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Quelles sont les méthodes stéréologiques, similaires à l'analyse de la zone de Saltykov, mais spécifiquement pour les coupes histologiques parallèles et équidistantes ?


J'ai lu la stéréologie quantitative, par Underwood, et l'analyse de la zone de Saltykov fonctionne bien pour mes recherches, mais je suis surpris qu'il n'y ait rien pour les tranches d'histologie parallèles équidistantes. Existe-t-il des méthodes spécifiques à ce cas ?


Sondes à diodes pour le contrôle optique spatio-temporel de plusieurs neurones chez les animaux se déplaçant librement

Adresse pour les demandes de réimpression et autre correspondance : E. Stark, Center for Molecular and Behavioral Neuroscience, Rutgers Univ., 197 Univ. Ave., Newark, NJ 07102 (e-mail : [email protected] ).

Centre de neurosciences moléculaires et comportementales, Université Rutgers, Newark, New Jersey

Centre de neurosciences moléculaires et comportementales, Université Rutgers, Newark, New Jersey


Remerciements

Nous remercions Brita Zugenmaier pour la relecture et les collègues du Walter Brendel Center of Experimental Medicine (Ludwig‐Maximilians‐Universität München, Allemagne), en particulier Franz Singer pour son soutien technique concernant le matériel chirurgical, et Mehdi Shakarami, responsable de l'animalerie, et son personnel pour la compétence en matière de logement des animaux. En particulier, nous remercions Sven Reese (Institut d'anatomie, d'histologie et d'embryologie, Ludwig‐Maximilians‐Universität München, Allemagne) pour ses conseils statistiques et son introduction à la méthode des statistiques de taille d'effet selon Cohen.

Sources de financement

Ce travail a été en partie soutenu par le Collaborative Research Center (SFB‐TR) 127, le Pôle d'Excellence Cardio‐Pulmonary System (ECCPS) de la Justus‐Liebig‐University, Giessen (Allemagne), et la bourse individuelle FI‐543/2 ‐2, tous financés par la Fondation allemande pour la recherche (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Bonn, Allemagne), ainsi que par la Fondation von‐Behring‐Röntgen (Marburg, Allemagne) et le programme prioritaire LOEWE « Medical RNomics » (Wiesbaden, Allemagne) .


Quelles sont les méthodes stéréologiques, similaires à l'analyse de la zone de Saltykov, mais spécifiquement pour les coupes histologiques parallèles et équidistantes ? - La biologie

Une évaluation quantitative des caractéristiques morphologiques des cellules BeWo en tant que modèle in vitro de cellules trophoblastiques humaines


Una Evaluación Cuantitativa de las Características Morfológicas de las Células BeWo como un Modelo in vitro de las Células de Trofoblasto Humano

*C.S. Abaidoo **M. A. Warren **P. W. Andrews & ***K. A. Boateng

* Département d'anatomie, École des sciences médicales, Université des sciences et technologies Kwame Nkrumah, Kumasi, Ghana.

** Département des sciences biomédicales, Université de Sheffield, Sheffield, S10 2TN, Royaume-Uni.

*** Département de pathologie, École des sciences médicales, Université des sciences et technologies Kwame Nkrumah, Kumasi, Ghana.

