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Technique d'amplification de protéines similaire à la PCR pour l'ADN ?


Je sais que la PCR peut être utilisée pour amplifier un petit échantillon d'ADN afin de réaliser des expériences. Existe-t-il une technique similaire à utiliser sur un échantillon de protéine ? Plus précisément, je ne suis pas intéressé à "découper" la protéine, mais simplement à faire plus de l'échantillon d'origine.


Il n'y a pas de technique à une exception près. La PCR génère de l'ADN à partir de l'ADN afin que vous puissiez établir des cycles. Pour la synthèse des protéines, un ARNm est un modèle pour produire des protéines. Il est fort probable que les protéines qui vous intéressent ne synthétiseraient pas d'ARNm, de sorte que vous ne pouvez pas établir de cycles.

L'exception que j'ai mentionnée plus tôt est l'amplification cyclique de repliement des protéines (PMCA). Certaines protéines de mauvais repliement associées à une maladie peuvent induire un mauvais repliement du même polypeptide qui n'est pas mal replié. Ainsi, vous pouvez établir des cycles de réaction de mauvais repliement.

PS :

Il existe des techniques pour synthétiser des protéines à partir d'ADN ou d'ARN, mais ce ne sont pas des réactions en chaîne. https://www.promega.com/products/protein-expression/eukaryotic-cell-free-protein-expression/ https://www.neb.com/products/e6800-purexpress-invitro-protéine-synthèse-kit


Il est impossible d'amplifier une protéine comme la PCR. L'ADN et l'ARN peuvent subir une PCR car les paires de bases sont complémentaires : A-T C-G A-U. Mais les acides aminés ne sont pas complémentaires ; pouvez-vous trouver un acide aminé qui correspond à la glycine ? En outre, les protéines ne sont pas seulement une chaîne polypeptidique unique comme l'ADN, les protéines doivent être repliées après la synthèse de la chaîne polypeptidique. Habituellement, une molécule de protéine a besoin de plus d'une chaîne polypeptidique pour se combiner pour former une molécule de protéine. Il ne peut pas arriver que cela fonctionne en PCR.


Je dirais que l'impossible est exagéré. Un biochimiste inventif pourrait créer des molécules "complémentaires" à chaque acide aminé similaire à une ADN polymérase. Ensuite, une protéine serait nécessaire à la fois pour détecter et traduire cette similitude en allongement de la protéine. Peu probable, bon sang oui, impossible, non.


Distinguer les techniques de base utilisées pour manipuler l'ADN et l'ARN

  • La première étape pour étudier ou travailler avec des acides nucléiques comprend l'isolement ou l'extraction d'ADN ou d'ARN à partir de cellules.
  • L'électrophorèse sur gel dépend des ions chargés négativement présents sur les acides nucléiques à pH neutre ou basique pour séparer les molécules en fonction de leur taille.
  • Des régions spécifiques de l'ADN peuvent être amplifiées grâce à l'utilisation de la réaction en chaîne par polymérase pour une analyse plus approfondie.
  • Le transfert de Southern implique le transfert d'ADN sur une membrane de nylon, tandis que le transfert de Northern est le transfert d'ARN sur une membrane de nylon. Ces techniques permettent de sonder les échantillons pour détecter la présence de certaines séquences.

Analyse moléculaire de l'ADN

Dans cette sous-section, nous décrirons certaines des méthodes de base utilisées pour séparer et visualiser des fragments spécifiques d'ADN qui intéressent un scientifique. Certaines de ces méthodes ne nécessitent pas la connaissance de la séquence complète de la molécule d'ADN. Avant l'avènement du séquençage rapide de l'ADN, ces méthodes étaient les seules disponibles pour travailler avec l'ADN, mais elles constituent toujours l'arsenal de base des outils utilisés par les généticiens moléculaires pour étudier les réponses du corps aux maladies microbiennes et autres.

Sondage d'acide nucléique

Les molécules d'ADN sont petites et les informations contenues dans leur séquence sont invisibles. Comment un chercheur isole-t-il un tronçon particulier d'ADN, ou l'ayant isolé, détermine-t-il de quel organisme il provient, quelle est sa séquence ou quelle est sa fonction ? Une méthode pour identifier la présence d'une certaine séquence d'ADN utilise des morceaux d'ADN construits artificiellement appelés sondes. Les sondes peuvent être utilisées pour identifier différentes espèces bactériennes dans l'environnement et de nombreuses sondes ADN sont désormais disponibles pour détecter les agents pathogènes en clinique. Par exemple, des sondes ADN sont utilisées pour détecter les agents pathogènes vaginaux Candida albicans, Gardnerella vaginalis, et Trichomonas vaginalis.

Pour cribler une bibliothèque génomique pour un gène ou une séquence d'intérêt particulier, les chercheurs doivent savoir quelque chose sur ce gène. Si les chercheurs ont une partie de la séquence d'ADN du gène d'intérêt, ils peuvent concevoir un sonde ADN, un fragment d'ADN simple brin complémentaire d'une partie du gène d'intérêt et différent des autres séquences d'ADN de l'échantillon. La sonde d'ADN peut être synthétisée chimiquement par des laboratoires commerciaux, ou elle peut être créée par clonage, isolement et dénaturation d'un fragment d'ADN d'un organisme vivant. Dans les deux cas, la sonde ADN doit être marquée avec une étiquette moléculaire ou une balise, telle qu'un atome de phosphore radioactif (comme c'est le cas pour autoradiographie) ou un colorant fluorescent (tel qu'il est utilisé dans les in situ hybridation, ou FISH), de sorte que la sonde et l'ADN auquel elle se lie soient visibles (Figure 1). L'échantillon d'ADN à sonder doit également être dénaturé pour le rendre monocaténaire de sorte que la sonde d'ADN monocaténaire puisse s'hybrider à l'échantillon d'ADN monocaténaire à des emplacements où leurs séquences sont complémentaires. Bien que ces techniques soient précieuses pour le diagnostic, leur utilisation directe sur les expectorations et d'autres échantillons corporels peut être problématique en raison de la nature complexe de ces échantillons. L'ADN doit souvent d'abord être isolé à partir d'échantillons corporels par des méthodes d'extraction chimique avant qu'une sonde d'ADN puisse être utilisée pour identifier les agents pathogènes.

Figure 1. Des sondes ADN peuvent être utilisées pour confirmer la présence d'un agent pathogène suspecté dans les échantillons de patients. Ce diagramme illustre comment une sonde d'ADN peut être utilisée pour rechercher un gène d'intérêt associé à l'agent pathogène suspecté.

Focus clinique : Karni, partie 2

Cet exemple continue l'histoire de Karni qui a commencé dans Microbes and the Tools of Genetic Engineering.

Les symptômes bénins ressemblant à ceux de la grippe que connaît Karni pourraient être causés par un certain nombre d'agents infectieux. En outre, plusieurs maladies auto-immunes non infectieuses, telles que la sclérose en plaques, le lupus érythémateux disséminé (LED) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA), présentent également des symptômes qui correspondent aux premiers symptômes de Karni. Cependant, au cours de plusieurs semaines, les symptômes de Karni se sont aggravés. Elle a commencé à ressentir des douleurs articulaires dans ses genoux, des palpitations cardiaques et une étrange mollesse dans ses muscles faciaux. De plus, elle souffrait d'une raideur de la nuque et de maux de tête douloureux. À contrecœur, elle a décidé qu'il était temps de consulter un médecin.

  • Les nouveaux symptômes de Karni fournissent-ils des indices sur le type d'infection ou d'autres conditions médicales qu'elle pourrait avoir ?
  • Quels tests ou outils un fournisseur de soins de santé pourrait-il utiliser pour identifier l'agent pathogène à l'origine des symptômes de Karni ?

Nous reviendrons sur l'exemple de Karni plus loin sur cette page.

Électrophorèse sur gel d'agarose

Il existe un certain nombre de situations dans lesquelles un chercheur peut vouloir séparer physiquement une collection de fragments d'ADN de différentes tailles. Un chercheur peut également digérer un échantillon d'ADN avec une enzyme de restriction pour former des fragments. La taille résultante et le modèle de distribution des fragments peuvent souvent fournir des informations utiles sur la séquence des bases d'ADN qui peuvent être utilisées, un peu comme un balayage de code à barres, pour identifier l'individu ou l'espèce à laquelle appartient l'ADN.

L'électrophorèse sur gel est une technique couramment utilisée pour séparer des molécules biologiques en fonction de leur taille et de leurs caractéristiques biochimiques, telles que la charge et la polarité. Électrophorèse sur gel d'agarose est largement utilisé pour séparer l'ADN (ou l'ARN) de différentes tailles qui peuvent être générés par digestion par des enzymes de restriction ou par d'autres moyens, tels que la PCR (Figure 2).

En raison de son squelette chargé négativement, l'ADN est fortement attiré par une électrode positive. Dans l'électrophorèse sur gel d'agarose, le gel est orienté horizontalement dans une solution tampon. Les échantillons sont chargés dans des puits d'échantillon sur le côté du gel le plus proche de l'électrode négative, puis aspirés à travers le tamis moléculaire de la matrice d'agarose vers l'électrode positive. La matrice d'agarose empêche le mouvement des molécules plus grosses à travers le gel, tandis que les molécules plus petites le traversent plus facilement. Ainsi, la distance de migration est inversement corrélée à la taille du fragment d'ADN, les fragments plus petits parcourant une plus longue distance à travers le gel. Les tailles des fragments d'ADN dans un échantillon peuvent être estimées par comparaison avec des fragments de taille connue dans un échantillon. échelle d'ADN fonctionnent également sur le même gel. Pour séparer de très gros fragments d'ADN, tels que des chromosomes ou des génomes viraux, l'électrophorèse sur gel d'agarose peut être modifiée en alternant périodiquement l'orientation du champ électrique pendant électrophorèse sur gel en champ pulsé (PFGE). Dans PFGE, les fragments plus petits peuvent se réorienter et migrer légèrement plus rapidement que les fragments plus gros et cette technique peut donc servir à séparer de très gros fragments qui autrement voyageraient ensemble pendant l'électrophorèse sur gel d'agarose standard. Dans n'importe laquelle de ces techniques d'électrophorèse, les emplacements des fragments d'ADN ou d'ARN dans le gel peuvent être détectés par diverses méthodes. Une méthode courante consiste à ajouter le bromure d'éthidium, une tache qui s'insère dans les acides nucléiques à des emplacements non spécifiques et peut être visualisée lorsqu'elle est exposée à la lumière ultraviolette. D'autres colorants plus sûrs que le bromure d'éthidium, un cancérogène potentiel, sont maintenant disponibles.

Figure 2. Cliquez pour une image plus grande. (a) Le processus d'électrophorèse sur gel d'agarose. (b) Un chercheur charge des échantillons dans un gel. (c) Cette photographie montre une électrophorèse terminée sur un gel d'agarose. L'échelle d'ADN est située dans les pistes 1 et 9. Sept échantillons sont situés dans les pistes 2 à 8. Le gel a été coloré au bromure d'éthidium et photographié sous lumière ultraviolette. (crédit a : modification du travail par Magnus Manske crédit b : modification du travail par le U.S. Department of Agriculture crédit c : modification du travail par James Jacob)

Analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP)

Les sites de reconnaissance des enzymes de restriction sont courts (seulement quelques nucléotides de long), des palindromes spécifiques à la séquence et peuvent être trouvés dans tout le génome. Ainsi, des différences dans les séquences d'ADN dans les génomes des individus conduiront à des différences dans la distribution des sites de reconnaissance d'enzymes de restriction qui peuvent être visualisés sous forme de motifs de bandes distincts sur un gel après électrophorèse sur gel d'agarose. Polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) L'analyse compare les profils de bandes d'ADN de différents échantillons d'ADN après digestion par restriction (Figure 3).

