puis-je savoir jusqu'où aller (de volume) ? J'ai besoin d'un moyen de mesurer la concentration en protéines. Heureusement, j'en ai un &ndash en fait, j'en ai plusieurs &ndash mais les 2 principaux que j'utilise (et que vous êtes susceptible de rencontrer dans un laboratoire de biochimie) sont le test Bradford et la spectroscopie UV-Vis.

Remarque : si vous souhaitez en savoir plus sur d'autres méthodes, y compris BCA et amp Lowry, consultez cet article précédent http://bit.ly/proteinassays

Pourquoi tant de méthodes ? Ils ont des avantages et des inconvénients différents pour diverses circonstances. Certaines des nombreuses choses à considérer:

  • sensibilité (si vous n'avez pas beaucoup de protéines, vous ne voulez certainement pas les utiliser pour essayer de comprendre à quel point vous en avez !)
  • compatibilité avec les autres choses avec lesquelles vos protéines traînent. En plus de l'agent tampon stabilisant le pH (Tris, MOPS, HEPES, etc.) qui donne leur nom aux tampons, et de certains sels, le tampon dans lequel se trouvent vos protéines peut contenir des éléments tels que des détergents (savons artificiels Brij & Triton) et des agents réducteurs ( comme le DTT et le bêta-mercaptoéthanol), qui peuvent fausser les lectures de divers dosages et différentes méthodes ont des talons d'Achille différents
  • coût (financier, physique, temps-sage)

L'absorption UV va directement à la source et mesure comment une protéine elle-même absorbe la lumière. Cela contraste avec Bradford, où vous regardez une lecture indirecte et un colorant se lie aux protéines et change de couleur, puis vous mesurez ce changement de couleur.

Dans les deux cas, vous avez besoin d'un moyen de convertir le signal que vous enregistrez en la quantité de protéine à laquelle il correspond. Pour l'UV-Vis, si nous n'avons qu'une seule protéine, nous pouvons calculer ce qu'on appelle un coefficient d'extinction qui nous dit combien une protéine devrait absorber en fonction de sa composition moléculaire (en particulier sa taille et sa richesse en l'acide aminé (lettre de protéine) Tryptophane (Trp, W) qui est l'absorbeur principal). (Si nous avons un mélange de protéines, nous pouvons utiliser un &ldquoaverage&rdquo coefficient d'extinction. En parlant de moyennes, il est plus difficile de prédire ce que vous attendez de Bradford, donc au lieu d'essayer de calculer un facteur de conversion spécifique pour chaque protéine, nous déterminons empiriquement (découvrez par l'expérience) combien différentes quantités d'un &ldquoprotéine standard&rdquo telles que l'albumine sérique bovine (BSA) ou la globuline gamma bovine (BGG) absorbent. Cela nous permet de créer des &ldquocourbes standard&rdquo auxquelles nous pouvons comparer notre signal.

Mais, ces courbes ne sont pas parfaites. Parce qu'il n'y a vraiment pas de protéine &ldquostandard&rdquo. Toutes les protéines sont uniques ! Et cette unicité vient du fait que les protéines sont composées de lettres d'acides aminés qui ont une partie de squelette peptidique générique et l'une des 20 chaînes latérales uniques (alias & ldquoR groupes & rdquo) qui colle un peu comme un charme sur un bracelet à breloques. Différentes protéines ont différents nombres et combinaisons de lettres et aucune méthode seul mesure la partie générique. Bradford est faussé par l'arginine, la lysine et l'histidine. Et l'absorbance UV par le tryptophane (et la tyrosine et la phénylalanine dans une moindre mesure).

Ainsi, en fonction des parties uniques que la méthode mesure et du nombre de celles que contient votre protéine, vous obtenez un signal par protéine différent. Si votre protéine a plus de brochette que la norme à laquelle vous vous comparez, vous surestimez votre concentration réelle de protéines, et si votre protéine a moins de brochette, vous sous-estimez votre concentration réelle de protéines. Ainsi, par exemple, beaucoup d'arginine ? Bradford sur la base d'une "protéine moyenne" surestimerait. Beaucoup de Trp ? UV-Vis surestimerait la concentration réelle.

En parlant de &ldquotrue concentration&hellip&rdquo

En ce qui concerne la concentration en protéines, il existe plusieurs façons de la signaler. L'un est mg/mL. Et si vous avez un mélange de protéines, c'est aussi loin que vous pouvez aller, mais si vous avez une seule protéine et que vous connaissez sa séquence, vous pouvez réellement déterminer combien de molécules de la protéine vous avez en fonction de la quantité de chacune. la molécule pèse (qui peut être calculé en fonction de la composition de ses atomes et du poids de chacun de ses atomes et ne vous inquiétez pas, vous n'avez pas à le faire à la main et vous pouvez utiliser des ressources Internet gratuites comme UniProt ou Expasy ProtParam).

Une seule molécule de protéine, même une « grande » pèserait beaucoup, alors nous parlons plutôt de combien d'entre elles pèsent et beaucoup d'entre elles. Comme une valeur entière de mol&rsquos. Un mol fait référence au nombre d'Avagadro (6,02 x 10²³) de quelque chose, et le poids moléculaire nous dit combien de grammes pèse un mol. Ainsi, par exemple, si je recherche du BSA, je vois qu'il a un poids moléculaire d'environ 67 000 Daltons (Da), ce qui signifie qu'une mole pèse environ 67 000 g (67 kg).

N'en avez certainement pas autant, mais cela n'a pas d'importance car ce rapport de conversion est le même, que vous ayez 67 kilogrammes de protéines ou une seule molécule. Alors maintenant, nous pouvons convertir de mg/mL en mol/mL &ndash mais ce que nous voulons vraiment, c'est mol/L, qui s'appelle la molarité. Ainsi, par exemple, 1 mg/mL de BSA aurait une molarité de (met sur l'analyseur dimensionnel hat&hellip)

(1 mg/mL) x (1 mol/67 000 g) x (1 g/1000 mg) x (1000 mL/1L) =

Alors comment obtient-on mg/ml ? Commençons par la méthode de dosage Bradford. Vous connaissez peut-être mieux le bleu brillant de Coomassie (CBB) pour son rôle dans la teinture des gels SDS-PAGE pour visualiser les bandes de protéines dans un gel que vous avez utilisé pour séparer les protéines par taille. J'ai fait tout un Bri*fing dessus si tu veux rafraîchir : http://bit.ly/2k28Lxy

Ce même pouvoir de liaison aux protéines qui rend le CBB bon pour la coloration des protéines dans un gel le rend également bon pour la coloration des protéines dans un puits ou une cuvette (un &ldquotube rectangulaire avec des parois transparentes à travers lesquelles vous pouvez faire briller la lumière) &ndash et c'est la base du dosage des protéines de Bradford. Vous prenez la forme &ldquoG-250&rdquo de CBB, la mélangez avec votre protéine, puis mesurez l'absorbance (combien de lumière brillante est &ldquostolen&rdquo avant qu'elle ne traverse votre cuvette) à une longueur d'onde brillante de 595 nm. Pourquoi là-bas?

Le CBB G-250 existe sous 3 formes car il possède 2 groupes protonables (parties qui peuvent donner ou prendre un proton (H⁺) : les deux, 1, ou aucun ne peut être protoné pour vous donner un cationique doublement protoné et chargé positivement forme (qui a l'air rouge, absorbance maximale (Amax) à 470 nm), une forme neutre (qui a l'air verte, Amax à 650 nm) et une forme anionique chargée négativement qui a l'air bleue (Amax à 610 nm). La forme rouge prédomine dans des conditions acides , car il y a beaucoup de protons disponibles. Mais lorsqu'il se lie aux protéines, le CBB se stabilise sous la forme bleue. Vous pouvez donc mesurer le bleu pour déterminer la quantité de protéines. Pour quantifier le bleu, vous mesurez généralement l'absorbance à 595 nM parce que les 2 formes & rsquo pics d'absorbance se chevauchent et c'est là qu'il y a la plus grande différence entre eux & ndash vous pouvez également regarder le rapport entre ces 2 longueurs d'onde.