SOMMAIRE: Afin d'étudier la morphologie détaillée des cellules trophoblastiques lors de l'implantation humaine, les cellules BeWo ont été cultivées sous forme de sphéroïdes en culture en suspension. Ces cultures ont ensuite été traitées pour un examen au microscope optique et électronique. La présente étude a montré que les sphéroïdes BeWo se composent de deux types de cellules qui sont de type cytotrophoblaste et de type syncytiotrophoblaste. Les cellules avec un diamètre nucléaire plus grand ne représentaient qu'environ 1% de la population cellulaire et semblent être celles du syncytiotrophoblaste. Par conséquent, le type cellulaire prédominant des sphéroïdes BeWo semblait être relativement indifférencié et ressemblant à un cytotrophoblaste. Environ 10% des cellules BeWo dans la présente étude étaient mitotiques, indiquant une population hautement proliférative. Le nombre total de cellules a augmenté d'environ 12 fois pendant la période de culture, passant de 107 ± 9 au jour 1 à 1211 ± 145 au jour 7 alors que le volume par cellule a augmenté d'environ 2 fois, passant de 1300 µm3 au jour 1 à 2400 µm3 au jour 7. Donc globalement la croissance des sphéroïdes BeWo est due à la fois à l'hyperplasie et à l'hypertrophie. Cependant, il semble que la prolifération cellulaire dépasse la croissance volumétrique. Ces données quantitatives montrent que les cellules BeWo se développent principalement par hyperplasie et fournissent des valeurs de base pour des études ultérieures. De plus, les résultats montrent que la morphologie des cellules BeWo présente des similitudes marquées avec celle rapportée pour le trophoblaste humain, ce qui en fait un modèle utile pour les études in vitro ultérieures.

Mots clés : BeWo Trophoblast Morphometric Spheroids.

RESUME : En un cultivo de suspensión se estudió la morfología de las células durante la implantación del trofoblasto humano, células BeWo. Estos cultivos fueron procesados ​​y examinados a través de microscopía de luz y electrónica. El estudio mostró que los esferoides BeWo constan de dos tipos de células, citotrofoblasto y sincitiotrofoblasto. Las células con mayor diámetro parecen ser los sincitiotrofoblasto que representaban sólo el 1% de la población celular. Por tanto, el tipo celular predominante de los esferoides BeWo parecían ser relativamente indiferenciados como citotrofoblasto. Alrededor del 10% de las células BeWo fueron mitóticas, lo que indica una población altamente proliferativa. El número de células totals aumenté alrededor de 12 veces durante el período de cultivo de 107 ± 9 días en el día 1 a 1211 ± 145 en el día 7, mientras al que el volumen de la crecieci,or300 de la creciecielula 1 a 1211 ± 145 en el día 7 día 1 hasta 2400 mm3 el día 7. Por lo tanto, el crecimiento global de esferoides BeWo se debe tanto a la hiperplasia como a la hipertrofia. Sin embargo, parece que la proliferación celular supera al crecimiento volumétrico. Estos datos cuantitativos muestran que las células BeWo crecen principalmente por hiperplasia y proporcionan valores de referencia para estudios posteriores. Además, los resultados muestran que la morfología celular BeWo ha marcado similitudes con los reportado para el trofoblasto humano, por lo que es un modelo útil para posteriores estudios in vitro.

Mots-clés : BeWo Trofoblasto Morfometría Esferoides.

INTRODUCTION

L'implantation humaine dépend d'une série d'interactions spécifiques entre les cellules trophoblastiques précoces du blastocyste et l'endomètre. Cependant, étant donné que les études systématiques in vivo sont pratiquement impossibles chez l'homme, il existe un besoin croissant de modèles de culture tissulaire appropriés. Étant donné que les principaux événements d'implantation se produisent au début de la grossesse, le tissu placentaire du premier trimestre est probablement la source la plus utile de cellules trophoblastiques pour les études in vitro (Aplin, 1996). Malheureusement, la récupération de quantités suffisantes de placenta humain normal au premier trimestre pour de telles études pose des problèmes éthiques ainsi que techniques. De plus, les cellules cytotrophoblastiques isolées du premier trimestre de la gestation ne peuvent pas être facilement propagées en culture (Irving et al., 1995 Frank et al., 2001 Abaidoo & Warren, 2008).

Une approche alternative consiste à examiner, in vitro, l'interaction d'embryons de FIV "de réserve" avec l'endomètre.