Figure 3. L'analyse RFLP peut être utilisée pour différencier les séquences d'ADN. Dans cet exemple, un chromosome normal est digéré en deux fragments, alors que la digestion d'un chromosome muté ne produit qu'un seul fragment. Les petites flèches rouges pointant vers les deux segments chromosomiques différents montrent les emplacements des sites de reconnaissance des enzymes de restriction. Après digestion et électrophorèse sur gel d'agarose, les motifs de bandes reflètent le changement en montrant la perte de deux bandes plus courtes et le gain d'une bande plus longue. (crédit : modification des travaux par le National Center for Biotechnology Information)

Analyse RFLP a de nombreuses applications pratiques en médecine et médecine légale. Par exemple, les épidémiologistes utilisent l'analyse RFLP pour suivre et identifier la source de micro-organismes spécifiques impliqués dans les épidémies d'intoxication alimentaire ou de certaines maladies infectieuses. L'analyse RFLP peut également être utilisée sur l'ADN humain pour déterminer les schémas héréditaires de chromosomes avec des gènes variants, y compris ceux associés à des maladies héréditaires ou pour établir paternité.

Les médecins légistes utilisent l'analyse RFLP comme une forme de empreinte génétique, qui est utile pour analyser l'ADN obtenu à partir de scènes de crime, de suspects et de victimes. Des échantillons d'ADN sont collectés, le nombre de copies des molécules d'ADN de l'échantillon est augmenté à l'aide PCR, puis soumis à une digestion par des enzymes de restriction et à une électrophorèse sur gel d'agarose pour générer des motifs de bandes spécifiques. En comparant les modèles de bandes des échantillons prélevés sur les lieux du crime avec ceux prélevés sur les suspects ou les victimes, les enquêteurs peuvent déterminer avec certitude si les preuves ADN recueillies sur les lieux ont été laissées par des suspects ou des victimes.

Southern blots et modifications

Plusieurs techniques moléculaires capitalisent sur la complémentarité des séquences et l'hybridation entre les acides nucléiques d'un échantillon et des sondes d'ADN. Typiquement, le sondage d'échantillons d'acides nucléiques à l'intérieur d'un gel est infructueux car lorsque la sonde d'ADN pénètre dans un gel, les acides nucléiques d'échantillons à l'intérieur du gel se diffusent. Ainsi, les techniques de transfert sont couramment utilisées pour transférer des acides nucléiques sur une fine membrane chargée positivement en nitrocellulose ou en nylon. Dans le tache sud technique, développée par Sir Edwin Du sud en 1975, les fragments d'ADN contenus dans un échantillon sont d'abord séparés par électrophorèse sur gel d'agarose, puis transférés sur une membrane par capillarité (Figure 4). Les fragments d'ADN qui se lient à la surface de la membrane sont ensuite exposés à une sonde d'ADN simple brin spécifique marquée avec un élément radioactif ou fluorescent. balise moléculaire pour aider à la détection. Les Southern blots peuvent être utilisés pour détecter la présence de certaines séquences d'ADN dans un échantillon d'ADN donné. Une fois que l'ADN cible à l'intérieur de la membrane est visualisé, les chercheurs peuvent découper la partie de la membrane contenant le fragment pour récupérer le fragment d'ADN d'intérêt.

Figure 4. Dans la technique de Southern blot, les fragments d'ADN sont d'abord séparés par électrophorèse sur gel d'agarose, puis transférés par capillarité sur une membrane en nylon, qui est ensuite imbibée d'une sonde d'ADN étiquetée avec une balise moléculaire pour une visualisation facile.

Les variantes du Southern blot - le dot blot, le slot blot et le spot blot - n'impliquent pas d'électrophorèse, mais concentrent plutôt l'ADN d'un échantillon dans un petit endroit sur une membrane. Après hybridation avec une sonde ADN, l'intensité du signal détecté est mesurée, permettant au chercheur d'estimer la quantité d'ADN cible présente dans l'échantillon.

UNE tache de colonie est une autre variante du Southern blot dans laquelle des colonies représentant différents clones dans une banque génomique sont transférées sur une membrane en pressant la membrane sur la plaque de culture. Les cellules sur la membrane sont lysées et la membrane peut ensuite être sondée pour déterminer quelles colonies au sein d'une banque génomique abritent le gène cible. Parce que les colonies sur la plaque sont encore en croissance, les cellules d'intérêt peuvent être isolées de la plaque.

Dans le tache du nord, une autre variante du Southern blot, l'ARN (pas l'ADN) est immobilisé sur la membrane et sondé. Les Northern blots sont généralement utilisés pour détecter la quantité d'ARNm produite par l'expression génique dans un échantillon de tissu ou d'organisme.

Analyse de puces à ADN

Une autre technique qui capitalise sur l'hybridation entre des séquences d'acides nucléiques complémentaires est appelée analyse de puces à ADN. L'analyse des puces à ADN est utile pour la comparaison des profils d'expression génique entre différents types de cellules, par exemple, des cellules infectées par un virus par rapport à des cellules non infectées, ou des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines (Figure 5).

Typiquement, l'ADN ou l'ADNc d'un échantillon expérimental est déposé sur une lame de verre à côté de séquences d'ADN connues. Chaque lame peut contenir plus de 30 000 types de fragments d'ADN différents. Fragments d'ADN distincts (englobant toute la bibliothèque génomique d'un organisme) ou ADNc les fragments (correspondant à l'ensemble complet des gènes exprimés d'un organisme) peuvent être repérés individuellement sur une lame de verre.

Une fois déposé sur la lame, l'ADN génomique ou l'ARNm peuvent être isolés des deux échantillons à des fins de comparaison. Si l'ARNm est isolé, il est rétro-transcrit en ADNc à l'aide de la transcriptase inverse. Ensuite, les deux échantillons d'ADN génomique ou d'ADNc sont marqués avec différents colorants fluorescents (typiquement rouge et vert). Les échantillons d'ADN génomique marqués sont ensuite combinés en quantités égales, ajoutés à la puce de la puce à ADN et autorisés à s'hybrider à des points complémentaires sur la puce à ADN.

L'hybridation d'échantillons de molécules d'ADN génomique peut être surveillée en mesurant l'intensité de la fluorescence à des endroits particuliers sur la puce à ADN. Des différences dans le montant de hybridation entre les échantillons peut être facilement observé. Si les acides nucléiques d'un seul échantillon s'hybrident à un point particulier de la puce à ADN, alors ce point apparaîtra en vert ou en rouge. Cependant, si les acides nucléiques des deux échantillons s'hybrident, la tache apparaîtra jaune en raison de la combinaison des colorants rouge et vert.

Bien que la technologie des puces à ADN permette une comparaison holistique entre deux échantillons en peu de temps, elle nécessite un équipement de détection et un logiciel d'analyse sophistiqués (et coûteux). En raison du coût, cette technologie est généralement limitée aux paramètres de recherche. Les chercheurs ont utilisé l'analyse des puces à ADN pour étudier comment l'expression des gènes est affectée dans les organismes infectés par des bactéries ou des virus ou soumis à certains traitements chimiques.

Figure 5. (a) Les étapes de l'analyse des puces à ADN sont illustrées. Ici, les modèles d'expression génique sont comparés entre les cellules cancéreuses et les cellules saines. (b) Les informations sur les puces à ADN peuvent être exprimées sous forme de carte thermique. Les gènes sont affichés sur le côté gauche, différents échantillons sont affichés en bas. Les gènes exprimés uniquement dans les cellules cancéreuses sont représentés dans différentes nuances de rouge. Les gènes exprimés uniquement dans les cellules normales sont représentés dans différentes nuances de vert. Les gènes exprimés dans les cellules cancéreuses et normales sont indiqués en jaune.

Pensez-y

  • En quoi consiste une sonde ADN ?
  • Pourquoi un Southern blot est-il utilisé après l'électrophorèse sur gel d'un produit de digestion d'ADN ?

Résultats/Discussion

Nous avons appliqué le processus RPA à une grande variété de cibles dans des matrices d'ADN complexes. La polyvalence et la spécificité de la technologie sont illustrées par l'amplification de trois marqueurs génétiques, l'apolipoprotéine B (apoB), la région déterminant le sexe Y (Sry) et la porphobilinogène désaminase (PBDG), à partir d'ADN génomique humain complexe (Figure 2A). Alors que les contrôles négatifs n'ont pas produit de signal, des produits d'amplification propres de l'identité correcte (figure S4) ont été générés dans chaque échantillon contenant la matrice.

(A) Électrophorèse sur gel d'acrylamide des produits RPA à l'aide d'amorces pour trois marqueurs humains (apoB, Sry, PBDG). L'eau (-) ou 1 000 copies d'ADN génomique (+) ont servi de matrice. Dix pour cent de chaque réaction sont chargés sur le gel. Les tailles de produits attendues sont de 305, 371 et 353 paires de bases pour apoB, Sry et PBDG, respectivement.

(B) RPA en temps réel utilisant des amorces pour le locus SpoB de B. subtilis. La fluorescence lors de l'intercalation de SybrGreenI dans le produit naissant est détectée. L'ADN de B. subtilis a servi de matrice dans des réactions en triple à 10 5 (noir), 10 4 (rouge), 10 3 (jaune) ou 100 copies (vert) ou de l'eau (bleu). Le début de l'amplification dépend linéairement du logarithme du nombre de copies du modèle de départ [voir le temps d'insertion en minutes (point médian de la courbe de croissance) par rapport au log

La progression des réactions RPA peut être surveillée en temps réel par l'inclusion d'un colorant d'acide nucléique sensible (figure 2B) [8]. Ici, des amorces pour un locus dans le génome de B. subtilis ont été utilisées. L'amplification de l'ADN s'est avérée exponentielle sur une large gamme de concentrations de matrices et les résultats ont été obtenus en moins de 30 min.Le début de l'amplification dépend linéairement du logarithme du nombre de copies de modèle de départ. Les réactions effectuées en l'absence de matrice ou à de faibles concentrations de matrice ont finalement généré un signal non spécifique, un effet provoqué par un artefact dépendant de l'amorce (figure 2B, contrôle de l'eau).

Pour concevoir un système de détection RPA hautement sensible qui n'est pas affecté par les artefacts d'amorce, nous avons développé une méthode de détection basée sur une sonde (figure 3A). La sonde que nous utilisons contient un mimique de site abasique de tétrahydrofurane (THF) [9], flanqué à proximité immédiate de nucléotides modifiés avec un fluorophore et un extincteur. La fluorescence de la construction intacte est faible. Un bloc à l'extrémité 3' empêche l'oligonucléotide d'agir comme une amorce d'amplification. L'appariement de la sonde à l'ADN complémentaire permet la reconnaissance du THF par l'endonucléase IV (Nfo) spécifique double brin d'Escherichia coli [10]. Le besoin de formation d'un duplex d'ADN stable agit comme une étape supplémentaire de relecture de spécificité dans le contexte de notre approche de détection. La coupe ultérieure de la sonde sépare le complexe fluorophore/extincteur et conduit à une augmentation mesurable de la fluorescence. La réaction de clivage génère une extrémité 3' OH libre sur le reste 5' de la sonde incisée. Cet oligomère peut ensuite être allongé par la Bsu polymérase, servant ainsi d'amorce d'amplification.

(A) La génération de signal par séparation d'un fluorophore et d'un extincteur dépend de la coupure de la sonde par Nfo spécifique double brin.

(B) Disposition des amorces et des sondes par rapport aux cibles utilisées dans les figures 4 et 5. Voir le protocole S1 pour les séquences des isoformes de SARM. Un fragment PCR qui a fusionné une séquence non apparentée aux sites cibles sccIII et orfX a servi de contrôle interne.