Mais le facteur de conversion du bleu en protéine dépend de la composition en protéines. Parce que Bradford n'est pas comme n'importe quel acide aminé olé et qu'il a des favoris et fondamentalement, CBB aime les acides aminés basiques et ndash Lys, His et Arg contribuent le plus à la liaison, mais les interactions hydrophobes de van-der-Waals et amp y contribuent également. Ainsi, la norme que vous utilisez devrait se lier de la même manière à votre protéine ou à la protéine moyenne si vous regardez un mélange.

Quelques & ldquostandards & rdquo couramment utilisés sont l'albumine sérique bovine (BSA) et la globuline gamma bovine (BGG). Ils sont si couramment utilisés que vous pouvez acheter des « ampoules » standardisées et des petits tubes remplis avec une concentration précise. BSA est une norme commune pour une grande raison, car il est bon marché d'en obtenir beaucoup de pureté. Mais il donne une réponse Bradford beaucoup plus élevée que la plupart des protéines, ce qui peut vous amener à sous-estimer la quantité de protéines qu'il contient. Le BGG est en fait un mélange de plusieurs immunoglobulines (un type d'anticorps), mais il est plus proche de la "moyenne" en termes de liaison Bradford.

Remarque : il existe également des méthodes à base de colorants fluorescents qui fonctionnent de la même manière, mais le colorant émet de la lumière lorsqu'il se lie plutôt que de changer de couleur (vous mesurez donc la lumière et ne la volez pas)

J'ai fait des courbes standard de BSA & BGG pour les comparer les unes aux autres et à ma protéine.

une courbe standard est l'endroit où vous faites une dilution en série de la norme de concentration connue (par exemple 100 uL de 1 mg/mL + 100 uL de tampon -> mélanger, mélanger, mélanger -> 100 uL de ce mélange à 100 uL de tampon -> mix, mix, mix&hellip), puis vous mesurez le signal de chacune de ces valeurs en utilisant le test que vous utilisez, puis vous tracez ce signal en fonction de la concentration. Ensuite, vous trouvez l'équation de la partie linéaire de la courbe. Ensuite, branchez la valeur que vous mesurez pour votre échantillon de concentration inconnue dans cette équation pour voir à quelle concentration correspond cette valeur mesurée. Il doit s'agir d'une valeur dans la plage linéaire ! plus d'informations ici : http://bit.ly/2Nu9dAS

Bradford & rsquos pas cher et rapide. Il est également très facilement confondu par les agents réducteurs &ndash DTT & BME n'interfèrent pas avec lui. Mais il est sensible à certains détergents. En outre, il a une plage linéaire étroite et n'est pas aussi sensible aux protéines que l'UV-Vis (vous pouvez détecter de très petites quantités de protéines avec Bradford).

Absorption UV. Nous avons utilisé des mesures basées sur la lumière dans toutes les expériences ci-dessus, mais je n'ai jamais vraiment expliqué ce qu'est la lumière et qu'il est important de savoir pour la prochaine, alors voici un bref résumé. La lumière (rayonnement électromagnétique) (EMR) est de petits paquets d'énergie voyageant par ondes. Différentes couleurs ont différentes longueurs d'onde de lumière avec différentes énergies (cela est également vrai pour les couleurs &ldquoinvisible&rdquo &ndash longueurs d'onde en dehors du spectre visible &ndash comme les ondes radio, qui sont des fréquences plus basses et les ondes ultraviolettes (UV) qui sont de fréquence plus élevée. Différentes molécules absorbent différentes longueurs d'onde. de lumière à différents degrés, et cela peut être quantifié par un nombre appelé coefficient d'extinction (&epsilon), qui vous indique dans quelle mesure une molécule absorbe la lumière d'une longueur d'onde particulière. /2CfaXbJ Vous pouvez ensuite utiliser cette équation appelée loi de la bière pour déterminer la quantité de protéine ou d'ADN ou tout ce qui absorbe en fonction de celle-ci.

Mais TLDR, cela a à voir avec la quantité d'énergie dont disposent les électrons externes de la molécule et la quantité d'énergie supplémentaire dont ils ont besoin pour passer au niveau suivant. Les électrons peuvent être considérés comme vivant dans des "maisons" appelées orbitales moléculaires. vivent au même endroit et ils se déplacent constamment, mais ces orbitales sont l'endroit où vous avez le plus de chances de les trouver. Les orbitales plus éloignées des noyaux des molécules (où sont contenus les protons positifs et les neutrons neutres) nécessitent que les électrons aient une énergie plus élevée pour y vivre. Si une molécule est touchée par un photon de l'énergie optimale, le photon peut être absorbé et son énergie utilisée pour promouvoir un électron d'énergie inférieure à une énergie plus élevée, plus éloignée du noyau, orbital.

La délocalisation des électrons par résonance implique la fusion de certaines orbites de molécules voisines dans ce beignet partagé. Et cela réduit le coût de déplacement pour promouvoir un électron &ndash afin que les anneaux des acides aminés aromatiques puissent absorber la lumière UV &ndash Le tryptophane (Trp, W), la phénylalanine (Phe, F) et la tyrosine (Tyr, Y) peuvent tous contribuer, mais Trp est le principal contributeur, donc l'absorbance UV280 par protéine va dépendre du nombre de Trps de cette protéine. &ldquoAnormal&rdquo Les numéros Trp peuvent vous faire trébucher ! &ldquoTrop&rdquo et vous pouvez surestimer et &ldquotoo peu&rdquo et vous pouvez sous-estimer la concentration en protéines si vous vous fiez à la &ldquoaverage,&rdquo mais si vous connaissez la séquence de protéines, vous pouvez calculer le coefficient d'extinction pour votre protéine exacte

Les coefficients d'extinction peuvent être donnés en termes de molarité si vous connaissez la séquence de la protéine. mais lorsque vous ne le faites pas (et même parfois lorsque vous le faites), ils sont donnés en mg/mL. Ils vous indiquent la valeur d'absorbance (A) qui correspond à 10 mg/mL (1%) ou 1 mg/mL (0,1%). Ces pourcentages proviennent de la convention de pourcentage poids/volume selon laquelle une solution à 1% correspond à 1 g/100 ml & ndash plus sur pourquoi ici : http://bit.ly/37LsTrq

Vous pouvez calculer le coefficient d'extinction estimé à l'aide d'outils logiciels en ligne gratuits comme Expasy ProtParam. Je dis estimé parce que le contexte est important et que l'environnement local autour de la partie absorbante peut influencer à quel point il est désireux d'absorber un photon

Quand je fais cela pour BSA, je vois ceci:

Coefficients d'extinction :

Les coefficients d'extinction sont en unités de M -1 cm -1 , à 280 nm mesurés dans l'eau.

Abs 0,1% (=1 g/l) 0,638, en supposant que toutes les paires de résidus Cys forment des cystines

Abs 0,1% (=1 g/l) 0,607, en supposant que tous les résidus Cys sont réduits

D'abord, il me dit les valeurs dans des conditions oxydantes et en dessous, il me dit les valeurs dans des conditions réductrices (l'environnement intracellulaire est réducteur et nous ajoutons généralement des agents réducteurs comme le DTT ou le &beta-mercaptoenthanol) aux solutions de protéines pour les garder heureux en dehors de la cellule) . Cela me dit cela parce que les réticulations de la cystéine peuvent également absorber, le cas échéant.

Ensuite, je peux le brancher sur la loi de la bière (ou demander à l'ordinateur de le faire pour moi) si je mesure l'absorbance.

Vous mesurez cette absorbance en utilisant ce qu'on appelle un spectrophotomètre. Fondamentalement, il fait briller la lumière à travers une solution et mesure dans quelle mesure différentes longueurs d'onde traversent (sont transmises) par rapport à ne pas traverser (sont absorbées). Nous avons examiné comment cela peut être converti en concentration de soluté (molécules dissoutes) en utilisant la loi de la bière http://bit.ly/2N4nzXE

&epsilon = coefficient d'extinction (alias coefficient d'absorption molaire) &ndash spécifique à une molécule particulière & unités de longueur d'onde particulières de L mol-1cm-1

c = concentration (en mol/L) &ndash c'est la molarité &ndash une taupe n'est qu'un chimiste&rsquos &ldquobaker&rsquos douzaine&rdquo &ndash it&rsquos Avogadro&rsquos nombre (6,022 x 10^23) de quelque chose &ndash molécules de soluté ou beignets, c'est juste un nombre http:// .ly/2r4RnrX

Pour la loi de la bière, vous n'avez besoin que de l'absorbance à une seule longueur d'onde, mais il y a beaucoup plus à apprendre si vous regardez l'ensemble du spectre (ou au moins quelques valeurs clés). Parce que les molécules ont des spectres qui se chevauchent (par exemple, l'ADN et l'ARN absorbent la lumière d'une longueur d'onde de 260 nm), vous recherchez des rapports.