Bien que l'utilisation d'embryons de FIV "de rechange" pour des études d'observation puisse être autorisée, il existe encore des difficultés éthiques et pratiques importantes dans leur utilisation. Par exemple, les embryons « de rechange » sont souvent classés comme étant moins qu'optimaux (car ils n'ont pas été utilisés/sélectionnés pour le remplacement). Certains d'entre eux peuvent également avoir été congelés pendant de nombreuses années, ce qui peut affecter leur comportement. Il est également probable qu'il y en ait trop peu pour le type d'enquête quantitative nécessaire. Ces problèmes et d'autres ont limité l'étude des cellules trophoblastiques humaines précoces en cours d'implantation. Cependant, la similitude des cellules de choriocarcinome humain en culture monocouche avec les cellules trophoblastiques humaines normales en termes de morphologie et de production d'hormones (Pattillo et al., 1971) a permis à certains chercheurs d'utiliser ces cellules pour étudier certaines des propriétés du trophoblaste in vitro.

La lignée cellulaire tumorale trophoblastique humaine BeWo a été établie en culture en 1966 (Pattillo & Gey, 1968) à partir d'un choriocarcinome post-partal qui avait été transplanté en série dans la poche de la joue de hamster par Hertz (1959). Sa morphologie de base et sa différenciation ont été rapportées en culture monocouche par Grüumlmmer et al. (1994). Il a été suggéré que la lignée cellulaire BeWo est constituée de cellules de type cytotrophoblaste et de cellules géantes multinucléées qui ressemblent à des syncytiotrophoblastes (Grùumlmmer et al., 1990). Gruumlmmer et al. (1990, 1994) ont établi des sphéroïdes multicellulaires BeWo en culture qui ont certaines caractéristiques morphologiques et des sécrétions hormonales similaires aux cultures monocouches BeWo et aux cellules cytotrophoblastiques humaines normales in vivo.

Des études in vitro sur de telles lignées cellulaires trophoblastiques humaines peuvent fournir des informations sur les premiers stades de l'implantation humaine. Bien qu'il existe un grand nombre de rapports traitant des sécrétions hormonales des cellules BeWo, il semble y avoir peu d'informations publiées sur l'ultrastructure et les caractéristiques de croissance de ces cellules, en particulier des données morphométriques objectives. Par conséquent, afin de mieux comprendre les changements dans la taille des cellules BeWo, le complément des organites (et donc la fonction cellulaire) qui se produisent pendant la croissance des sphéroïdes, la présente étude a été conçue pour établir des données de base détaillées sur la morphologie des cellules BeWo cultivées en culture en suspension. en utilisant la microscopie optique quantitative. Plus précisément, les caractéristiques de croissance des sphéroïdes BeWo ont été étudiées à l'aide de techniques quantitatives objectives dans le cadre d'une enquête sur un modèle potentiel in vitro pour les cellules trophoblastiques humaines et également pour faire des comparaisons entre les méthodes morphométriques basées sur un modèle et basées sur la conception d'estimation du volume et du nombre. afin de faire des comparaisons avec les données publiées.

Matériel et méthode

Cultures cellulaires BeWo. Des cellules de choriocarcinome (BeWo, Human CCL, American Type Culture Collection Pattillo et Gey, 1968) ont été cultivées de manière routinière en monocouches par passage en série dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Gibco Life Technologies Limited, Paisley, Écosse) à 37 °C dans 1 % dioxyde de carbone et 95 % d'air dans des flacons de culture cellulaire de 25 ml (Costar, USA). Les cellules ont été repiquées par dispersion avec 0,5 % de trypsine/acide éthylène diamine tétra-acétique (EDTA) (Sigma Chemicals Company, Royaume-Uni) à température ambiante pendant 2 à 3 minutes avec interruption mécanique intermittente pour faciliter le processus de dissociation. Un microscope à contraste de phase (Cambridge Instruments, UK) a été utilisé pour surveiller le détachement des cellules BeWo. En deux minutes, les cellules se sont détachées du flacon et cinq millilitres de milieu de culture Dulbecco's Modified Eagle's Medium with Hams F12 (DMEM-F12, Gibco Life Technologies Limited, Paisley, Scotland) ont été ajoutés pour arrêter la dissociation supplémentaire des cellules. Deux millilitres de la suspension cellulaire unique ont été ensemencés dans chaque flacon de culture cellulaire de 25 ml contenant 5 ml de milieu de culture DMEM-F12, les flacons ont été légèrement bouchés et incubés à 37 °C dans une atmosphère de 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d'air. Les milieux de culture ont été changés toutes les 48­72 heures. Les procédures ci-dessus ont été réalisées dans des conditions aseptiques dans une armoire de culture tissulaire de classe II (Gelaire BSB4 A, Gelman SPA, Flow General, Rickmansworth, Angleterre).