(A) Sonde signal des réactions RPA en utilisant le jeu d'amorces orfX/sccIII (voir Figure 3). ADN de MRSAIII à 10 4 (noir, réactions 1–3), 10 3 (rouge, 4–6), 100 (jaune, 7–9), dix (vert, 10–12) ou deux (violet, 13–17 ) des copies ou de l'eau (bleu, 18-20) ont servi de modèle.

(B) Un tracé du temps d'apparition de l'amplification (défini comme le dépassement du seuil de 2,5) dans les réactions 1 à 12 de la figure 4A par rapport au logarithme du nombre de copies du modèle révèle une relation linéaire.

(A) MRSAI (vert), MRSAII (bleu foncé), ADN de MRSAIII (rouge) à dix copies, ou ADN de MSSA à 10 4 copies (bleu, contrôle négatif) ou de l'eau (jaune, turquoise, contrôles négatifs) a servi de modèle (en triple pour chaque condition de modèle). Voir la figure 3 pour la disposition des amorces et des sondes utilisées.

(B) Détection de 50 copies d'ADN de contrôle interne inclus dans les réactions en (A). Notez que deux des ensembles de contrôles négatifs (bleu, jaune) incluaient un modèle de contrôle interne, tandis qu'un ensemble de réactions (turquoise) contenait uniquement de l'eau et servait de contrôle « double négatif ».

Pour démontrer les performances de la lecture combinée RPA et sonde/nucléase, nous avons conçu des amorces et des sondes pour la détection du pathogène hospitalier commun Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (MRSA Figure 3B) [11]. La sensibilité et la reproductibilité de la RPA ont été explorées par l'amplification du chromosome de la cassette staphylococcique mec (CSC mec) locus d'intégration de l'isoforme MRSAIII (Figure 4A, voir Protocole S1 pour les séquences). Le début de l'amplification à des quantités de matrice de départ identiques de dix, 100, 1 000 ou 10 000 copies était pratiquement simultanée, démontrant la robustesse de la technique. Un tracé de l'heure de début de l'amplification par rapport au logarithme du nombre de copies de départ révèle une relation linéaire (figure 4B). À de faibles quantités de matrice (deux copies), les temps d'amplification sont répartis sur une période plus large, une réaction ne produisant aucun signal et la corrélation entre le début de l'amplification et la concentration de la matrice s'effondre. Cependant, la détection de produit dans des échantillons avec des concentrations de matrices aussi faibles soutient l'idée que la RPA peut essentiellement atteindre une sensibilité de copie de matrice unique.

La sensibilité et la spécificité élevées de la RPA permettent la conception d'une approche multiplex dans laquelle différents amplicons sont générés et détectés dans la même réaction. Trois allèles polymorphes du SCC mec région d'intégration représentent la grande majorité des génotypes de SARM connus (MRSAI à III Figure 5A) [12]. Alors qu'ils partagent le locus génomique orfX, ils diffèrent dans la séquence du SCC mec. Les éléments intégrateurs de MRSAI et II sont homologues l'un de l'autre à l'exception d'une insertion/suppression de 102 paires de bases, tandis que le SCC de MRSAIII mec est très divergente. Une amorce partagée par tous les allèles a été conçue pour la région commune (orfX), tandis que les amorces spécifiques de MRSAI/II et MRSAIII ciblent les différents SCC mec variantes (sccI/II et III, respectivement). Pour assurer la détection des trois isoformes, nous avons conçu deux sondes hautement homologues (pour tenir compte des polymorphismes) pour la région commune (SATamra1 et SATamra2). La fusion des séquences cibles des amorces sccIII et orfX à une séquence d'ADN non apparentée a créé un contrôle interne pour la réaction. Pour vérifier l'activité de chaque échantillon, l'amplification de cette construction a été suivie simultanément avec celle des cibles MRSA à l'aide d'une autre sonde de séquence appropriée et portant un couple fluorophore/quencher différent (BSFlc). Nous avons utilisé cette combinaison d'amorces et de sondes pour détecter dix copies génomiques des trois types de SARM (figure 5B). En revanche, le Staphylococcus aureus sensible à la méthicilline (MSSA 104 copies) étroitement apparenté servant de contrôle négatif n'a pas généré de signal, bien qu'il ait été amplifié par des amorces appropriées (voir Figure S5). Le contrôle interne a été détecté de manière concomitante dans tous les échantillons.

La combinaison de RPA et des sondes fluorophores/extincteurs sensibles aux nucléases décrites constitue un système d'amplification/détection d'ADN qui ne nécessiterait aucun autre équipement qu'un simple fluorimètre portable, rendant ainsi les tests d'ADN quantitatifs potentiellement accessibles dans un environnement de point de service non laboratoire. Nous avons conçu une approche de détection encore plus simple en utilisant la technologie des jauges à écoulement latéral. Ce système est souvent utilisé comme un simple dispositif de diagnostic jetable. Il utilise des paires d'anticorps spécifiques pour immobiliser et détecter des entités contenant deux marqueurs antigéniques (figure 6A). Les mélanges réactionnels (voir ci-dessous) sont appliqués sur un tampon d'échantillon imbibé de particules d'or visibles qui sont couplées à un anticorps reconnaissant un antigène. Les complexes voyagent ensuite dans un flux tampon à travers la membrane et un anticorps supplémentaire immobilisé capture le deuxième antigène. Si les antigènes sont joints dans un duplex d'ADN, une ligne colorée apparaît à un emplacement défini sur la bande. Une deuxième ligne d'anticorps immobilisés capture directement l'anticorps conjugué à l'or, qu'il soit ou non conjoint à l'autre antigène, et sert de contrôle de flux pour la bandelette. Dans une variante de notre système de détection de sonde, nous avons produit de tels complexes antigéniques doubles en couplant des oligonucléotides portant de la biotine et de la carboxyfluorescéine (FAM) dans des amplicons RPA (figure 6B). L'amorce 5'-biotinylée et son homologue opposée assurent l'amplification efficace d'une cible pour la liaison de la sonde. La sonde, comprenant un marqueur 5'-FAM, un THF interne et un groupe de blocage 3', est incisée par Nfo lors de la liaison, créant un substrat 3' OH pour l'élongation par Bsu. L'extension du reste de la sonde stabilise son interaction avec le brin opposé marqué à la biotine et produit un amplicon qui contient à la fois les antigènes, la biotine et le FAM. Le bloc THF/3′ empêche la production d'artefacts d'amorces contenant de la biotine/FAM, car le traitement des duplex authentiques par Nfo ajoute une étape critique de relecture. Nous avons utilisé une approche multiplex similaire à celle utilisée dans la figure 5 pour détecter dix copies de chacune des trois isoformes de SARM et les distinguer de MSSA (figure 6C). Comme précédemment, nous avons conçu deux sondes hautement homologues (pour tenir compte des polymorphismes) pour la région commune (Lfs1 et Lfs2). Les réactions RPA ont été suivies par l'application des mélanges réactionnels sur les tampons d'échantillons de bandes à écoulement latéral. Les échantillons contenant le modèle MRSA ont créé des amplicons biotine/FAM et généré des signaux visibles sur la ligne de détection d'antibiotine. En revanche, le contrôle négatif contenant MSSA n'a pas réussi à produire un complexe conjoint et a donné naissance à la ligne de contrôle de flux uniquement.


Détection

Les réactions NASBA peuvent être très rapides et produire une grande quantité de produit en raison de la nature de l'ARN polymérase T7, mais une grande partie du produit sera de l'ARN. La détection est généralement effectuée à l'aide d'une balise moléculaire ou d'une sonde d'hybridation similaire ciblant le produit simple brin, permettant une détection spécifique. Les réactions NASBA et TMA peuvent être extrêmement sensibles et sont utilisées dans une gamme de diagnostics cliniques, y compris ceux qui dépistent les maladies infectieuses dans l'approvisionnement en sang.


QPCR et RT-qPCR

PCR Quantitative Endpoint

La PCR et la RT-PCR sont généralement utilisées dans un format qualitatif pour évaluer des échantillons biologiques. Cependant, une grande variété d'applications, telles que la détermination de la charge virale, la mesure des réponses aux agents thérapeutiques et la caractérisation de l'expression génique, seraient améliorées par la détermination quantitative de l'abondance des cibles. Théoriquement, cela devrait être facile à réaliser, étant donné la nature exponentielle de la PCR, car une relation linéaire existe entre le nombre de cycles d'amplification et le logarithme du nombre de molécules. Dans la pratique, cependant, l'efficacité d'amplification est diminuée en raison des contaminants (inhibiteurs), des réactions compétitives, de l'épuisement du substrat, de l'inactivation de la polymérase et du réannelage de la cible. Au fur et à mesure que le nombre de cycles augmente, l'efficacité d'amplification diminue, aboutissant finalement à un effet de plateau.

Normalement, la PCR quantitative nécessite que les mesures soient prises avant la phase de plateau afin que la relation entre le nombre de cycles et de molécules soit relativement linéaire. Ce point doit être déterminé empiriquement pour différentes réactions en raison des nombreux facteurs qui peuvent affecter l'efficacité de l'amplification. Comme la mesure est prise avant le plateau de réaction, la PCR quantitative utilise moins de cycles d'amplification que la PCR basique. Cela peut poser des problèmes de détection du produit final car il y a moins de produit à détecter.

Pour surveiller l'efficacité de l'amplification, de nombreuses applications sont conçues pour inclure un standard interne dans la PCR. Une telle approche comprend une deuxième paire d'amorces qui est spécifique d'un gène "d'entretien ménager" (c'est-à-dire un gène qui a des niveaux d'expression constants parmi les échantillons comparés) dans la réaction (Gaudette et Crain, 1991 Murphy et al. 1990). L'amplification des gènes d'entretien vérifie que l'acide nucléique cible et les composants réactionnels étaient de qualité acceptable, mais ne tient pas compte des différences d'efficacité d'amplification dues aux différences de taille du produit ou d'efficacité d'hybridation des amorces entre l'étalon interne et la cible en cours de quantification.

Le concept de variation PCR&mdasha compétitive de la PCR&mdashi quantitative est une réponse à cette limitation. Dans la PCR compétitive, une quantité connue d'un modèle de contrôle est ajoutée à la réaction. Cette matrice est amplifiée en utilisant la même paire d'amorces que la molécule cible expérimentale mais donne un produit distinct (par exemple, une taille différente, un schéma de digestion de restriction, etc.). Les quantités de contrôle et de produit à tester sont comparées après amplification. Bien que ces approches contrôlent la qualité de l'acide nucléique cible, les composants du tampon et l'efficacité de l'hybridation des amorces, elles ont leurs propres limites (Siebert et Larrick, 1993 McCulloch et al. 1995), y compris le fait que beaucoup dépendent de l'analyse finale par électrophorèse.

De nombreux tests fluorescents et en phase solide existent pour mesurer la quantité de produit d'amplification généré dans chaque réaction, mais ils ne parviennent souvent pas à discriminer l'ADN amplifié d'intérêt des produits d'amplification non spécifiques. Certaines de ces analyses reposent sur des techniques de transfert, qui introduisent une autre variable en raison de l'efficacité du transfert d'acide nucléique, tandis que d'autres tests ont été développés pour éliminer le besoin d'électrophorèse sur gel tout en fournissant la spécificité requise. La PCR en temps réel, qui permet de visualiser les résultats de chaque cycle d'amplification, est un moyen courant de surmonter le besoin d'analyse par électrophorèse.