Comme je l'ai expliqué, les protéines absorbent le plus fortement à 280, et c'est généralement à partir de là que nous calculons. Les protéines absorbent également à 230 nm et cette absorbance provient de la partie du squelette générique et correspond à l'absorbance par les liaisons peptidiques reliant les lettres. Ces liaisons peptidiques ont également une résonance, mais pas autant que les anneaux, et elles absorbent

Parce que l'ADN absorbe si fortement à UV260, où la protéine n'en a pas, il est relativement facile de voir si vous avez de l'ADN dans votre préparation de protéines, mais il est plus difficile de dire si vous avez des protéines dans votre préparation d'ADN et 260 dominera le rapport 260/280

Morale de l'histoire : il n'y a pas de bonne façon de compter vos protéines et il est important de bien choisir celle que vous utilisez !


Comment l'absorption ultraviolette des protéines impacte-t-elle l'analyse ?

Image au microscope ultraviolet d'un cristal de protéine en solution. Le cristal est sombre car il absorbe la lumière UV alors que la solution ne le fait pas, ce qui donne un arrière-plan lumineux.

Diagramme de niveau d'énergie de Jablonski illustrant les transitions d'absorption et de fluorescence

Les protéines, telles que celles des tissus animaux et des plantes, absorbent fortement la lumière ultraviolette (UV) à environ 280 nm. Ce sont plutôt certains des acides aminés qui composent les protéines qui absorbent la lumière UV. La forte absorption de la lumière UV par les protéines permet une détection et une identification rapides des échantillons de protéines, à la fois liquides et solides, par microscopie et microspectroscopie.

Acides aminés

Communément, l'absorption optique des protéines est mesurée à 280 nm. A cette longueur d'onde, l'absorption des protéines est principalement due aux acides aminés tryptophane, tyrosine et cystéine dont les coefficients d'absorption molaires diminuent dans cet ordre. Bien entendu, le coefficient d'absorption molaire de la protéine elle-même à 280 nm dépendra des concentrations relatives de chacun de ces trois acides aminés. Par conséquent, différentes protéines peuvent avoir des coefficients d'absorption différents et même la longueur d'onde de l'absorption maximale peut différer. Ce fait peut être utilisé pour aider à identifier différents types de protéines par des tests optiques relativement rapides et simples.

Imagerie des protéines par absorbance UV

Le plus souvent, les cristaux de protéines sont imagés par leur fluorescence intrinsèque de protéines. Il s'agit principalement de la fluorescence du tryptophane. En tant que telle, la fluorescence des protéines nécessite des sources de lumière UV très puissantes et des caméras très sensibles car l'émission fluorescente des protéines est si faible. Cependant, de puissantes sources de lumière UV peuvent détruire la protéine en raison des longs temps d'exposition requis pour obtenir des données significatives.

Un moyen beaucoup plus rapide d'imager les protéines, que ce soit dans les cellules, les tissus ou sous forme de cristaux, consiste à utiliser leur forte absorption de la lumière UV comme mécanisme de contraste. En utilisant un microscope ultraviolet ou un microspectrophotomètre équipé pour l'imagerie UV, l'échantillon contenant la protéine est imagé avec une lumière de 280 nm. La protéine absorbera cette lumière plus fortement que l'échantillon environnant et apparaîtra plus sombre. Voir l'image ci-dessus pour un exemple d'absorption UV d'un cristal de protéine dans une solution saline. Cette technique est très rapide, exposant la protéine à la lumière UV beaucoup moins longtemps.

Spectroscopie des protéines par absorption UV

Les microspectrophotomètres de CRAIC Technologies sont utilisés pour acquérir des spectres d'échantillons microscopiques contenant des protéines, tels que des cristaux de protéines individuels, par leur absorption UV. Le microspectrophotomètre se compose d'un microscope UV-visible-NIR intégré à un spectrophotomètre. En tant que tel, il est capable de mesurer les spectres UV-visible-NIR d'échantillons microscopiques de tissus, de cristaux de protéines et d'autres structures contenant des protéines. En utilisant l'absorption, il est capable de mesurer ces échantillons rapidement et de manière non destructive.

La microspectroscopie permet à l'utilisateur d'en apprendre davantage sur les caractéristiques optiques et la structure chimique de la protéine. De plus, la microspectroscopie permet également de déterminer la concentration de protéines dans un échantillon car l'absorption à 280 nm est proportionnelle à la concentration de protéines.

Si l'échantillon de protéine ne contient pas de tryptophane ou de tyrosine, qui absorbent tous deux à 280 nm, la concentration peut toujours être facilement mesurée par la méthode Scopes. Dans cette méthode particulière, la concentration en protéines est déterminée par l'absorption à 205 nm dans laquelle les liaisons peptidiques sont analysées directement.

La pureté de l'ADN ou de l'ARN peut également être déterminée en mesurant les rapports d'absorption de 260 à 280 nm. En effet, les acides nucléiques qui composent l'ADN et l'ARN absorbent fortement à 260 nm. Un rapport d'environ 2,0 est considéré comme "pur" pour l'ARN, tandis qu'un rapport d'environ 1,8 est considéré comme "pur" pour l'ADN. Des rapports inférieurs indiquent la présence de protéines.

Sommaire

Les protéines absorbent fortement à 280 nm en raison de trois types d'acides aminés constitutifs. Les liaisons peptidiques présentes dans les acides aminés absorbent également à 205 nm. L'absorption UV des protéines peut être utilisée à la fois pour imager et acquérir rapidement des spectres d'échantillons microscopiques de manière non destructive. Les spectres peuvent également être utilisés pour déterminer les concentrations de protéines et les quantités relatives de protéines par rapport à l'ADN ou à l'ARN.


Quantification des peptides et des acides aminés par fluorescence UV dans le lecteur de microplaques multimode Synergy HT

Les cellules eucaryotes et procaryotes contiennent un certain nombre de composés fluorescents avec une excitation de lumière UV. Les protéines et les peptides, avec les acides aminés aromatiques, sont intrinsèquement fluorescents lorsqu'ils sont excités par la lumière UV. De nombreux cofacteurs enzymatiques, tels que FMN, FAD, NAD et les porphyrines, qui sont également intrinsèquement fluorescents, s'ajoutent à la fluorescence de la protéine. Ces fragments ont un trait commun en ce sens qu'ils contiennent tous des structures cycliques aromatiques qui absorbent la lumière UV pour l'excitation. Il existe également des protéines spéciales telles que la protéine fluorescente verte, qui possède une séquence interne sérine-tyrosine-glycine modifiée post-traductionnelle et fluorescente dans la région de la lumière visible.

Figure 1. Structure chimique des acides aminés aromatiques.

Les trois résidus d'acides aminés qui sont principalement responsables de la fluorescence inhérente des protéines sont le tryptophane, la tyrosine et la phénylalanine (Figure 1). Ces résidus ont des longueurs d'onde d'absorption et d'émission distinctes et diffèrent par les rendements quantiques (tableau 1). Le tryptophane est beaucoup plus fluorescent que la tyrosine ou la phénylalanine. Cependant, les propriétés fluorescentes du tryptophane dépendent du solvant. Lorsque la polarité du solvant diminue, le spectre se déplace vers des longueurs d'onde plus courtes et augmente en intensité. Pour cette raison, les résidus tryptophane enfouis dans les domaines hydrophobes des protéines repliées présentent un décalage spectral de 10 à 20 nm. Ce phénomène a été utilisé pour étudier la dénaturation des protéines [2]. La tyrosine peut être excitée à des longueurs d'onde similaires à celle du tryptophane, mais émet à une longueur d'onde nettement différente. Bien que la tyrosine soit moins fluorescente que le tryptophane, elle peut fournir un signal significatif, car elle est souvent présente en grand nombre dans de nombreuses protéines. Il a été observé que la fluorescence de la tyrosine est éteinte par la présence de fragments tryptophane à proximité via le transfert d'énergie de résonance, ainsi que par l'ionisation de son groupe hydroxyle aromatique. La phénylalanine est très faiblement fluorescente et ne peut être observée qu'en l'absence à la fois de tryptophane et de tyrosine. En raison de la plus grande capacité d'absorption du tryptophane, du rendement quantique plus élevé et du transfert d'énergie de résonance, le spectre de fluorescence d'une protéine contenant les trois acides aminés ressemble généralement à celui du tryptophane.