Préparation des sphéroïdes cellulaires BeWo. Pour initier la culture de sphéroïdes, les cellules en croissance ont été récoltées en utilisant 0,5 % de trypsine/EDTA à température ambiante (comme ci-dessus). Les cellules ont été mises en suspension dans des milieux de culture DMEM-F12 et environ 7 x 105-1 x 106 cellules dans 10-15 ml de DMEMF12 ont été ajoutées à des boîtes de Pétri stériles de qualité non tissulaire (90 mm de diamètre) et placées dans un incubateur à 37 °C dans une atmosphère de 5% de dioxyde de carbone et 95% d'air pendant 16­24 heures. Le support a été changé toutes les 48 heures. De gros inoculums ont entraîné un développement plus rapide des sphéroïdes, tandis que l'utilisation de nombres inférieurs a pris plus de temps pour que les sphéroïdes se développent.

Traitement des tissus pour la microscopie optique. La suspension de sphéroïdes cellulaires BeWo a été transférée dans des tubes à centrifuger et centrifugée à 1000 tr/min pendant 5 minutes dans une centrifugeuse de paillasse (Jouan, France). Le surnageant a été retiré et environ 5 ml de glutaraldéhyde à 3 % préchauffé dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4) ont été ajoutés au culot restant contenant les sphéroïdes BeWo pendant 4 à 6 heures. Les sphéroïdes cellulaires BeWo ont ensuite été déshydratés par des solutions d'éthanol séquentielles (70 %, 80 %, 90 %, 100 %) pendant vingt minutes à chaque changement par centrifugation à 1000 tr/min et élimination du surnageant à chaque étape. Les sphéroïdes ont été retirés, avec un peu d'éthanol, dans des moules en plastique. L'éthanol a été collecté à l'aide d'une pipette Pasteur à pointe très fine puis la solution d'enrobage JB4 a été ajoutée aux sphéroïdes. Les sphéroïdes ont flotté pendant un moment puis se sont installés à la base du moule. Les moules ont été recouverts de supports métalliques et laissés à polymériser pendant 24 heures dans des conditions anaérobies. Certains des sphéroïdes déshydratés ont été clarifiés dans du chloroforme pendant 30 minutes, infiltrés dans de la cire pendant une heure et noyés dans de la cire pendant une nuit.

Des sections d'environ 2 et micromètres d'épaisseur ont été découpées dans chaque bloc JB4 à l'aide de couteaux en verre secs. Les coupes ont été aplaties en flottant à la surface de l'eau à température ambiante, recueillies sur des lames de microscope propres et séchées sur une plaque chauffante à 60 °C. Les lames ont été colorées soit avec du Fuschin aqueux à 1 % d'acide contre-coloré dans du bleu de toluidine à 0,05 % ou avec du bleu de toluidine à 1 % seul. Toutes les lames ont été examinées au microscope optique.

Des blocs de cire ont été sectionnés à environ 5 micromètres et colorés dans 1 % d'éosine aqueuse.

Traitement des tissus pour la microscopie électronique. Certains des sphéroïdes fixés comme décrit ci-dessus ont été traités pour la microscopie électronique par inclusion dans Epon en utilisant des procédures standard (Warren & Bedi, 1984). Des sections ultra-fines de couleur argent-or (environ 50-70 nm d'épaisseur) ont été découpées dans les mêmes blocs que ceux décrits ci-dessus à l'aide de couteaux en verre et recueillies sur des grilles de cuivre de 3,05 mm 200 mesh qui ont été colorées avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb. ont été examinés et des micrographies prises à l'aide d'un microscope électronique à transmission Philips 301 à une tension d'accélération de 60 kv. Les négatifs ont été visualisés à l'aide d'un microscope à projection.