PCR quantitative en temps réel

L'utilisation de sondes ou d'amorces oligonucléotidiques marquées par fluorescence ou de colorants fluorescents de liaison à l'ADN pour détecter et quantifier un produit de PCR permet d'effectuer une PCR quantitative en temps réel. Des instruments spécialement conçus effectuent à la fois des cycles thermiques pour amplifier la cible et une détection de fluorescence pour surveiller l'accumulation de produits PCR. Les colorants de liaison à l'ADN sont faciles à utiliser mais ne font pas la différence entre les produits de PCR spécifiques et non spécifiques et ne sont pas propices aux réactions multiplex. Les sondes d'acide nucléique marquées par fluorescence ont l'avantage de ne réagir qu'avec des produits PCR spécifiques, mais elles peuvent être coûteuses et difficiles à concevoir. Certaines technologies qPCR utilisent des amorces PCR marquées par fluorescence au lieu de sondes.

L'utilisation de colorants fluorescents liant l'ADN est l'une des approches qPCR les plus simples. Le colorant est simplement ajouté à la réaction et la fluorescence est mesurée à chaque cycle de PCR. Parce que la fluorescence de ces colorants augmente considérablement en présence d'ADN double brin, la synthèse d'ADN peut être surveillée comme une augmentation du signal fluorescent. Cependant, un travail préliminaire doit souvent être effectué pour s'assurer que les conditions de PCR ne donnent qu'un produit spécifique. Dans les réactions ultérieures, l'amplification spécifique peut être vérifiée par une analyse de la courbe de fusion. Les courbes de fusion thermique sont générées en permettant à tous les produits de former de l'ADN double brin à une température plus basse (environ 60 °C) et en augmentant lentement la température jusqu'à des niveaux de dénaturation (environ 95 °C). La longueur et la séquence du produit affectent la température de fusion (Tm), de sorte que la courbe de fusion est utilisée pour caractériser l'homogénéité de l'amplicon. L'amplification non spécifique peut être identifiée par des pics larges dans la courbe de fusion ou des pics avec des valeurs de Tm inattendues. En distinguant les produits d'amplification spécifiques et non spécifiques, la courbe de fusion ajoute un aspect de contrôle qualité lors d'une utilisation en routine. La génération de courbes de fusion n'est pas possible avec les tests qui reposent sur l'activité exonucléase 5&prime&rarr3&prime de la Taq ADN polymérase, comme la technologie TaqMan® basée sur la sonde.

Certaines stratégies de qPCR utilisent des sondes d'acide nucléique complémentaires pour quantifier l'ADN cible. Ces sondes peuvent également être utilisées pour détecter des polymorphismes nucléotidiques simples (Lee et al. 1993 Bernard et al. 1998). Il existe plusieurs catégories générales de sondes PCR en temps réel, notamment les sondes d'hydrolyse, en épingle à cheveux et d'hybridation simple. Ces sondes contiennent une séquence complémentaire qui permet à la sonde de s'hybrider au produit de PCR accumulé, mais les sondes peuvent différer par le nombre et l'emplacement des reporters fluorescents.

Les sondes d'hydrolyse sont marquées avec un fluor à l'extrémité 5&prime et un quencher à l'extrémité 3&prime, et comme les deux reporters sont à proximité immédiate, le signal fluorescent est désactivé. Au cours de l'étape d'hybridation, la sonde s'hybride au produit PCR généré lors des cycles d'amplification précédents. L'hybride sonde:cible résultant est un substrat pour l'activité exonucléase 5&prime&rarr3&prime de l'ADN polymérase, qui dégrade la sonde recuite et libère le fluor (Hollande et al. 1991). Le fluor est libéré des effets de l'extincteur absorbant l'énergie, et la progression de la réaction et l'accumulation du produit PCR sont surveillées par l'augmentation résultante de la fluorescence. Avec cette approche, des expériences préliminaires doivent être effectuées avant les expériences de quantification pour montrer que le signal généré est proportionnel à la quantité de produit PCR souhaité et qu'une amplification non spécifique ne se produit pas.

Les sondes en épingle à cheveux, également appelées balises moléculaires, contiennent des répétitions inversées séparées par une séquence complémentaire de l'ADN cible. Les répétitions se recuit pour former une structure en épingle à cheveux, où le fluor à l'extrémité 5&prime et un extincteur à l'extrémité 3&prime sont à proximité immédiate, ce qui entraîne un faible signal fluorescent. La sonde en épingle à cheveux est conçue de telle sorte que la sonde se lie préférentiellement à l'ADN cible plutôt que de conserver la structure en épingle à cheveux. Au fur et à mesure que la réaction progresse, des quantités croissantes de la sonde s'hybrident au produit de PCR accumulé et, par conséquent, le fluor et l'extincteur se séparent physiquement. Le fluor n'est plus éteint et le niveau de fluorescence augmente. Un avantage de cette technique est que les sondes en épingle à cheveux sont moins susceptibles de ne pas correspondre que les sondes d'hydrolyse (Tyagi et al. 1998). Cependant, des expériences préliminaires doivent être effectuées pour montrer que le signal est spécifique du produit de PCR souhaité et qu'une amplification non spécifique ne se produit pas.

L'utilisation de sondes d'hybridation simples implique deux sondes marquées ou, en variante, une sonde marquée et une amorce PCR marquée. Dans la première approche, l'énergie émise par le fluor sur une sonde est absorbée par un fluor sur la seconde sonde, qui s'hybride à proximité. Dans la seconde approche, l'énergie émise est absorbée par un second fluor qui est incorporé dans le produit PCR en tant que partie de l'amorce. Ces deux approches entraînent une augmentation de la fluorescence de l'accepteur d'énergie et une diminution de la fluorescence du donneur d'énergie. L'utilisation de sondes d'hybridation peut être encore simplifiée de sorte qu'une seule sonde marquée est nécessaire. Dans cette approche, l'extinction du fluor par la désoxyguanosine est utilisée pour provoquer un changement de fluorescence (Crockett et Wittwer, 2001 Kurata et al. 2001). La sonde marquée s'hybride de sorte que le fluor se trouve à proximité immédiate des résidus G dans la séquence cible, et à mesure que l'annelage de la sonde augmente, la fluorescence diminue en raison de l'extinction de la désoxyguanosine. Avec cette approche, l'emplacement de la sonde est limité car la sonde doit s'hybrider de sorte que le colorant fluorescent soit très proche d'un résidu G. L'avantage des sondes d'hybridation simples est leur capacité à être multiplexées plus facilement que les sondes d'hydrolyse et les sondes en épingle à cheveux grâce à l'utilisation de fluors de couleurs différentes et de sondes avec des températures de fusion différentes (revue dans Wittwer et al. 2001).

Certaines stratégies de qPCR utilisent des sondes d'acide nucléique complémentaires pour quantifier l'ADN cible. Ces sondes peuvent également être utilisées pour détecter des polymorphismes nucléotidiques simples (Lee et al . 1993 Bernard et al . 1998). Il existe plusieurs catégories générales de sondes PCR en temps réel, notamment les sondes d'hydrolyse, en épingle à cheveux et d'hybridation simple. Ces sondes contiennent une séquence complémentaire qui permet à la sonde de s'hybrider au produit de PCR accumulé, mais les sondes peuvent différer par le nombre et l'emplacement des reporters fluorescents.

Produits et ressources qPCR

Les kits GoTaq® qPCR et RT-qPCR sont disponibles pour les approches de PCR en temps réel à base de colorant ou de sonde. Les systèmes GoTaq qPCR contiennent du colorant BRYT Green, qui offre une efficacité d'amplification maximale et une fluorescence supérieure à celle du SYBR Green.

Les systèmes de sonde GoTaq® sont des mélanges maîtres prêts à l'emploi qui simplifient l'assemblage de la réaction pour la détection par sonde d'hydrolyse.