Tableau 1. Caractéristiques fluorescentes des acides aminés aromatiques.

Fluorescence

Longueur d'onde (nm)

Absorbivité

Longueur d'onde (nm)

Rendement quantique

Le lecteur de microplaques multi-détection Synergy HT est un lecteur de microplaques compatible robotique qui peut mesurer l'absorbance, la fluorescence et la luminescence. Le Synergy HT utilise une conception unique à double optique qui comprend à la fois un système de flash monochromateur/xénon avec un détecteur à diode en silicone pour l'absorbance et une lampe tungstène halogène avec des filtres interférentiels bloquants et un détecteur PMT pour la fluorescence. Un Synergy HT configuré pour la fluorescence à résolution temporelle est capable de mesurer la fluorescence soit dans le mode conventionnel où l'émission fluorescente est mesurée avec la source d'excitation toujours présente, soit en mode résolu dans le temps où la fluorescence est mesurée à un moment donné après l'arrêt de excitation. Lorsque le lecteur est en mode de fluorescence conventionnel, il utilise une lampe tungstène-halogène comme source lumineuse et des filtres passe-bande dans une cartouche à roue filtrante pour fournir une spécificité de longueur d'onde. Lorsque le lecteur est utilisé en mode résolu dans le temps, il passe automatiquement à la source lumineuse de la lampe flash au xénon avec un monochromateur pour sélectionner la longueur d'onde. La cartouche filtrante d'excitation est remplacée par la cassette TR qui, en plus de diriger la lumière des différentes sources lumineuses vers la microplaque, peut également contenir un seul filtre d'excitation si nécessaire. En mode résolu en temps, l'utilisateur a la possibilité de contrôler le temps entre la cessation de l'excitation et le début de la mesure de fluorescence (temps de retard), ainsi que la durée d'accumulation du signal fluorescent (temps de collecte). En plus d'un arrêt rapide de la lumière, la lampe flash au xénon a l'avantage supplémentaire de fournir une sortie dans la gamme de longueurs d'onde UV. L'utilisation d'un paramètre de retard de zéro nous permet de tirer parti de cette capacité à fournir une lumière excitatrice dans la gamme UV pour les mesures de fluorescence conventionnelles. Toutes les mesures de fluorescence dans ce traité ont été faites en utilisant cette capacité du lecteur.

Matériaux et méthodes

L-Tryptophane (cat # T-8941) L-tyrosine (cat # P-2126) et L-phénylalanine (cat # T-3754), sérum albumine bovine, BSA, (cat # A-0281), phosphate de potassium dibasique ( cat # P-3786) et de l'hydroxyde de sodium (cat # S-5881) ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich Chemicals (St. Louis, MO). Plusieurs microplaques différentes ont été utilisées : pour les mesures d'absorbance, les microplaques Costar UV transparentes (cat # 3635) et pour les déterminations de fluorescence, les microplaques noires opaques Costar (cat # 3915). Plusieurs séries de dilutions d'acides aminés ont été réalisées en utilisant de l'eau distillée comme diluant. Après dilution, des aliquotes de 200 ml ont été pipetées dans des puits de microplaque et des balayages d'absorbance de 200 nm à 350 nm par incréments de 1 nm ont ensuite été effectués à l'aide d'un lecteur de microplaques multi-détection Synergy HT équipé d'une optique capable de résolution temporelle (BioTek Instruments, Winooski, VT) . L'absorbance à chaque longueur d'onde d'un puits contenant seulement 200 µl d'eau a été soustraite des échantillons expérimentaux et les données ont été tracées en utilisant Microsoft© Excel. En utilisant les mêmes dilutions, les déterminations de fluorescence des acides aminés et des protéines ont été faites à l'aide d'un Synergy HT. Toutes les données ont été collectées, analysées et tracées avec le logiciel KC4 (BioTek Instruments, Winooski, VT).

Plusieurs expériences portant sur certaines des propriétés uniques de la fluorescence de la L-tyrosine ont été réalisées. L'effet de la concentration de phosphate sur la fluorescence de la tyrosine a été évalué en utilisant des dilutions de phosphate de potassium dibasique allant de 2,16M à 0,09M. Chaque dilution contenait 0,1 mg/ml de L-tyrosine et avait un pH de 7,5. En utilisant ces dilutions, des aliquotes de 200 µl ont été pipetées dans des microplaques en réplicats de 8 et la fluorescence mesurée. L'effet du pH sur la fluorescence de la tyrosine a été déterminé en réalisant deux séries de dilutions parallèles de L-tyrosine. L'un a été préparé en partant d'une concentration de 0,125 mg/ml de L-tyrosine dans l'eau avec de l'eau comme diluant, tandis que le second a commencé avec 0,125 mg/ml de L-tyrosine dans une solution de 0,01 N de NaOH avec 0,01 N de NaOH comme diluant. Une fois les dilutions préparées, des aliquotes de 200 µl de chacune ont été pipetées en réplicats de 4 sur la même microplaque et la fluorescence a été mesurée.

Résultats

Comme le montre la figure 2, les acides aminés aromatiques et les protéines absorbent la lumière UV avec deux pics distincts. Le pic centré sur 280 nm est le résultat de l'absorbance par la portion de cycle aromatique de leur structure. Le pic à des longueurs d'onde inférieures est causé par l'absorbance des fragments peptidiques et acides carboxyliques dans les composés. Sur une base molaire, le tryptophane absorbe plus de lumière à 280 nm que la tyrosine ou la phénylalanine. Notez que la protéine BSA, qui a une valeur d'absorbance à 230 nm similaire à celle du tryptophane, a moins d'absorbance à 280 nm en raison de moins de cycles aromatiques sur une base molaire.

Figure 2. Absorbance Spectral scans d'acides aminés aromatiques et d'albumine de sérum bovin (BSA). Des balayages spectraux de 200 nm à 350 nm par incréments de 1 nm ont été effectués sur les acides aminés, le tryptophane, la tyrosine et la phénylalanine, ainsi que sur la protéine BSA en solution aqueuse à l'aide d'un lecteur de microplaques multi-détection Synergy HT.

En utilisant le monochromateur pour sélectionner la longueur d'onde d'excitation, un réglage précis de la longueur d'onde d'excitation est possible. Comme le montre la figure 3, le signal fluorescent du tryptophane renvoyé peut varier jusqu'à 20 % sur une plage d'excitation de longueur d'onde de 12 nm, malgré l'utilisation du même filtre d'émission 340/30 pour toutes les déterminations. Il est intéressant de noter que la fluorescence de fond de la microplaque variait assez considérablement sur les mêmes longueurs d'onde d'excitation. Par conséquent, il est important d'examiner le signal corrigé (c. En utilisant les données de la figure 3, une longueur d'onde d'excitation de 284 nm a été utilisée pour les déterminations ultérieures du L-tryptophane.

Figure 3. Détermination du pic d'excitation pour le L-tryptophane en solution. Le L-tryptophane en solution a été excité avec de la lumière UV à différentes longueurs d'onde et la fluorescence a été mesurée en utilisant un BioTek Synergy HT TR avec un filtre 340/30. Toutes les lectures ont été obtenues en utilisant le même réglage de sensibilité de 100 et la valeur à blanc à cette longueur d'onde a été soustraite.