Mesure de l'épaisseur de la section. L'épaisseur de certaines des coupes semi-minces à l'ultramicrotome a été mesurée à l'aide d'un microinterféromètre (Microscope à interférence Vickers Patholux). Avec cet instrument, un faisceau de lumière monochromatique de longueur d'onde 546 nm a été passé à travers la section et la différence de chemin optique (OPD) a été mesurée en référence à une région de fond vide.

L'épaisseur de la section (t) a été trouvée à partir de :

t = OPD l/µ m - µ a (Goldstein & Hartmann-Goldstein, 1974)

OPD = différence de chemin optique en fraction de longueur d'onde

l = longueur d'onde de la lumière utilisée

µ m = indice de réfraction du média (1,51)

µ a = indice de réfraction du milieu dans lequel les mesures sont effectuées (1.00)

La valeur obtenue à partir de chaque section a été utilisée dans les calculs appropriés pour les densités numériques et le calcul du volume comme décrit ci-dessous.

Mesure du diamètre des sphéroïdes BeWo. Les diamètres majeur et mineur de chaque sphéroïde ont été obtenus en prenant des mesures perpendiculaires du diamètre de sphéroïde sur chacun des 8 sphéroïdes choisis au hasard à l'aide d'un microscope optique à contraste de phase inversé équipé d'un réticule oculaire calibré. A des intervalles de 24 heures, les sphéroïdes ont été mesurés et remis en culture. Les sphéroïdes ont été fixés après sept jours, traités et sectionnés comme décrit ci-dessus. Les diamètres majeur et mineur de la section la plus centrale de chaque sphéroïde ont été mesurés sur les sections semi-minces. La taille de l'échantillon de 8 s'est avérée optimale à partir d'une étude pilote.

Morphométrie

Estimations de fraction volumique. La fraction volumique (Vv) du noyau à la cellule a été estimée à l'aide d'une technique de comptage de points (Williams, 1977) et d'un réseau carré de 5 µm (la séparation des points sur le tissu est de 6,2 µm) à l'aide d'un tube de tirage attaché à un Olympus (BH-2). Au moins cinq champs de vision échantillonnés systématiquement au hasard et ne se chevauchant pas ont été examinés pour chaque lame de tissu. Le réseau carré a été superposé sur l'image du tissu et le nombre de points tombant sur les noyaux et le nombre total de points tombant sur les cellules entières ont été enregistrés (Weibel, 1979). La fraction volumique du noyau à la cellule a été calculée à l'aide de la formule :

Pn = nombre total de points sur les noyaux, et

Pc = nombre total de points sur les cellules.

Estimation des diamètres des profils nucléaires des cellules BeWo. Les diamètres majeur et mineur des profils nucléaires BeWo ont été mesurés à l'aide d'un tube de dessin attaché à un microscope Olympus (BH-2) et d'une tablette numériseur reliée à un micro-ordinateur à l'aide d'un logiciel préalablement écrit (Warren & Bedi). Les mesures ont été faites sous immersion dans l'huile à un grossissement de X 810, déterminé à l'aide d'un micromètre à platine. Le diamètre moyen du profil nucléaire et son rapport axial ont été calculés à partir des valeurs des deux axes en utilisant les équations :

diamètre moyen = &diviser (a ¥ b) (Warren & Bedi),

où a = diamètre du profil principal et

b = diamètre de profil mineur.

Rapport axial = (Diamètre de profil majeur)/ (Diamètre de profil mineur)

où 1.0 = un profil circulaire.

Estimation de la surface et du volume du sphéroïde cellulaire BeWo. Le volume des sphéroïdes BeWo a été estimé en utilisant le principe de Cavalieri (Mayhew, 1991). Une pile de sections parallèles a été découpée à travers les sphéroïdes avec une séparation d'environ 5 µm (réglage au microtome) entre les sections successives. L'épaisseur de chacune des sections en série a été mesurée par interférométrie. Les sections ont été sélectionnées systématiquement à partir de la pile de sections, en prenant chaque dixième section à partir d'un départ aléatoire (Mayhew). La fraction d'échantillonnage a été prédéterminée à partir d'une étude pilote. À l'aide d'un tube à dessin attaché à un microscope, les zones des sphéroïdes BeWo ont été estimées à un grossissement de X 810 en utilisant une technique de comptage de points et un réseau carré de 5 mm (la séparation des points sur le tissu était de 6,2 & microm). Le nombre de points tombant sur chaque sphéroïde cellulaire a été enregistré et les aires et volumes des sphéroïdes ont été calculés à l'aide de l'équation suivante (Mayhew) :