Module 1 : Réaction en chaîne par polymérase


Bonjour à tous, voici le Dr Vishal Trivedi du département des biosciences et de la bio-ingénierie IIT Guwahati et aujourd'hui nous allons commencer un nouveau module et notre nouveau module va traiter des outils de biologie moléculaire. Ainsi, les outils de biologie moléculaire traitent normalement des molécules qui sont importantes pour la subsistance ou pour le maintien de la vie. Donc, il y a 4 molécules majeures qui sont importantes pour maintenir la vie une son ADN, la seconde est l'ARN, la troisième est la protéine et la quatrième est les lipides.
Ainsi, la biologie moléculaire traite normalement de toutes les macromolécules, en particulier l'ADN, l'ARN et les protéines. Ainsi, lorsque nous parlons d'ADN, l'ADN est amplifié avec une technique connue sous le nom de réactions en chaîne par polymérase.
(Reportez-vous à la durée de la diapositive : 01:56)
Ainsi, comme son nom l'indique, la réaction en chaîne par polymérase est une technique qui est utilisée pour amplifier un grand nombre de molécules d'ADN double brin avec la même taille et la même séquence par la méthode enzymatique et les conditions cycliques. Cela signifie que vous avez un ADN d'origine, qui est l'ADN d'origine et cet ADN d'origine est amplifié pendant plusieurs cycles.
Et c'est ainsi que vous allez réellement avoir les copies multiples comme vous avez les 4 copies multiples qui vont en fait être identiques.
Ce qui signifie que la séquence de tous ces fragments va être identique à la séquence d'origine et aussi qu'ils vont être amplifiés à l'aide des enzymes. Donc, si vous voulez comprendre le processus des réactions en chaîne par polymérase, vous devez comprendre les 2 composants de base. Premièrement, vous devez comprendre l'ADN. La seconde que vous devez comprendre à propos de la machinerie enzymatique, qu'est-ce qui est important pour amplifier l'ADN ?
Donc, commençons par comprendre l'ADN d'abord et ensuite nous allons comprendre la machinerie et ensuite nous allons aussi comprendre comment les gens ont développé la technique et ensuite nous allons aussi comprendre tous les aspects techniques liés à la polymérase changer les réactions.
(Reportez-vous à la durée de la diapositive : 03:27)
Ainsi, l'ADN est un acide nucléique et est composé des 2 chaînes de blocs de liaison nucléotidiques complémentaires, ce qui signifie que dans un ADN typique, vous avez les 2 chaînes, l'une est la 5 prime à 3 prime et la 3 prime à 5 prime. Ces deux brins sont reliés par les nucléotides présents à l'intérieur et le nucléotide est composé d'un groupe phosphate, d'un sucre à 5 carbones et d'une base azotée.
Ainsi, comme vous le savez, lorsque la base s'ajoute au sucre, elle forme en fait le nucléoside. Et lorsque le nucléoside est lié au phosphate, il est appelé nucléotide. L'ADN est donc composé de nucléotides. Donc, c'est en fait une macro molécule où vous avez la 1 chaîne de nucléotides connectée à une autre chaîne de nucléotides et ces 2 nouvelles chaînes de nucléotides sont complémentaires l'une de l'autre.
(Reportez-vous à l'heure de la diapositive : 04:47)
Donc, l'ADN a les 4 bases azotées, vous avez les 2 purines comme les 2 bases annelées comme l'adénine et la guanine. Et puis vous avez les 2 pyrimidines comme la cytosine et la thymine. Ces 2, 4 bases sont liées de manière répétée par des liaisons hydrogène entre les bases azotées. La liaison des 2 brins complémentaires s'appelle l'hybridation. Ainsi, A forme une paire avec T et G forme toujours une paire avec C.
Donc, ce que vous voyez, c'est que le A fait une paire avec T à l'aide de la liaison hydrogène 2 alors que le G fait notre liaison hydrogène avec C à l'aide de la liaison hydrogène 3, ce qui signifie, la force de A à L'interaction T est plus faible par rapport à l'interaction de G à C.
(Reportez-vous à l'heure de la diapositive : 05:46)
Et parce que A forme une paire avec T et G forme une paire avec C, l'ADN est de nature complémentaire. Ce que l'on entend par nature complémentaire, c'est que si vous avez une première séquence appelée brin primaire, vous pouvez alors déduire la séquence complémentaire. Par exemple, dans ce cas, nous avons une séquence primaire qui est GGC TAT GTG et ce que vous voyez, c'est que partout où vous avez le G a en fait un C à un brin complémentaire.
C'est ainsi que cela va effectivement maintenir la complémentarité. Comment la complémentarité va vous aider en termes de conservation des molécules parce que, si vous avez le brin 1, vous pouvez être en mesure de générer le brin 2, parce que le brin 1 est complémentaire l'un de l'autre ou si vous avez le brin 2, vous pouvez être en mesure de générer un brin 1 et c'est le principe de base sur lequel fonctionne le mécanisme PCR.
Par exemple, si j'ai cette séquence particulière et si je veux synthétiser le brin 2, ce que je peux faire, c'est simplement attacher une courte base nucléotidique, puis je peux simplement mettre une machinerie T et cette machine va en fait synthétiser les séquences complémentaires ce qui signifie que je recherche une machinerie capable de reconnaître cette séquence d'ADN, puis cette machine pourrait comprendre que l'ADN est de nature complémentaire.
Donc, ce qui se passera, c'est que si j'ai cette séquence, la machinerie va s'asseoir sur cette séquence et ensuite elle va en fait accepter le nucléotide de ce que vous allez fournir et ensuite elle va synthétiser le brin complémentaire . Et une fois arrivé à la fin du
séquence, il saura que maintenant, la synthèse est terminée. Donc, il va effectivement se terminer. Donc, maintenant, jusqu'à présent, ce que nous avons discuté, nous avons discuté de la molécule qui va en fait être amplifiée au cours des réactions en chaîne par polymérase.
Et maintenant, ce que nous allons comprendre, nous allons comprendre à propos de la machinerie de la machinerie de synthèse de l'ADN, c'est la base de la vie sur terre ou la machinerie de synthèse de l'ADN est très cruciale pour la duplication de l'ADN.
(Reportez-vous à l'heure de la diapositive : 08:23)
Et la synthèse de l'ADN est liée à la division cellulaire ainsi qu'à la croissance. C'est donc un exemple de la bactérie. Donc, ce que vous voyez, c'est que nous avons la bactérie qui a en fait une seule copie du génome du gène. Et ce qui se passera, c'est que le premier événement lui-même est que le génome va en fait se dupliquer en 2 copies. Donc, en fin de compte, il va avoir 2 copies du génome, puis il va être divisé longitudinalement et c'est ainsi que vous allez avoir les 2 colonies bactériennes.
De même, car chez le procaryote, il a les multiples événements par lesquels il passe réellement, puis il va être divisé en 2 et que tous les événements sont en fait appelés le cycle cellulaire. Quels sont ces événements ? Vous avez un G1. Donc, dans le G1, vous allez en fait augmenter la quantité de cytosol et vous allez en fait préparer la cellule pour la phase de synthèse, puis vous entrez en fait dans une phase de synthèse.
Donc, dans la phase de synthèse ou la phase S, vous allez en fait faire une synthèse d'ADN, ce qui signifie que vous allez faire une première copie d'ADN et que vous allez synthétiser la deuxième copie d'ADN, ce qui signifie que maintenant l'ADN va à dupliquer ce qui signifie que maintenant vous allez avoir les 2 génomes. Tout comme dans cette étape et maintenant il entrera dans la phase G2. G2 est également une étape préparatoire.
Donc, ici aussi, il y aura des étapes préparatoires supplémentaires. Et puis la cellule entrera dans la phase mitotique. Et dans cette phase, la cellule va se diviser en 2. Ainsi, la cellule d'origine va à nouveau suivre le cycle cellulaire alors qu'elle va en fait vous donner la 1 copie de plus de la cellule. Pour cela, si vous bloquez réellement la synthèse de l'ADN, si vous bloquez cette étape, vous allez en fait perturber le cycle cellulaire. Et c'est ainsi que vous allez réellement arrêter la multiplication ainsi que la croissance d'une cellule particulière.
(Reportez-vous à la durée de la diapositive : 10:37)
Donc, processus de duplication de l'ensemble du génome avant la division cellulaire. La réplication de l'ADN est donc un processus qui se produit dans la cellule avant la duplication des cellules. Et cela se produit dans la phase S. Il a donc une signification biologique que la réplication de l'ADN soit un processus très précis. Et cela l'exige, afin de préserver l'intégrité du génome dans une génération successive, c'est-à-dire si vous allez réellement générer les mutations.
Ou si vous commencez à générer les modulations dans la séquence du génome, ce que vous avez obtenu de la cellule d'origine, vous finirez par continuer à modifier les séquences d'ADN et cela
en fait, vous ne le saurez pas, portera la même information parce que la fonction principale de l'ADN est de transporter l'information génétique. De sorte que cela va réellement permettre aux cellules filles de continuer à exécuter le même type de métabolisme.
C'est pourquoi il est important que la réplication de l'ADN soit précise. De sorte qu'il devrait produire la copie identique afin de préserver la séquence de l'ADN ainsi qu'il devrait préserver l'intégrité du génome. Et cela devrait continuer pendant plusieurs générations. Chez les eucaryotes, la réplication n'a eu lieu que pendant la phase S du cycle cellulaire. Le taux de réplication chez un eucaryote est plus lent, ce qui entraîne une précision de réplication plus élevée chez les eucaryotes.
(Reportez-vous à l'heure de la diapositive : 12:15)
Maintenant, la réplication de l'ADN a les différentes caractéristiques. Par exemple, la réplication de l'ADN est semi-conservatrice, ce qui signifie que la réplication de l'ADN sera semi-conservatrice lorsque vous allez réellement synthétiser, par exemple, s'il s'agit des 2 brins 1 et 2, cela vous donnera en fait les 4 copies. de 4 brins. Mais dans ce 4 brin, le 1 et le 2 vont être séparés et le 3 et le 4 vont en fait être synthétisés.
Ainsi, le nouveau brin, ce qui a été synthétisé, va en fait former une paire avec les brins d'origine et ce processus s'appelle les modes semi-conservateurs. Donc, les 1 et 2 proviennent en fait des parents alors que les 3 et 4 sont en fait les souches nouvellement synthétisées. Cela signifie que les informations que vous avez dans l'ADN d'origine vont être divisées en 2.
Et c'est pourquoi il ne va pas être conservateur, ce qui signifie qu'il ne va pas faire la paire comme 1, 2 et 3, 4. Il va en fait faire une paire comme 1 et 3 et 2 et 4.
C'est en fait un mode de réplication semi-conservateur. Si vous voulez en savoir plus sur ou si vous êtes intéressé à en savoir plus sur la façon dont les gens ont découvert le mode semi-conservateur, vous pouvez facilement parcourir une partie du livre de biologie moléculaire et vous pouvez lire une partie de l'expérience classique ce qui a été conçu et comment les gens ont découvert que la réplication de l'ADN est de nature semi-conservatrice. Il commence à l'origine de la réplication.
Car la synthèse de l'ADN ne commence pas à des endroits aléatoires, elle nécessite un endroit où elle peut réellement commencer, de sorte que cet endroit est appelé l'origine des réplications. Dans la cellule bactérienne, vous avez l'origine unique de réplication alors que dans la cellule eucaryote, vous avez les lieux multiples de l'origine de réplication car le génome bactérien est de nature plus petite. Ainsi, il ne nécessite en fait pas l'origine multiple des réplications par rapport au fait que les génomes eucaryotes sont de plus grande taille.
Ils nécessitent donc l'origine multiple de réplication. Pour que l'application puisse démarrer à plusieurs endroits. Et c'est ainsi qu'il peut réellement terminer les réplications dans un délai donné. Parce que vous savez que la réplication est importante pour faire une deuxième copie du génome. Ainsi, la cellule entrera dans les phases G2 et M et c'est ainsi qu'elle se divisera et vous donnera le plus grand nombre de cellules.
C'est pourquoi la phase et as est en fait le goulot d'étranglement de l'ensemble du processus et que la réplication de l'ADN doit donc être synchrone avec la phase mitotique ainsi qu'avec la phase G2. La synthèse de l'ADN par l'ADN polymérase se produit toujours dans la direction appelée 5 directions principales à 3 directions principales. Donc, vous savez que cet ADN est en fait un polymère de nucléotides et que les nucléotides ont 2 brins comme 5 prime et 3 prime.
Donc, si je dessine des structures nucléotidiques typiques, ce que vous verrez, c'est qu'il s'agit en fait d'un sucre, alors c'est la base. Ainsi, par exemple, j'ai mis A et ici vous avez le sucre et sur ce quatrième carbone, vous avez le cinquième carbone et puis vous avez le CH2 et puis vous avez le groupe phosphate. Donc, c'est en fait l'extrémité 5 premiers et c'est l'extrémité 3 premiers car ici vous avez le
OH. Non, c'est la 3ème extrémité et c'est la 2ème extrémité. Donc, c'est en fait que vous allez avoir OH et c'est OH, ce que vous pouvez réellement utiliser.
Donc, si la synthèse d'ADN se produit, elle utilise en fait ce 5 premiers OH ou le 3 premiers OH, ce qui signifie que c'est pourquoi, l'ADN a une directionnalité qui va en fait de 5 premiers à 3 premiers et de 3 premiers à 5 premiers parce que cela est le brin complémentaire. Ainsi, la synthèse de l'ADN se produit toujours dans une direction appelée 5 prime à 3 prime, ce qui signifie qu'elle va réellement commencer la synthèse sur le brin, le brin qui a les 3 extrémités principales.
Et c'est comme ça qu'il va effectivement synthétiser dans ce sens car les phrases seront dans le sens. Il peut être unidirectionnel ou bidirectionnel, ce qui signifie qu'il peut être soit dans cette direction, soit dans les deux directions simultanément. C'est un semi discontinu. Par exemple, donc, semi-discontinu signifie que cela va en fait continuer pendant un certain temps, puis cela va s'arrêter, puis cela va à nouveau continuer pour cela et c'est pourquoi cela va en fait créer les 2 types différents de brins.
1 est appelé le brin principal, l'autre 1 est appelé le brin retardé. Donc, c'est le brin qui est appelé qui synthétise en fait l'ADN dans les multiples étapes est appelé brin retardé tandis que le brin qui part d'une extrémité et continue comme cela s'appelle brin principal. Et pour tout processus de réplication de l'ADN, vous avez besoin d'une amorce et cette amorce a été synthétisée par une enzyme appelée amorce d'ARN. Les amorces d'ARN et les amorces qui sont utilisées dans la réplication de l'ADN sont constituées de l'ARN et celui-ci a été synthétisé par l'ARN polymérase.
(Reportez-vous à l'heure de la diapositive : 18:01)
La réplication de l'ADN comporte 3 étapes. Il a comme initiation. Ainsi, lors de l'initiation, l'ADN va être préparé pour la synthèse. Ce que l'on entend par initiation, c'est que dans l'étape d'initiation, la protéine se lie à l'ADN. Donc, vous savez, l'ADN est une structure en double hélice. Donc, cette structure à double hélice doit d'abord être droite, de sorte que vous devez d'abord supprimer l'hélicité de cet ADN particulier. Donc, vous allez d'abord générer l'ADN comme un ADN double brin, puis vous devez réellement casser les 2 brins séparément.