En utilisant la longueur d'onde d'excitation optimisée, plusieurs dilutions de L-tryptophane ont été aliquotées dans une microplaque et la fluorescence mesurée. La courbe de concentration résultante tracée dans le logiciel KC4 démontre une relation linéaire entre la concentration de L-tryptophane et la fluorescence (figure 4). Les déterminations de concentration peuvent être effectuées avec un degré de confiance élevé, car le coefficient de corrélation (r2) pour l'analyse de régression linéaire a été calculé à 0,9989. En utilisant la fluorescence, la limite de détection du L-tryptophane s'est avérée être de 62,5 ng/ml, ce qui se convertit en 12,5 ng/puits.

Figure 4. Courbe de concentration en tryptophane. Une série de dilutions de L-tryptophane ont été faites en utilisant de l'eau distillée comme diluant. Des aliquotes de chaque concentration (200 µl) ont été pipetées dans des microplaques en répétitions de 8. La fluorescence a été déterminée en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 284 nm en conjonction avec un filtre d'émission 340/30. Les lectures ont été faites par le haut en utilisant un réglage de sensibilité de 95.

The peak excitation wavelength for L-tyrosine was determined in a similar fashion as described for tryptophan. Excitation wavelengths from 268 nm to 278 nm in 2 nm increments were tested for their ability to generate L-tyrosine fluorescence when measured with a 310/20-emission filter. Figure 5 demonstrates that wavelengths between 270 nm and 276 nm produce equivalent blank-subtracted fluorescent signals. Subsequent experiments used 274 nm as the excitation wavelength. Several dilutions of L-tyrosine were then aliquoted into a microplate and the fluorescence measured. As seen in Figure 6, the fluorescent signal of L-tyrosine with an excitation wavelength of 274 nm and a 310/20-emission filter is directly related to amino acid concentration. Using a least means squared linear regression analysis, the correlation coefficient (r2) was greater than 0.998. Under these conditions, samples with as little as 800 ng/ml of L-tyrosine (160 ng/well) can be determined.

Figure 5. Excitation peak determination for L-Tyrosine in solution. L-tyrosine in aqueous solution was excited with UV-light at various wavelengths and the fluorescence was measured using a Synergy HT TR with a 310/20 filter. All readings were obtained using the same sensitivity setting of 150 and the value of the blank at that wavelength subtracted.

Figure 6. Tyrosine Concentration Curve. Several dilutions of L-tyrosine were prepared using deionized water as the diluent. Aliquots of each dilution (200 µl) were pipetted into microplates in replicates of eight and the fluorescence determined using a Synergy HT and KC4 Software. All determinations were made from the top with an excitation wavelength of 274 nm and a 310/20 nm emission filter, 50 reads per well and a PMT-sensitivity setting of 180.

Because L-tyrosine fluorescence is influenced by ionization, several experiments were performed to investigate this phenomenon. The phenolic hydroxyl group of tyrosine is capable of ionization under a number of different conditions (see Figure 7). The pKa of the group is reported to be 10.3 thus at high pH levels (e.g. pH 12) it would be expected to be primarily in the ionized state. The fluorescence signal returned when tyrosine at pH 12 is excited at 274 nm is reduced when compared to the same concentration at pH 7 (Figure 8). It has been reported that the excitation peak of tyrosinate is 340 nm rather than near 274 nm [2].

Figure 7. Ionization of tyrosine to tyrosinate. With increasing pH, protons are lost from tyrosine forming tyrosinate, which has markedly different fluorescent properties than the non-ionized form.

Figure 8. Effect of pH on Tyrosine Fluorescence. Several dilutions of L-tyrosine were made in either water (approximately pH 7) or 0.01N NaOH (pH 12). Samples (200 µl) of each dilution were aliquoted into microplates in replicates of four and the fluorescence determined using a Synergy HT with an excitation wavelength of 274 and a 310/20-emission filter. Samples were measured from the top at 50 reads per well and a PMT-sensitivity setting of 150.

Factors other than pH can cause tyrosinate formation. As seen in Figure 9, the concentration of phosphate can influence the fluorescent signal of tyrosine even at neutral pH levels. Increasing levels of phosphate are capable of reducing the fluorescence seven fold. Phosphate is reported to form a ground-state complex with tyrosine that prepares tyrosine to ionize to tyrosinate as a result of excitation by light. The result is a decrease in emission with a 310/20 filter. Acetic acid is reported to cause a similar phenomenon, where the presence of high concentrations results in a loss of fluorescence signal (data not shown). In this example, it is caused by the acetate group removing the phenolic proton of tyrosine at neutral pH [2].

Figure 9. Effect of Phosphate Concentration on Tyrosine Fluorescence. Several dilutions of dibasic potassium phosphate (K2HPO4) were prepared with equal concentrations of L-tyrosine and at a pH of 7. Aliquots of each (200 µl) were pipetted into microplates in replicates of 8 and the fluorescence measured using a Synergy HT TR with an excitation wavelength of 274 nm and a 310/20 emission filter at a PMT-sensitivity setting of 150.

Using the same methodology, the fluorescence of several dilutions of bovine serum albumin (BSA) protein in aqueous solution were measured. Despite the presence of both tyrosine and tryptophan amino acids in the peptide, the maximal response resulted when the reading parameters for tryptophan were used. This agrees with previously reported findings that suggest that energy absorption by tyrosine is often transferred to tryptophan [2]. Figure 10 demonstrates the ability to use fluorescence to measure protein rather than specific aromatic amino acids. When dilutions of bovine serum albumin are prepared a linear relationship between fluorescence and protein concentration is observed. In this experiment, the wavelengths found to be optimal for tryptophan were used. Using these wavelengths a sample with a concentration as low as 400 ng/ml could be detected from the buffer only control. The output using the optimal wavelengths for tyrosine was considerably lower at the same sensitivity setting, yet demonstrated a similar linear relationship (data not shown).

Figure 10. BSA Concentration Curve. A series of dilutions of bovine serum albumin (BSA) were prepared with water as the diluent. After dilution, 200 µl aliquots were pipetted into microplates in replicates of 8 and the fluorescence using an excitation wavelength of 285 nm and a 340/30-emission filter. Data was collected from the top at 100 reads per well with a PMT sensitivity setting of 100.

Discussion

These data presented demonstrate that the Synergy HT TR model is capable of UV-excitation fluorescence determinations. Time-resolved fluorescence requires a light source that can either be shuttered quickly or diminishes very rapidly. Because of its nature the xenon-flash lamp is often used for time-resolved measurements due to its rapid light decay. In regards to UV fluorescence, the xenon flash lamp also offers significantly more UV light output than the tungsten-halogen lamp usually used for excitatory light. Selecting &ldquoTime-resolved&rdquo fluorescence with a Synergy HT TR enables the xenon-flash lamp, but by selecting a time delay of 0 traditional fluorescence measurements are performed which utilize the xenon-flash lamp in conjunction with a monochromator to select wavelength.

This combination allows the end-user to excite peptides in UV range with sufficient energy, while maximizing the excitatory wavelengths using the monochromator, yet still having the advantages of filter-based wavelength selection for emission wavelengths. While most of the experiments performed were carried out using amino acids, peptides and proteins which contain aromatic amino acids, can be detected as well. When measuring peptides it is important to keep in mind that the local environment of the aromatic amino acids can have an effect on their spectra. Tryptophan, the most significant fluorescence emitter, will have an emission peak at lower wavelengths if it is buried within the hydrophobic inner regions of a protein [2]. Tyrosine moieties will often transfer their energy to adjacent tryptophan amino acids, while ionized tyrosinate also demonstrates wavelengths similar to tryptophan, suggesting that for many proteins a good starting point for excitation and emission wavelengths are those for tryptophan.

The Synergy HT TR reader is an ideal reader for protein measurements. Besides using UV fluorescence to detect proteins, the UV absorbance measurement capabilities of the Synergy HT TR can be utilized. Because it has two complete optical systems for absorbance as well as one for fluorescence, either can be used to detect protein without compromise. As with all of the BioTek readers, KC4 data reduction software provides reader control as well as exceptional data reduction capabilities. Several standard curves using different curve fits were produced as part of this treatise, demonstrating some of KC4&rsquos capabilities.


Find out more about Synergy HTX
Multi-Mode Reader


NanoDrop Protein Quantification

Thermo Scientific NanoDrop UV-Vis spectrophotometers support protein sample quantification with applications for direct A280, A205 and colorimetric assays (see table 2 below). There are several things to consider when deciding which method to use to quantify your protein samples using a NanoDrop UV-Vis spectrophotometer.