SP = nombre total de points de test tombant sur le sphéroïde, et a(p) = l'équivalent surfacique d'un point de test (distance entre les points sur la grille/le grossissement),

d = intervalle/distance entre les sections qui a été obtenu à partir de la somme des épaisseurs de section des sections intermédiaires.

Estimation de la densité numérique des noyaux cellulaires BeWo à l'aide de :

La méthode dissecteur. La densité numérique des noyaux dans les sphéroïdes cellulaires BeWo a été estimée à l'aide de la méthode des dissecteurs. Cette méthode nécessite une série de sections parallèles, espacées d'une distance connue pour être coupées à travers l'échantillon (Sterio, 1984 Gundersen, 1986). Un empilement de sections semi-minces a été découpé à travers un échantillon de sphéroïdes à partir duquel des paires de sections (Dissecteurs) ont été choisies. Au sein de chaque dissecteur, la première section a été désignée comme section de référence et la deuxième section comme « recherche ». La collecte des données pour les sphéroïdes a été effectuée sur l'analyseur d'images Quantimet 970 (Cambridge Instruments Ltd).

Douze paires de coupes semi-fines colorées au bleu de toluidine ont été utilisées pour chaque sphéroïde. Au total, 6 sphéroïdes ont été utilisés. Les 12 dissecteurs ont été prélevés dans les coupes en série selon un schéma d'échantillonnage aléatoire systématique. L'image de la coupe de référence (par exemple la coupe 2) a été projetée sur un écran et les profils nucléaires de tous les noyaux dans le cadre d'échantillonnage ont été tracés sur des feuilles d'acétate à l'aide d'un stylo soluble dans l'eau. Comme il y avait un noyau par cellule, le noyau a été utilisé comme unité de comptage pour la cellule. Le processus a été répété pour la section « recherche » (par exemple, la section 3). La feuille d'acétate avec le contour des profils nucléaires de la section de référence a été superposée sur l'image de la section « recherche » et le nombre de profils de chaque noyau vu dans la section de référence mais non vu dans la section de recherche a été compté et représenté par Q-. Afin d'améliorer l'efficacité de la procédure, le comptage a été répété sur les deux mêmes sections mais dans le sens inverse du premier comptage : c'est-à-dire compter le nombre de profils manquants dans la section 3 (maintenant la section de référence) à partir du "look- section supérieure (section 2) (Gundersen, 1986). Dans la présente étude, 12 dissecteurs ont été utilisés dans chaque direction pour un total de 24 dissecteurs. Le nombre de dissecteurs a été prédéterminé à partir d'une étude pilote. La densité numérique des noyaux cellulaires BeWo (Nv) a été estimée à l'aide de la formule (modifiée de Sterio, 1984) :

SQ- = somme des profils nucléaires présents dans la section de référence mais absents de la section 'look-up',

A = aire moyenne du profil sphéroïde,

Sh = somme de la distance entre la section de référence et la section « recherche » pour chaque dissecteur

La méthode Dehoff & Rhins. La densité numérique des noyaux dans les sphéroïdes cellulaires BeWo a également été estimée à l'aide de la méthode DeHoff & Rhines (1961), une méthode traditionnelle basée sur un modèle. Une section semi-fine colorée au bleu de toluidine de chacun des sphéroïdes BeWo a été utilisée. Une trame de comptage non biaisée de surface connue (Gundersen, 1977 Weibel) a été superposée à l'image du sphéroïde et le nombre de profils présents dans la trame de comptage a été enregistré et le nombre par unité de surface déterminé. Seuls les profils de particules ne touchant pas les lignes d'exclusion ont été comptés (Calverley et al., 1988). Les mesures du diamètre moyen des profils nucléaires BeWo ont été obtenues à l'aide du numériseur, comme décrit précédemment. Les estimations du diamètre moyen du profil obtenues ci-dessus donnent une sous-estimation du vrai diamètre moyen du profil. Par conséquent, la procédure de correction du diamètre de Schwartz-Saltykov (Williams, 1977) a été appliquée et le diamètre moyen corrigé des particules obtenu. La densité numérique a été obtenue en utilisant la formule suivante :