Donc, qu'il sera en fait prêt à les accepter, ce sont des machines et c'est ce qui se passe lorsque les événements se dirigent vers les états d'initiation. Dans les états d'initiation, la protéine se liera à l'ADN, puis il y aura une ouverture de l'ADN en double hélice. Donc, il s'agira en fait d'ADN simple brin. Ainsi, l'ADN simple brin va être généré dans l'étape d'initiation, puis vous avez les étapes d'élongation.
Donc, dans les étapes d'élongation, la machinerie de l'ADN va être mise sur ceci et ainsi que sur cela et ensuite elle va réellement commencer à ajouter les nucléotides et c'est ainsi qu'elle va réellement commencer la synthèse de la seconde brins. Ainsi, dans les étapes d'élongation, la protéine connectera la séquence correcte du nucléotide en de nouveaux brins d'ADN continus. Et une fois que la machinerie de l'ADN va être atteinte dans les coins comme la fin de la séquence, elle va en fait arrêter la synthèse.
Et c'est ce que la troisième étape qui est la troisième étape est la terminaison qui va réellement arrêter la synthèse d'ADN. Et une fois la synthèse de l'ADN terminée, l'ADN doit à nouveau retrouver sa forme d'origine et c'est l'étape requise si vous une fois avant de terminer, ce qui signifie qu'une fois la synthèse terminée, l'ADN va d'abord être converti en une structure à double hélice puis à partir de la structure à double standard, vous devez générer une structure à double hélice.
Donc, c'est pourquoi la synthèse de l'ADN est un processus contrôlé très fin où vous devez d'abord faire l'initiation, où l'ADN doit être divisé en 2 brins différents, puis les 2 brins différents vont être occupés par vous le savez. la machinerie de synthèse d'ADN et que va faire la machinerie de synthèse d'ADN ? Ainsi, la machinerie de synthèse de l'ADN implique les ADN polymérases qui vont réellement s'asseoir sur l'enzyme.
Et puis ils vont en fait lire la séquence d'origine et sur la base de la séquence d'origine, ils vont en fait ajouter les nucléotides sur le deuxième brin et c'est ainsi que cela va réellement commencer la synthèse du deuxième brin et une fois qu'ils atteindre la fin, c'est ce que la phase d'élongation et une fois qu'ils atteignent la fin de la séquence, ils vont réellement commencer les étapes de terminaison. Ainsi, une fois la synthèse terminée, il va en fait générer l'ADN double standard, puis l'ADN double standard va être enroulé et ensuite il va générer les structures hélicoïdales.
(Reportez-vous à l'heure de la diapositive : 21:20)
Il existe différentes enzymes impliquées dans ce processus de réplication de l'ADN. Donc, vous avez besoin des hélicases qui vont réellement séparer les 2 brins différents. Ensuite, vous avez besoin de la primase qui est en fait notre ARN polymérase. Donc, il va en fait être nécessaire pour faire une synthèse des amorces d'ARN. Ensuite, vous avez besoin des protéines d'ADN simple brin. Ainsi, les protéines d'ADN simple brin vont en fait se lier aux 2 brins comme celui-ci, de sorte qu'elles ne devraient pas se réunir et se ré-hybrider à nouveau.
Et c'est ainsi qu'il va en fait maintenir l'ADN standard unique. Ensuite, vous avez besoin de l'ADN polymérase qui va réellement faire la synthèse d'un nouveau brin, puis vous avez besoin de la protéine d'attache qui va réellement stabiliser les polymérases sur les brins.
(Reportez-vous à l'heure de la diapositive : 22:10)
Ainsi, la synthèse de l'ADN comporte 3 étapes. 1 est appelé comme l'initiation qui va réellement préparer l'ADN pour la synthèse. Donc, ce que vous faites, vous prenez en fait un ADN, puis vous générez en fait les 2 brins, puis dans les étapes d'élongation, nous faisons la synthèse de l'ADN. Donc, une fois que vos 2 brins sont prêts, ce que vous pouvez faire, c'est prendre et ajouter les amorces. Donc, dans ce cas, les amorces d'ARN et ainsi de suite, les deux amorces vont être posées et ensuite vous allez ajouter les enzymes.
L'enzyme va donc s'asseoir sur ces brins. Et c'est ainsi qu'il va réellement démarrer la synthèse et une fois la fin terminée, vous pouvez donc arrêter la synthèse d'ADN. Alors, que se passera-t-il, une fois qu'il atteindra ce point, cette enzyme va réellement tomber des brins et
qu'il va effectivement achever la synthèse de l'ADN et qu'il entrera dans les terminaisons.Alors maintenant, ce que vous voyez, c'est que ce sont les processus que nous faisons dans le cadre de la synthèse d'ADN.
Et ce qui se passe à l'intérieur de la cellule peut être mimé même à l'extérieur de la cellule parce que tous ces événements peuvent être contrôlés même sans passer par vous connaissez certaines des enzymes dont vous avez besoin. Par exemple, vous avez besoin des hélicases, de sorte qu'elles génèrent réellement l'ADN simple brin et c'est ainsi qu'elles en produisent suffisamment, puis vous avez besoin des protéines de liaison à l'ADN standard uniques.
Ainsi, les brins d'ADN générés par les hélicases resteront monocaténaires. Car ces 2 processus peuvent être simplement effectués si vous chauffez ces brins particuliers. Donc, si vous chauffez ce brin particulier, ce qui se passera, c'est que l'ADN double standard sera ouvert dans les matrices simple brin. Et c'est ainsi que vous pouvez les utiliser. Maintenant, dans la phase d'allongement, ce que vous pouvez faire, c'est simplement ajouter les petits tronçons de séquences d'ADN, qui seront en fait appelés amorces.
Et c'est comme ça et ensuite vous pouvez ajouter l'enzyme. C'est ainsi que vous allez réellement commencer le processus de synthèse. Et une fois arrivé à la fin, ce sera en fait une chute du modèle et, par conséquent, cela se terminera dans les terminaisons. Donc garder ces événements et se rendre compte que ces événements peuvent se faire dans les conditions in vitro. Les gens ont conceptualisé le processus de réaction en chaîne par polymérase et c'est ainsi qu'ils ont commencé à développer la technique. Mais il y a plusieurs étapes et plusieurs phases dans lesquelles les réactions en chaîne par polymérase sont développées.
(Reportez-vous à la durée de la diapositive : 25:08)
Donc, il y a plusieurs événements que les gens ont fait même pour développer le PCR pour le. Ainsi, dans les années 1950, les gens ont découvert comment se passe la réplication de l'ADN et cela est fait par Arthur Kornberg et il a découvert la première ADN polymérase et d'autres facteurs comme l'hélicase et les amorces. Ainsi, dans les années 1950, lorsque Arthur Kornberg a réellement découvert les ADN polymérases ainsi que le mécanisme de réplication de l'ADN, les hélicases et les primases, c'est ainsi que les gens savent que l'ADN est réellement répliqué.
Et cela nécessite une enzyme et il y a une enzyme. Mais quel est le problème ? Le problème est que l'ADN polymérase découverte par Arthur Kornberg est en fait sensible à la température, ce qui signifie qu'elle ne peut pas supporter une température très élevée. Et vous savez, comme je l'ai dit dans la dernière diapositive elle-même, que lorsque vous voulez imiter ces conditions dans des conditions in vitro, la seule façon d'échapper aux hélicases et à toutes les autres protéines est de pouvoir réellement chauffer l'ADN.
Ainsi, l'ADN entrera dans les 2 brins et ces 2 brins resteront comme un seul brin standard uniquement si vous maintenez la température très élevée. Mais une fois que vous amenez la température à un niveau élevé, l'enzyme, ce qui a été rapporté par le Dr Kornberg, va en fait être inactivée. Et c'est pourquoi rien ne s'est passé jusqu'en 1976, les gens ont découvert la première ADN polymérase thermostable du thermo aquaticus et que la thermo ADN polymérase est appelée ADN polymérase taq et que l'ADN polymérase taq est très, stable.
Il peut résister à une température de 95 degrés Celsius, ce qui signifie que vous pouvez utiliser cette enzyme sur plusieurs tours. Et vous n'avez pas besoin, vous savez, vous n'avez pas besoin d'ajouter l'enzyme, vous savez, pour chaque cycle que vous devez continuer. Puis en 1983, Kary Mullis synthétise cet oligo-ADN sonde pour la drépanocytose. Et puis en 1983, il n'a fait que le cycle thermique répété qui a d'abord été utilisé pour cloner un petit segment d'ADN du génome.
Et puis en 1984, les Kary Mullis et Tom White ont tenté l'expérience de conception pour tester la PCR sur l'ADN génomique mais le produit amplifié n'était pas visible dans l'agarose. Puis en 1985, le premier brevet a été déposé pour son application concernant la détection des mutations de l'anémie falciforme. Et le 1985, la première utilisation de l'ADN polymérase thermostable en PCR a commencé à partir de seulement 2 enzymes, la taq ADN polymérase, connue à l'époque où la taq s'est révélée plus appropriée pour la PCR.
Et de 1985 à 1987, les gens ont beaucoup découvert sur les différents types d'instruments et il y a donc beaucoup de découvertes et de développements plus tard avec l'aide des instrumentations.
(Reportez-vous à la durée de la diapositive : 28:29)
Donc, ce que font les gens dans une réaction en chaîne par polymérase. La PCR est donc une réaction cyclique répétée qui implique le mécanisme des réplications de l'ADN. Il en résulte la production de plusieurs copies d'ADN à partir d'un seul 1, l'ensemble du processus implique 3 événements, l'un s'appelle la dénaturation, l'hybridation et les allongements. Alors que se passe-t-il pour que vous puissiez imaginer que vous avez commencé avec la copie originale de l'ADN double brin.
Donc, sous la dénaturation, lorsque vous aurez chauffé l'échantillon à 95 degrés Celsius, ce qui se passera, c'est que les 2 brins de la copie originale vont se séparer et cela vous donnera les 2 brins. Maintenant, ce que vous allez faire, c'est que vous allez entrer dans la phase de recuit où vous allez réellement abaisser la température. Ainsi, les amorces vont acheter et vous allez en fait avoir les amorces.
Il va donc en fait ajouter les amorces et c'est ainsi qu'il va réellement attacher l'amorce à 1 extrémité de cet ADN ainsi qu'à l'extrémité 1 de cet ADN. Et puis l'enzyme entrera dans la phase d'élongation. Et l'enzyme va en fait utiliser cette petite amorce d'ADN et c'est ainsi qu'elle va synthétiser le brin entier et c'est ainsi que vous allez réellement obtenir l'ADN double brin à la fin.
Donc, cela va en fait constituer le premier cycle ou le premier cycle. Après le premier cycle, puisque vous avez commencé avec le 1 ADN, vous allez en fait obtenir 2 ADN. Mais comme vous pouvez le voir, il s'agit en fait d'un semi-conservateur, ce qui signifie que le brin 1 provient de l'ADN d'origine. Et le deuxième brin est le brin d'ADN nouvellement synthétisé. Maintenant, vous pouvez imaginer que la même chose s'est produite dans le deuxième cycle.
Mais maintenant, celui-ci est aussi ces 2 brins qui vont aussi servir de gabarit. Et c'est ainsi que vous allez réellement obtenir les 4 copies et dans le troisième cycle, vous allez obtenir les 8 copies, ce qui signifie qu'un fragment d'ADN d'intérêt est utilisé comme modèle à partir duquel une paire d'amorces ou un court oligonucléotide complémentaire à à la fois le double brin de l'ADN est fait pour amorcer la synthèse d'ADN où la direction de synthèse ou l'extension est 5 prime à 3 prime comme c'était dans le cas des réplications d'ADN le nombre d'ADN amplifié.
Ou les amplicons augmentent de façon exponentielle par cycle par exemple, si vous commencez avec la molécule d'ADN 1, après le premier cycle, ce sera l'ADN, après le deuxième cycle ce sera 4, après le troisième cycle ce sera 8. Donc, si vous continuez, cela continue en fait comme ce cycle comme ça. Ainsi, il double en fait après chaque cycle et c'est ainsi qu'il vous donnera une amplification très élevée, même à partir de la molécule 1.
Donc, si vous imaginez que si je commençais avec 1 microgramme d'ADN, ce sera en fait plusieurs microgrammes d'ADN et même à l'intérieur de ces 20, 25 cycles. Ainsi, la quantité d'ADN amplifié que vous pouvez calculer simplement en mettant cette formule qui est le C est égal à C0 1 plus E à la puissance n où le C est la quantité finale d'ADN, C0 est la quantité initiale d'ADN , E est l'efficacité et n est le nombre de cycles et S est la pente de la phase exponentielle et que vous pouvez calculer à partir de ces équations particulières.
Ainsi, vous pouvez voir que la réaction en chaîne de la polymérase utilise en fait le concept similaire à ce qui se passe pendant les réplications de l'ADN, mais au lieu d'utiliser les multiples facteurs et des mécanismes aussi compliqués, ce que vous faites, c'est simplement chauffer les réactions, vous êtes faire les 2 brins, puis vous ajoutez les amorces, ce qui signifie que le petit ADN s'étire, puis vous demandez à l'enzyme d'utiliser ces amorces pour synthétiser, puis une fois la synthèse terminée, vous ramenez à nouveau la température et continuez le même cycle et c'est ainsi que vous faites réellement les multiples réactions.
(Reportez-vous à la durée de la diapositive : 32:58)
Ainsi, la réaction en chaîne par polymérase nécessite les 4 événements. Donc, si vous configurez les réactions en chaîne par polymérase, vous avez besoin de la dénaturation initiale, ce qui signifie que vous devez chauffer le mélange PCR à 94 à 95 degrés pendant 10 minutes pour dénaturer complètement l'ADN matrice. Donc, quand vous allez commencer les réactions PCR, vous devez d'abord apporter les réactions et ensuite vous allez
faites d'abord la dénaturation initiale où vous allez réellement chauffer le mélange à 95 degrés Celsius pendant 5 à 10 minutes.
Et puis vous allez réellement entrer dans l'étape 2 où vous allez à nouveau chauffer le modèle pendant 30 secondes à 45 secondes. Et ce sera en fait nos étapes de dénaturation. Donc, dans les étapes de dénaturation, c'est la première étape dans laquelle l'ADN double brin va être dénaturé pour former les 2 ADN standard simples en chauffant l'ADN à 95 degrés Celsius pendant 15 à 30 secondes. Maintenant, vous allez baisser la température.
Cela va donc être des étapes de recuit. Donc, dans l'étape d'annelage, c'est l'étape d'annelage où la température la plus basse comme 50 à 65 degrés Celsius, les amorces sont autorisées à se lier à l'ADN matrice et le temps de liaison est de 15 à 30 secondes et cela dépend de la longueur et des bases de les amorces. Donc, ce que vous allez faire, c'est que vous avez abaissé la température de sorte que les amorces qui flottent réellement et qui sont une petite étendue d'ADN vont maintenant se lier à son ADN complémentaire présent sur la matrice.
Et maintenant, l'enzyme reconnaîtra ce complexe D particulier et c'est ainsi que l'enzyme commencera la synthèse. Ainsi, après le recuit, il entrera dans la phase d'allongement. Il s'agit donc de l'étape de synthèse où la chaîne polymérase a effectué la synthèse du nouveau brin dans les directions 5 prime à 3 primes en utilisant les amorces les dNTP ou les désoxyribo nucléotides triphosphates.
Et l'ADN polymérase moyenne ajoute environ 1000 paires de bases par minute, ce qui signifie qu'une fois l'annelage terminé et que les dimères d'amorces ont formé le complexe, vous allez à nouveau augmenter la température. Ainsi, vous vous assurerez que l'ADN matrice ne doit pas se lier les uns aux autres, puis l'enzyme viendra s'asseoir sur ces complexes et effectuera en fait une synthèse d'ADN.
Et en moyenne, 1000 paires de bases seront synthétisées dans la minute où si vous fournissez la quantité adéquate de nucléotides désoxyribo dans le mélange. Ainsi, les étapes 1 et 2, 3 feront 1 cycle. Donc, cette étape par des moyens comme les étapes 1, 2 et 3 constitue en fait la première 1
cycle. Et vous pouvez demander à la machine de continuer le cycle pour un autre