Is your sample a purified protein? Purified protein samples can be accurately measured using direct absorbance at 280 nm. Absorbance at 280 nm is mostly due to the aromatic chains on the amino acids Tryptophan (Trp) and Tyrosine (Tyr). Protein A280 is the most popular quantification method because it is fast and simple, requires no reagents or standard curves, and consumes very little sample. Using the absorbance at 280nm (A280), protein concentration (c) is calculated using the Beer-Lambert equation A280 = c * ε * b (ε is the wavelength-dependent protein extinction coefficient, b is the pathlength). Each pure protein has a unique extinction coefficient. For accurate results, the correct protein extinction coefficient ε must be entered or the closest Sample Type must be selected. The NanoDrop One Protein Editor feature allows you to save the extinction coefficients of specific proteins so that you can customize your Sample Type option.

In addition to concentration, protein measurements on the NanoDrop One spectrophotometer deliver information about contaminants in the sample. The NanoDrop One Thermo Scientific™ Acclaro™ Sample Intelligence Technology uses mathematical algorithms to detect nucleic acids in protein samples and correct the concentration result as needed. Sample purity can also be assessed by looking at the A260/A280 value. An A260/A280 value >1 may indicate nucleic acid contamination in the protein sample.

Proteins in complex mixtures such as cell extracts or lysates are best measured using a protein colorimetric assay such as Bradford, BCA, Lowry ou Thermo Scientific™ Pierce™ 660nm Assay. These assays provide protein-specific concentrations, avoiding absorbance from cell components that absorb in the UV range and would inflate A280. For buffer compatibility with each assay, check the manufacturer’s product literature. The above colorimetric assays are preconfigured applications on the NanoDrop One/One C , NanoDrop 2000/2000c and NanoDrop 8000 instruments. (Table 2)


Contenu

Molecules containing bonding and non-bonding electrons (n-electrons) can absorb energy in the form of ultraviolet or visible light to excite these electrons to higher anti-bonding molecular orbitals. [2] The more easily excited the electrons (i.e. lower energy gap between the HOMO and the LUMO), the longer the wavelength of light it can absorb. There are four possible types of transitions (π–π*, n–π*, σ–σ*, and n–σ*), and they can be ordered as follows :σ–σ* > n–σ* > π–π* > n–π*. [ citation requise ]

UV/Vis spectroscopy is routinely used in analytical chemistry for the quantitative determination of different analytes, such as transition metal ions, highly conjugated organic compounds, and biological macromolecules. Spectroscopic analysis is commonly carried out in solutions but solids and gases may also be studied.

  • Solutions of transition metal ions can be colored (i.e., absorb visible light) because d electrons within the metal atoms can be excited from one electronic state to another. The colour of metal ion solutions is strongly affected by the presence of other species, such as certain anions or ligands. For instance, the colour of a dilute solution of copper sulfate is a very light blue adding ammonia intensifies the colour and changes the wavelength of maximum absorption (λmax). , especially those with a high degree of conjugation, also absorb light in the UV or visible regions of the electromagnetic spectrum. The solvents for these determinations are often water for water-soluble compounds, or ethanol for organic-soluble compounds. (Organic solvents may have significant UV absorption not all solvents are suitable for use in UV spectroscopy. Ethanol absorbs very weakly at most wavelengths.) Solvent polarity and pH can affect the absorption spectrum of an organic compound. Tyrosine, for example, increases in absorption maxima and molar extinction coefficient when pH increases from 6 to 13 or when solvent polarity decreases.
  • While charge transfer complexes also give rise to colours, the colours are often too intense to be used for quantitative measurement.

The Beer–Lambert law states that the absorbance of a solution is directly proportional to the concentration of the absorbing species in the solution and the path length. [3] Thus, for a fixed path length, UV/Vis spectroscopy can be used to determine the concentration of the absorber in a solution. It is necessary to know how quickly the absorbance changes with concentration. This can be taken from references (tables of molar extinction coefficients), or more accurately, determined from a calibration curve.

A UV/Vis spectrophotometer may be used as a detector for HPLC. The presence of an analyte gives a response assumed to be proportional to the concentration. For accurate results, the instrument's response to the analyte in the unknown should be compared with the response to a standard this is very similar to the use of calibration curves. The response (e.g., peak height) for a particular concentration is known as the response factor.

The wavelengths of absorption peaks can be correlated with the types of bonds in a given molecule and are valuable in determining the functional groups within a molecule. The Woodward–Fieser rules, for instance, are a set of empirical observations used to predict λmax, the wavelength of the most intense UV/Vis absorption, for conjugated organic compounds such as dienes and ketones. The spectrum alone is not, however, a specific test for any given sample. The nature of the solvent, the pH of the solution, temperature, high electrolyte concentrations, and the presence of interfering substances can influence the absorption spectrum. Experimental variations such as the slit width (effective bandwidth) of the spectrophotometer will also alter the spectrum. To apply UV/Vis spectroscopy to analysis, these variables must be controlled or accounted for in order to identify the substances present. [4]

The method is most often used in a quantitative way to determine concentrations of an absorbing species in solution, using the Beer–Lambert law:

UNE is the measured absorbance (in Absorbance Units (AU)), I 0 > is the intensity of the incident light at a given wavelength, I is the transmitted intensity, L the path length through the sample, and c the concentration of the absorbing species. For each species and wavelength, ε is a constant known as the molar absorptivity or extinction coefficient. This constant is a fundamental molecular property in a given solvent, at a particular temperature and pressure, and has units of 1 / M ∗ c m .

The absorbance and extinction ?? are sometimes defined in terms of the natural logarithm instead of the base-10 logarithm.

The Beer–Lambert Law is useful for characterizing many compounds but does not hold as a universal relationship for the concentration and absorption of all substances. A 2nd order polynomial relationship between absorption and concentration is sometimes encountered for very large, complex molecules such as organic dyes (Xylenol Orange or Neutral Red, for example). [ citation requise ]

UV–Vis spectroscopy is also used in the semiconductor industry to measure the thickness and optical properties of thin films on a wafer. UV–Vis spectrometers are used to measure the reflectance of light, and can be analyzed via the Forouhi–Bloomer dispersion equations to determine the Index of Refraction (n) and the Extinction Coefficient (k) of a given film across the measured spectral range. [ citation requise ]

Practical considerations Edit

The Beer–Lambert law has implicit assumptions that must be met experimentally for it to apply otherwise there is a possibility of deviations from the law. [5] For instance, the chemical makeup and physical environment of the sample can alter its extinction coefficient. The chemical and physical conditions of a test sample therefore must match reference measurements for conclusions to be valid. Worldwide, pharmacopoeias such as the American (USP) and European (Ph. Eur.) pharmacopeias demand that spectrophotometers perform according to strict regulatory requirements encompassing factors such as stray light [6] and wavelength accuracy. [7]

Spectral bandwidth Edit

It is important to have a monochromatic source of radiation for the light incident on the sample cell. [5] Monochromaticity is measured as the width of the "triangle" formed by the intensity spike, at one half of the peak intensity. A given spectrometer has a spectral bandwidth that characterizes how monochromatic the incident light is. [ éclaircissements nécessaires ] If this bandwidth is comparable to (or more than) the width of the absorption line, then the measured extinction coefficient will be mistaken. In reference measurements, the instrument bandwidth (bandwidth of the incident light) is kept below the width of the spectral lines. When a test material is being measured, the bandwidth of the incident light should also be sufficiently narrow. Reducing the spectral bandwidth reduces the energy passed to the detector and will, therefore, require a longer measurement time to achieve the same signal to noise ratio.

Wavelength error Edit

In liquids, the extinction coefficient usually changes slowly with wavelength. A peak of the absorbance curve (a wavelength where the absorbance reaches a maximum) is where the rate of change in absorbance with wavelength is smallest. [5] Measurements are usually made at a peak to minimize errors produced by errors in wavelength in the instrument, that is errors due to having a different extinction coefficient than assumed.