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Analyse moléculaire des protéines

Dans de nombreux cas, il peut ne pas être souhaitable ou possible d'étudier directement l'ADN ou l'ARN. Les protéines peuvent fournir des informations spécifiques à l'espèce pour l'identification ainsi que des informations importantes sur la façon dont une cellule ou un tissu réagit à la présence d'un micro-organisme pathogène. Diverses protéines nécessitent différentes méthodes d'isolement et de caractérisation.

Électrophorèse sur gel de polyacrylamide

Une variante de l'électrophorèse sur gel, appelée électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE), est couramment utilisé pour séparer les protéines. Dans PAGE, la matrice du gel est plus fine et composée de polyacrylamide au lieu d'agarose. De plus, la PAGE est généralement effectuée à l'aide d'un appareil à gel vertical (figure 6). En raison des charges variables associées aux chaînes latérales d'acides aminés, la PAGE peut être utilisée pour séparer les protéines intactes en fonction de leurs charges nettes. Alternativement, les protéines peuvent être dénaturées et enrobées d'un détergent chargé négativement appelé dodécyl sulfate de sodium (SDS), masquant les charges natives et permettant une séparation basée uniquement sur la taille. PAGE peut être encore modifié pour séparer les protéines en fonction de deux caractéristiques, telles que leurs charges à différents pH ainsi que leur taille, grâce à l'utilisation de PAGE en deux dimensions. Dans tous ces cas, après électrophorèse, les protéines sont visualisées par coloration, généralement avec du bleu de Coomassie ou une coloration à l'argent.

Figure 6. Cliquez pour une image plus grande. (a) Le SDS est un détergent qui dénature les protéines et masque leurs charges natives, les rendant uniformément chargées négativement. (b) Le processus de SDS-PAGE est illustré dans ces étapes. (c) Une photographie d'un gel SDS-PAGE montre des bandes colorées de Coomassie où des protéines de différentes tailles ont migré le long du gel en réponse à la tension appliquée. Une voie standard de taille est visible sur le côté droit du gel. (crédit b : modification du travail par “GeneEd”/YouTube)

Pensez-y

Focus clinique : Karni, partie 3

Cet exemple continue l'histoire de Karni qui a commencé dans Microbes and the Tools of Genetic Engineering et au-dessus.

Figure 7. Une éruption cutanée est l'un des symptômes courants de la maladie de Lyme, mais jusqu'à 30 % des personnes infectées ne développent jamais d'éruption cutanée. (crédit: Centers for Disease Control and Prevention)

Lorsque Karni a décrit ses symptômes, son médecin a d'abord soupçonné une bactérie méningite, ce qui est cohérent avec ses maux de tête et sa raideur de la nuque. Cependant, elle a rapidement exclu cette possibilité car la méningite progresse généralement plus rapidement que ce que Karni vivait. Bon nombre de ses symptômes ressemblaient encore à ceux de sclérose latérale amyotrophique (SLA) et lupus érythémateux disséminé (LED), et le médecin a également considéré maladie de Lyme une possibilité étant donné le temps que Karni passe dans les bois. Karni ne se souvenait d'aucune morsure de tique récente (le moyen typique par lequel la maladie de Lyme est transmise) et elle n'avait pas l'éruption cutanée typique associée à la maladie de Lyme (Figure 7). Cependant, 20 à 30% des patients atteints de la maladie de Lyme ne développent jamais cette éruption cutanée, le médecin n'a donc pas voulu l'exclure.

Le médecin de Karni a ordonné une IRM de son cerveau, une numération formule sanguine complète pour tester l'anémie, des tests sanguins évaluant la fonction hépatique et rénale, et des tests supplémentaires pour confirmer ou exclure le LED ou la maladie de Lyme. Ses résultats de test étaient incompatibles avec le LED et la SLA, et le résultat du test de recherche d'anticorps contre la maladie de Lyme était « équivoque », ce qui signifie non concluant. Après avoir exclu la SLA et le LED, le médecin de Karni a décidé d'effectuer des tests supplémentaires pour la maladie de Lyme.

  • Pourquoi le médecin de Karni soupçonnerait-il encore la maladie de Lyme même si les résultats des tests n'ont pas détecté d'anticorps de Lyme dans le sang ?
  • Quel type de test moléculaire pourrait être utilisé pour la détection des anticorps sanguins contre la maladie de Lyme ?

Nous reviendrons sur l'exemple de Karni dans les pages suivantes.


Réactifs et solutions

Utilisez de l'eau distillée déminéralisée dans toutes les recettes et étapes du protocole. Pour les solutions d'actions ordinaires, voir ANNEXE Non disponible pour les fournisseurs, voir ANNEXE Indisponible.

Agents renforçateurs

Pour une discussion sur la façon de sélectionner des agents activateurs, voir 2.

25% acétamide (20 µl/réaction 5% final)

5 millions N,N,N-triméthylglycine (bétaïne 20 µl/réaction 1 M final)

40% polyéthylène glycol (PEG) 8000 (20 µl/réaction 8% final)

Glycérol (concentré 10 µl/réaction 10% final)

Diméthylsulfoxyde (DMSO concentré 5 µl/réaction 5% final)

Formamide (concentré 5 µl/réaction 5% final)

1 U/µl Perfect Match Polymerase Enhancer (Strategene 1 µl/réaction 1 U final)

10 mg/ml d'albumine de sérum bovin acétylée (BSA) ou de gélatine (1 µl/réaction 10 µg/ml final)

1 à 5 U/µl pyrophosphatase thermostable (PPase Roche Diagnostics 1 µl/réaction 1 à 5 U final)

Chlorure de tétraméthylammonium 5 M (chlorhydrate de bétaïne TMAC 1 µl/réaction 50 mM final)

0,5 mg/ml E. coli protéine de liaison à l'ADN simple brin (SSB Sigma 1 µl/réaction 5 µg/ml final)

0,5 mg/ml de protéine Gene 32 (Amersham Pharmacia Biotech 1 µl/réaction 5 µg/ml final)

10 % de Tween 20, Triton X-100 ou Nonidet P-40 (1 µl/réaction 0,1 % final)

1 M (NH4)2DONC4 (1 µl/réaction 10 mM utilisation finale avec des ADN polymérases thermostables autres que Taq)

MgCl2-tampon PCR gratuit, 10×

Conserver indéfiniment à -20°C

Ce tampon peut être obtenu auprès de Promega, il est fourni avec de l'ADN polymérase Taq.

Mélange 4dNTP

Pour mélange 2 mM 4dNTP: Préparer 2 mM chaque dNTP dans un tampon TE, pH 7,5 ( ANNEXE Indisponible). Conserver jusqu'à 1 an à -20°C en aliquotes de 1 ml.

Pour mélange 25 mM 4dNTP: Combinez des volumes égaux de 100 mM de dNTP (Promega). Conserver indéfiniment à -20°C en aliquotes de 1 ml.


Technique d'amplification de protéines similaire à la PCR pour l'ADN ? - La biologie

Éditeur: Horizon Biosciences
Éditeurs : Vadim V. Demidov et Natalia E. Broude Université de Boston, États-Unis
Date de publication: juillet 2004
ISBN-10 : 0-9545232-9-6
ISBN-13 : 978-0-9545232-9-9
Pages : xii + 336

L'amplification de l'ADN est la pierre angulaire de la biotechnologie moderne et c'est également une procédure clé dans de nombreuses études de base impliquant l'ADN et d'autres biomolécules. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est toujours la méthode d'amplification la plus populaire, mais des alternatives à la PCR ont envahi avec succès la région. L'émergence de telles méthodologies a considérablement élargi la gamme d'approches pour l'amplification de l'ADN et a considérablement amélioré les capacités technologiques des chercheurs fondamentaux et appliqués dans divers domaines des sciences de la vie. Alors que la plupart des livres sur l'amplification de l'ADN se concentrent sur les technologies basées sur la PCR, ce volume présente une gamme plus large de méthodes pour amplifier l'ADN en mettant l'accent sur leurs diverses applications. Le livre couvre à la fois des protocoles bien établis et nouvellement développés, y compris des approches de thermocyclage basées sur la ligature, la PCR en temps réel et d'autres nouveaux développements de PCR, ainsi que plusieurs puissantes techniques d'amplification d'ADN isotherme non PCR, par exemple : l'amplification par déplacement de brin en temps réel ( SDA), l'amplification en cercle roulant (RCA) et l'amplification à déplacement multiple (MDA). Une section entière est consacrée à un groupe d'enzymes, à la fois naturelles et modifiées, qui sont utilisées pour l'amplification de l'ADN et à des fins connexes. De plus, l'utilisation de l'amplification d'ADN dans la détection d'analytes non ADN est présentée. Écrit et édité par des experts de premier plan dans le domaine, ce livre est un outil pratique et une source de référence inestimable pour un large public de chercheurs universitaires et de biotechnologues industriels qui utilisent des techniques d'amplification de l'ADN.

&bull Couvre la théorie, la pratique et les applications
&bull Contient des protocoles bien établis et nouvellement développés
&bull Complet et à jour
&bull Inclut la dernière technologie
&bull Un manuel de laboratoire pratique
&bull Destiné à un large public
&bull Entièrement illustré tout au long
&taureau Index utile

"Je trouve cela extrêmement fascinant.Je l'utiliserai certainement dans l'un de mes cours de biophysique/biochimie." de Bengt Nolting, Institut privé prussien de technologie, Berlin.

« Ce doit être un excellent livre ! Je l'achèterai dès qu'il sera disponible. Un bon livre vaut n'importe quel argent. » d'Igor Kutyavin, chercheur, Epoch Pharmaceuticals Inc.

« Joli livre. Je veux l'avoir ! de Juan Aymami, Université de Catalogne, Espagne .

"Conseillé." par Microbiology Today (2004) 31: 201 .

". le livre devrait être un outil essentiel et une source de référence pour les chercheurs du monde universitaire et de l'industrie." de Joshua Marcy dans Drug Discovery and Development (2004) 7 : 92.

Amplification de l'ADN est un recueil d'articles édité par Vadim Demidov et Natalia Broude, dont deux articles par les éditeurs. Le livre se démarque du domaine des offres similaires en incluant des chapitres couvrant des méthodes nouvelles et de pointe basées sur la PCR ainsi que des techniques d'amplification non PCR émergentes. Les lecteurs à la recherche d'idées sur la manière d'aborder les questions de recherche pour lesquelles des approches plus « traditionnelles » ne se sont pas révélées tout à fait satisfaisantes trouveront cette étude excellente et informative sur les nouvelles idées. De plus, des sections de méthodes explicites sont fournies par la plupart des auteurs afin que les lecteurs puissent facilement mettre en œuvre les idées générées par le livre. Dans l'ensemble, le livre est une lecture engageante et intéressante." de David J. Lane Ph.D., vice-président R et D, Hamilton Thorne Biosciences.

"Un livre essentiel pour tous les gens dans ce domaine." de Sajjad Sarikhan, Université de Zanjan, Iran .

". un outil pratique et une source de référence inestimable des dernières technologies d'amplification de l'ADN pour les scientifiques universitaires et industriels. " de l'expert Rev. Mol. Diagnostiquer. (2005) 5 : 127-129.

"Ce livre s'adresse à ceux qui ont une solide expérience en biologie moléculaire et qui souhaitent connaître les applications de pointe. un bon ajout à la bibliothèque des chercheurs en biologie moléculaire." d'Émerger. Infecter. Dis. (2005) 11 : (2) .

"contenu complet et didactique" Monica Ramirez Concepto Azul, EQUATEUR .

Section 1. Enzymes utilisées dans l'amplification de l'ADN

Chapitre 1.1.
ADN polymérases chimériques thermostables à haute résistance aux inhibiteurs
Andrey R. Pavlov, Nadejda V. Pavlova, Sergei A. Kozyavkin et Alexei I. Slesarev

Chapitre 1.2.
L'ADN polymérase Phi29, une enzyme d'amplification puissante
Margarita Salas, Miguel de Vega, José M. Láacutezaro et Luis Blanco

Chapitre 1.3.
Les ADN ligases thermostables haute fidélité comme outil d'amplification de l'ADN
Weiguo Cao

Section 2. Méthodes de thermocyclage d'amplification de l'ADN

Chapitre 2.1.
PCR à haute multiplexité basée sur la suppression de PCR
Natalia E. Broude, Adriaan W. van Heusden et Richard Finkers

Chapitre 2.2.
PCR sur puce : amplification et analyse de l'ADN sur puces à oligonucléotides
Martin Huber, Christian Harwanegg, Manfred W. Mueller et Wolfgang M. Schmidt

Chapitre 2.3.
Analyse de mutations somatiques par PCR à molécule unique à longue distance
Yevgenya Kraytsberg, Ekaterina Nekhaeva, Connie Chang, Konstantin Ebralidse et Konstantin Khrapko

Chapitre 2.4.
Analyse PCR numérique du statut allélique dans les échantillons cliniques
Wei Zhou, Tanisha Williams, Cécile Colpaert, Aki Morikawa et Diansheng Zhong

Chapitre 2.5.
Application de la PCR quantitative en temps réel à l'analyse de l'expression génique
Manohar R. Furtado, Olga V. Petrauskene et Kenneth J. Livak

Chapitre 2.6.
Analyse génétique quantitative avec amplification par sonde multiplexe dépendante de la ligature (MLPA)
A.O.H Nygren, A. Errami et J.P. Schouten

Section 3. Méthodes isothermes d'amplification de l'ADN

Chapitre 3.1.
Amplification de déplacement de brin homogène en temps réel
David M. Wolfe, Sha-Sha Wang, Keith Thornton, Andrew M. Kuhn, James G. Nadeau et Tobin J. Hellyer

Chapitre 3.2.
Amplification isotherme à médiation par boucle (LAMP) d'analytes d'ADN
Tsugunori Notomi, Kentaro Nagamine, Yasuyoshi Mori et Hidetoshi Kanda

Chapitre 3.3.
Amplification de l'ADN en cercle roulant par ligature pour la détection sans gel de polymorphismes nucléotidiques uniques (SNP)
Xiaoquan Qi

Chapitre 3.4.
Amplification en cercle roulant de séquences d'ADN duplex assistée par des ouvreurs de PNA
Heiko Kuhn et Vadim V. Demidov

Chapitre 3.5.
Amplification en cercle roulant à base d'ADN polymérase Phi29 de modèles pour le séquençage de l'ADN
John C. Detter, John R. Nelson et Paul M. Richardson

Chapitre 3.6.
Amplification à déplacements multiples (MDA) de génomes humains entiers à partir de divers échantillons
Roger S. Lasken, Seiyu Hosono et Michael Egholm

Section 4. Amplification de l'ADN dans la détection des analytes non ADN

Chapitre 4.1.
Détection améliorée des protéines à l'aide de l'immuno-PCR en temps réel
Michael Adler et Christof M. Niemeyer

Chapitre 4.2.
Amplification en cercle roulant dans les dosages immunologiques multiplex
Michael C. Mullenix, Richard S. Dondero, Hirock D. Datta, Michael Egholm, Stephen F. Kingsmore et Lorah T. Perlee

L'amplification de l'ADN est la pierre angulaire de la biotechnologie moderne et c'est également une procédure clé dans de nombreuses études fondamentales impliquant des molécules d'ADN. Toutes les méthodes d'amplification de l'ADN reposent sur le concept de complémentarité des brins d'ADN découvert par James Watson et Francis Crick il y a cinquante ans. Dans la même mesure, ces méthodes sont devenues possibles avec la découverte d'ADN polymérases identifiées pour la première fois par Arthur Kornberg peu après la découverte de Watson-Crick et d'ADN ligases découvertes en 1967 par Martin Gellert, Charles Richardson, Jerard Hurwitz, Robert Lehman et d'autres. À l'aide de ces enzymes (et plus tard de leurs variantes thermostables), diverses techniques d'amplification isotherme et à cycle de température ont été développées à partir de la fin des années 1980. Parmi ces techniques, la réaction en chaîne par polymérase (PCR) de Kari Mullis a été la première et elle reste la méthode d'amplification la plus populaire. Pourtant, certaines alternatives à la PCR ont également réussi à envahir la zone. L'émergence de telles méthodologies a considérablement élargi la gamme d'approches pour l'amplification de l'ADN et a radicalement changé les capacités des chercheurs fondamentaux et appliqués dans divers domaines des sciences de la vie. Il ne sera pas exagéré de dire que maintenant aucune recherche liée à l'ADN ne peut être effectuée sans l'emploi de procédures d'amplification de l'ADN.

Malgré l'importance de ce sujet, nous avons constaté à notre grande surprise que seuls quelques livres ont été publiés qui traitent du sujet. De plus, ces livres couvrent principalement des techniques basées sur la PCR et/ou décrivent l'utilisation de la PCR et d'autres approches d'amplification de l'ADN pour des objectifs spécifiques, tels que l'analyse clinique, la microbiologie environnementale, la médecine légale, etc. Cette pénurie d'informations a été une motivation majeure pour nous de compiler un livre sur un plus large éventail de méthodes d'amplification de l'ADN en mettant l'accent sur leurs diverses applications. En outre, près de vingt ans après l'invention de la PCR, nous assistons maintenant à une nouvelle étape dans l'art de l'amplification de l'ADN grâce à l'introduction de la PCR en temps réel, de plusieurs techniques puissantes d'amplification de l'ADN non PCR et des technologies de microarray. Dans une tentative de représenter l'état de l'art actuel, notre livre couvre à la fois des protocoles bien établis et nouvellement développés avec un potentiel prometteur.

Bien que le livre aille bien au-delà de la PCR en présentant un certain nombre de tests isothermes ainsi que les approches de thermocyclage basées sur la ligature, la PCR reste, malgré certaines limitations, la technique de diagnostic dominante pour l'amplification et l'analyse de l'ADN cible, et récemment cette méthode primaire a été systématiquement améliorée De plusieurs façons. C'est pourquoi une partie importante de notre livre est consacrée aux nouveaux développements de la PCR. Une section distincte est consacrée à un groupe d'enzymes, à la fois naturelles et modifiées, qui sont utilisées pour l'amplification de l'ADN et à des fins connexes. Nous présentons également ici l'utilisation de l'amplification d'ADN dans la détection d'analytes non ADN. Notez que nous ne considérons pas en soi les méthodes de détection des amplicons obtenus d'une manière ou d'une autre, à l'exception de celles qui établissent une nouvelle approche d'amplification puissante, comme dans le cas de la PCR en temps réel ou de l'amplification par déplacement de brin en temps réel ( SDJ).

Nous espérons que notre livre servira d'outil pratique et de source de référence pour un large public de chercheurs universitaires et de biotechnologistes de l'industrie qui s'appuient dans leurs travaux sur les techniques d'amplification de l'ADN. Nous remercions tous les contributeurs et l'éditeur qui ont rendu ce livre possible.

Vadim V. Demidov et Natalia E. Broude
avril 2004
Boston, États-Unis


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