Stray light Edit

Another important factor is the purity of the light used. The most important factor affecting this is the stray light level of the monochromator. [5]

The detector used is broadband it responds to all the light that reaches it. If a significant amount of the light passed through the sample contains wavelengths that have much lower extinction coefficients than the nominal one, the instrument will report an incorrectly low absorbance. Any instrument will reach a point where an increase in sample concentration will not result in an increase in the reported absorbance, because the detector is simply responding to the stray light. In practice the concentration of the sample or the optical path length must be adjusted to place the unknown absorbance within a range that is valid for the instrument. Sometimes an empirical calibration function is developed, using known concentrations of the sample, to allow measurements into the region where the instrument is becoming non-linear.

As a rough guide, an instrument with a single monochromator would typically have a stray light level corresponding to about 3 Absorbance Units (AU), which would make measurements above about 2 AU problematic. A more complex instrument with a double monochromator would have a stray light level corresponding to about 6 AU, which would therefore allow measuring a much wider absorbance range.

Deviations from the Beer–Lambert law Edit

At sufficiently high concentrations, the absorption bands will saturate and show absorption flattening. The absorption peak appears to flatten because close to 100% of the light is already being absorbed. The concentration at which this occurs depends on the particular compound being measured. One test that can be used to test for this effect is to vary the path length of the measurement. In the Beer–Lambert law, varying concentration and path length has an equivalent effect—diluting a solution by a factor of 10 has the same effect as shortening the path length by a factor of 10. If cells of different path lengths are available, testing if this relationship holds true is one way to judge if absorption flattening is occurring.

Solutions that are not homogeneous can show deviations from the Beer–Lambert law because of the phenomenon of absorption flattening. This can happen, for instance, where the absorbing substance is located within suspended particles. [8] [9] The deviations will be most noticeable under conditions of low concentration and high absorbance. The last reference describes a way to correct for this deviation.

Some solutions, like copper(II)chloride in water, change visually at a certain concentration because of changed conditions around the coloured ion (the divalent copper ion). For copper(II)chloride it means a shift from blue to green, [10] which would mean that monochromatic measurements would deviate from the Beer–Lambert law.

Measurement uncertainty sources Edit

The above factors contribute to the measurement uncertainty of the results obtained with UV/Vis spectrophotometry. If UV/Vis spectrophotometry is used in quantitative chemical analysis then the results are additionally affected by uncertainty sources arising from the nature of the compounds and/or solutions that are measured. These include spectral interferences caused by absorption band overlap, fading of the color of the absorbing species (caused by decomposition or reaction) and possible composition mismatch between the sample and the calibration solution. [11]

The basic parts of a spectrophotometer are a light source, a holder for the sample, a diffraction grating in a monochromator or a prism to separate the different wavelengths of light, and a detector. The radiation source is often a Tungsten filament (300–2500 nm), a deuterium arc lamp, which is continuous over the ultraviolet region (190–400 nm), Xenon arc lamp, which is continuous from 160 to 2,000 nm or more recently, light emitting diodes (LED) [1] for the visible wavelengths. The detector is typically a photomultiplier tube, a photodiode, a photodiode array or a charge-coupled device (CCD). Single photodiode detectors and photomultiplier tubes are used with scanning monochromators, which filter the light so that only light of a single wavelength reaches the detector at one time. The scanning monochromator moves the diffraction grating to "step-through" each wavelength so that its intensity may be measured as a function of wavelength. Fixed monochromators are used with CCDs and photodiode arrays. As both of these devices consist of many detectors grouped into one or two dimensional arrays, they are able to collect light of different wavelengths on different pixels or groups of pixels simultaneously.

A spectrophotometer can be either single beam ou double beam. In a single beam instrument (such as the Spectronic 20), all of the light passes through the sample cell. I o > must be measured by removing the sample. This was the earliest design and is still in common use in both teaching and industrial labs.

In a double-beam instrument, the light is split into two beams before it reaches the sample. One beam is used as the reference the other beam passes through the sample. The reference beam intensity is taken as 100% Transmission (or 0 Absorbance), and the measurement displayed is the ratio of the two beam intensities. Some double-beam instruments have two detectors (photodiodes), and the sample and reference beam are measured at the same time. In other instruments, the two beams pass through a beam chopper, which blocks one beam at a time. The detector alternates between measuring the sample beam and the reference beam in synchronism with the chopper. There may also be one or more dark intervals in the chopper cycle. In this case, the measured beam intensities may be corrected by subtracting the intensity measured in the dark interval before the ratio is taken.

In a single-beam instrument, the cuvette containing only a solvent has to be measured first. Mettler Toledo developed a single beam array spectrophotometer that allows fast and accurate measurements over the UV/VIS range. The light source consists of a Xenon flash lamp for the ultraviolet (UV) as well as for the visible (VIS) and near-infrared wavelength regions covering a spectral range from 190 up to 1100 nm. The lamp flashes are focused on a glass fiber which drives the beam of light onto a cuvette containing the sample solution. The beam passes through the sample and specific wavelengths are absorbed by the sample components. The remaining light is collected after the cuvette by a glass fiber and driven into a spectrograph. The spectrograph consists of a diffraction grating that separates the light into the different wavelengths, and a CCD sensor to record the data, respectively. The whole spectrum is thus simultaneously measured, allowing for fast recording. [12]

Samples for UV/Vis spectrophotometry are most often liquids, although the absorbance of gases and even of solids can also be measured. Samples are typically placed in a transparent cell, known as a cuvette. Cuvettes are typically rectangular in shape, commonly with an internal width of 1 cm. (This width becomes the path length, L , in the Beer–Lambert law.) Test tubes can also be used as cuvettes in some instruments. The type of sample container used must allow radiation to pass over the spectral region of interest. The most widely applicable cuvettes are made of high quality fused silica or quartz glass because these are transparent throughout the UV, visible and near infrared regions. Glass and plastic cuvettes are also common, although glass and most plastics absorb in the UV, which limits their usefulness to visible wavelengths. [1]

Specialized instruments have also been made. These include attaching spectrophotometers to telescopes to measure the spectra of astronomical features. UV–visible microspectrophotometers consist of a UV–visible microscope integrated with a UV–visible spectrophotometer.

A complete spectrum of the absorption at all wavelengths of interest can often be produced directly by a more sophisticated spectrophotometer. In simpler instruments the absorption is determined one wavelength at a time and then compiled into a spectrum by the operator. By removing the concentration dependence, the extinction coefficient (ε) can be determined as a function of wavelength.

UV–visible spectroscopy of microscopic samples is done by integrating an optical microscope with UV–visible optics, white light sources, a monochromator, and a sensitive detector such as a charge-coupled device (CCD) or photomultiplier tube (PMT). As only a single optical path is available, these are single beam instruments. Modern instruments are capable of measuring UV–visible spectra in both reflectance and transmission of micron-scale sampling areas. The advantages of using such instruments is that they are able to measure microscopic samples but are also able to measure the spectra of larger samples with high spatial resolution. As such, they are used in the forensic laboratory to analyze the dyes and pigments in individual textile fibers, [13] microscopic paint chips [14] and the color of glass fragments. They are also used in materials science and biological research and for determining the energy content of coal and petroleum source rock by measuring the vitrinite reflectance. Microspectrophotometers are used in the semiconductor and micro-optics industries for monitoring the thickness of thin films after they have been deposited. In the semiconductor industry, they are used because the critical dimensions of circuitry is microscopic. A typical test of a semiconductor wafer would entail the acquisition of spectra from many points on a patterned or unpatterned wafer. The thickness of the deposited films may be calculated from the interference pattern of the spectra. In addition, ultraviolet–visible spectrophotometry can be used to determine the thickness, along with the refractive index and extinction coefficient of thin films as described in Refractive index and extinction coefficient of thin film materials. A map of the film thickness across the entire wafer can then be generated and used for quality control purposes. [15]

UV/Vis can be applied to determine the kinetics or rate constant of a chemical reaction. The reaction, occurring in solution, must present color or brightness shifts from reactants to products in order to use UV/Vis for this application. [2] For example, the molecule mercury dithizonate is a yellow-orange color in diluted solution (1*10^-5 M), and turns blue when subjected with particular wavelengths of visible light (and UV) via a conformational change, but this reaction is reversible back into the yellow "ground state". [16]

Using optical fibers as a transmission element of spectrum of burning gases it is possible to determine a chemical composition of a fuel, temperature of gases, and air-fuel ratio. [17]

The rate constant of a particular reaction can be determined by measuring the UV/Vis absorbance spectrum at specific time intervals. Using mercury dithizonate again as an example, one can shine light on the sample to turn the solution blue, then run a UV/Vis test every 10 seconds (variable) to see the levels of absorbed and reflected wavelengths change over time in accordance with the solution turning back to yellow from the excited blue energy state. From these measurements, the concentration of the two species can be calculated. [18] The mercury dithizonate reaction from one conformation to another is first order and would have the integral first order rate law : ln[A](time t)=−kt+ln[A](initial). Therefore, graphing the natural log (ln) of the concentration [A] versus time will graph a line with slope -k, or negative the rate constant. Different rate orders have different integrated rate laws depending on the mechanism of the reaction.

An equilibrium constant can also be calculated with UV/Vis spectroscopy. After determining optimal wavelengths for all species involved in equilibria, a reaction can be run to equilibrium, and the concentration of species determined from spectroscopy at various known wavelengths. The equilibrium constant can be calculated as K(eq) = [Products] / [Reactants].


Shimadzu US launch for UV-VIS Spectrophotometer

Shimadzu's UV-1280 UV-visible spectrophotometer

The instrument, launched in November last year, can be used for photometric, spectral, and kinetics measurements to DNA/protein and high-level multi-component quantitation.

It offers wavelength scanning from 190 to 1,100nm and the monitored system for the D2/WI lamps ensures that users can perform stable measurements.

Use in food quality settings

Mark Talbott, molecular spectroscopy product manager at Shimadzu Scientific Instruments, said it can be used for applications in environmental and food quality.

“One application is the analysis of food coloring, for instance sulphur dioxide analysis in white wine (SO2 absorbs in the same region as red wine so the analysis is nut for red wines),” ​he told FoodQualityNews.​

“You could also do quality analysis/quality control (QA/QC) of food products such as sugar water concentrations, syrup concentrations, etc.”

Talbott said mechanically, the 190 to 1100 range allows the use of a silicon diode detector of a photomultipliers (PMT).

“PMT require choppers and high power supplies – more parts to wear out or introduce noise. The silicon diode systems, although less sensitive, are simpler and ultimately more robust for the QA/QC type environments.”

When asked how the method compares to others such as fluorescence, infrared (IR) and Raman spectroscopy, Talbott said it depends on the chemistry.

“UV-Vis analyzes compounds with chromaphores – that is, double bonds or highly colored complexometric titrametric reactions – usually with a complexing agent such as ethylenediaminetetraacetic acid,” ​he said.


Utilizing Neutral Density Filters To Calibrate Spectrophotometer

For decades liquid calibration standards have been utilized. Starting in 2010, solid-state filters commenced replacing the liquid filters due to their potential never to be re-calibrated or replaced. Solid neutral density filters are also effortless to manage and will not break if they are accidentally dropped or mishandled.

The solid-state spectrophotometer calibration’s neutral density filters can be checked for photometric accuracy as well as stray light. To make sure a hundred accuracy, testing is performed at a minimum of 5 checkpoints. These spectrophotometer calibration filters can be used to calibrate devices made by Thermo Scientific, Beckman Coulter, Hitachi, Perkin Elmer, Hewlett Packard, Agilent, Shimadzu and far more.


Measuring the protein content using UV Vis - Biology

USING UV-VISIBLE ABSORPTION SPECTRA

This page takes a brief look at how UV-visible absorption spectra can be used to help identify compounds and to measure the concentrations of coloured solutions. It assumes that you know how these spectra arise, and know what is meant by terms such as absorbance, molar absorptivity and lambda-max. You also need to be familiar with the Beer-Lambert Law.

Important: If you don't know about these things, this page is a waste of your time! Explore the rest of the UV-visible spectroscopy menu before you go on.

Using UV-absorption spectra to help identify organic compounds

If you have worked through the rest of this section, you will know that the wavelength of maximum absorption (lambda-max) depends on the presence of particular chromophores (light-absorbing groups) in a molecule.

For example, on another page you will have come across the fact that a simple carbon-carbon double bond (for example in ethene) has a maximum absorption at 171 nm. The two conjugated double bonds in buta-1,3-diene have a maximum absorption at a longer wavelength of 217 nm.

We also talked about the two peaks in the spectrum of ethanal (containing a simple carbon-oxygen double bond) at 180 and 290 nm.

In carefully chosen simple cases (which is all you will get at this level), if you compared the peaks on a given UV-visible absorption spectrum with a list of known peaks, it would be fairly easy to pick out some structural features of an unknown molecule.

Lists of known peaks often include molar absorptivity values as well. That might help you to be even more sure. For example (again using the simple carbon-oxygen double bond), data shows that the peak at 290 has a molar absorptivity of only 15, compared with the one at 180 of 10000.

If your spectrum showed a very large peak at 180, and an extremely small one at 290, that just adds to your certainty.

Any question set at this level is going to be so trivial, and so obvious, that it isn't worth spending any more time on this. Let's look at something a bit more complicated!

Using UV-absorption spectra to find concentrations

You should remember the Beer-Lambert Law:

The expression on the left of the equation is known as the absorbance of the solution and is measured by a spectrometer. The equation is sometimes written in terms of that absorbance.

The symbol epsilon is the molar absorptivity of the solution.

Noter: You will find this all explained in more detail on the page about the Beer-Lambert Law.

Finding concentration using the molar absorptivity

If you know the molar absorptivity of a solution at a particular wavelength, and you measure the absorbance of the solution at that wavelength, it is easy to calculate the concentration. The only other variable in the expression above is the length of the solution. That's easy to measure and, in fact, the cell containing the solution may well have been manufactured with a known length of 1 cm.

For example, let's suppose you have a solution in a cell of length 1 cm. You measure the absorbance of the solution at a particular wavelength using a spectrometer. The value is 1.92. You find a value for molar absorptivity in a table of 19400 for that wavelength.

Substituting those values:

Notice what a very low concentration can be measured provided you are working with a substance with a very high molar absorptivity.

This method, of course, depends on you having access to an accurate value of molar absorptivity. It also assumes that the Beer-Lambert Law works over the whole concentration range (not true!).

It is much better to measure the concentration by plotting a calibration curve. It saves doing any calculations for one thing!

Finding concentration by plotting a calibration curve

Doing it this way you don't have to rely on a value of molar absorptivity, the reliability of the Beer-Lambert Law, or even know the dimensions of the cell containing the solution.

What you do is make up a number of solutions of the compound you are investigating - each of accurately known concentration. Those concentrations should bracket the concentration you are trying to find - some less concentrated some more concentrated. With coloured solutions, this isn't a problem. You would just make up solutions of accurately known concentrations some of which are a bit lighter and some a bit darker in colour.

For each solution, you measure the absorbance at the wavelength of strongest absorption - using the same container for each one. Then you plot a graph of that absorbance against concentration. This is a calibration curve.

According to the Beer-Lambert Law, absorbance is proportional to concentration, and so you would expect a straight line. That is true as long as the solutions are dilute, but the Law breaks down for solutions of higher concentration, and so you might get a curve under these circumstances.

As long as you are working from values either side of the one you are trying to find, that isn't a problem.

Having drawn a best fit line, the calibration curve will probably look something like the next diagram. (I've drawn it as a straight line because it is easier for me to draw than a curve(!), and it's what you will probably get if you are working with really dilute solutions. But if it turns out to be a curve, so be it!)

Notice that no attempt has been made to force the line back through the origin. If the Beer-Lambert Law worked perfectly, it aurait pass through the origin, but you can't guarantee that it is working properly at the concentrations you are using.

Now all you have to do is to measure the absorbance of the solution with the unknown concentration at the same wavelength. If, for example, it had an absorbance of 0.600, you can just read the corresponding concentration from the graph as below.

Des questions pour tester votre compréhension

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Voir la vidéo: SPECTROPHOTOMÉTRIE UV-VISIBLE: LOI DE BEER-LAMBERT appliquée au DOSAGE DES PROTÉINES (Décembre 2021).