Na = nombre de profils par unité de surface

H = diamètre moyen de l'étrier

t = épaisseur de la section (voir ci-dessous)

La densité numérique des cellules BeWo a été calculée de 3 manières en utilisant (i) l'épaisseur de section mesurée, (ii) l'épaisseur de section supposée de 0,5 mm et (iii) en supposant que l'épaisseur est négligeable (Williams).

Estimation du nombre de cellules BeWo sur la base de :


Le Disecteur. Les profils nucléaires manquants (Q-) ont été comptés comme décrit ci-dessus. La densité numérique a été estimée à partir de la formule donnée précédemment et le Nv multiplié par le volume du sphéroïde (Vs) pour donner le nombre total de cellules dans le sphéroïde.

Nombre total de cellules = Nv x Vs

Le fractionneur. Le nombre de cellules BeWo par sphéroïde a été estimé à l'aide du fractionneur (Mayhew). Les profils nucléaires manquants ont été comptés sur les mêmes paires de sections utilisées pour le dissecteur. Le comptage des cellules a été effectué dans les deux sens comme décrit précédemment. La distance h entre les sections parallèles et le volume des sphéroïdes ne sont pas nécessaires pour cette méthode car toutes les cellules du sphéroïde étaient disponibles pour l'échantillonnage. Une fraction d'échantillonnage de 1/5 a été utilisée. Le schéma d'échantillonnage utilisé dans cette étude n'a été utilisé qu'au premier niveau de fractionnement, car les sphéroïdes étaient suffisamment petits pour les sectionner complètement en série sans qu'il soit nécessaire de procéder à un sous-échantillonnage. L'estimation du nombre (N) a été obtenue à partir de :

f = réciproque de la fraction d'échantillonnage.

Comptage direct des cellules sphéroïdes. Les sphéroïdes ont été retirés à différents moments de la culture, mesurés à l'aide d'un réticule oculaire et désagrégés par incubation avec 0,25% de trypsine/EDTA. Le nombre de cellules dans ces suspensions monodispersées a été simplement compté directement à l'aide d'un microscope à dissection (Wild M32, Heerbrugg, Suisse). La procédure a été répétée en estimant le nombre de cellules à l'aide d'un hémocytomètre (Nebauer amélioré, Hausser Scientific Partnership, Horsham, USA) de la manière standard.

Détermination du nombre de cellules mitotiques. Des comptages simples de profils de cellules mitotiques ont été effectués à un grossissement d'environ X 1000 avec un cadre de comptage non biaisé (Gundersen, 1977). Le cadre de comptage était superposé à l'image du sphéroïde. Le nombre de profils cellulaires mitotiques et le nombre total de profils cellulaires dans le cadre ont été comptés et enregistrés. Chaque sphéroïde a été échantillonné systématiquement. La proportion de cellules mitotiques a ensuite été calculée. Des indices mitotiques ont été obtenus pour chaque sphéroïde, ceux-ci ont ensuite été regroupés et les moyennes et erreurs types calculées par expérience.

Analyses statistiques. Les valeurs individuelles ont été regroupées au sein des groupes et les moyennes et les erreurs types ont été calculées pour chaque groupe. Les données de fraction volumique et le rapport axial du profil nucléaire ont subi des transformations logarithmiques pour rendre les valeurs adaptées à l'analyse statistique. Les données sur les diamètres du profil nucléaire, le volume et la densité numérique ont été testées directement. Les données ont été analysées à l'aide de tests t de Student appariés ou non appariés, selon le cas, pour comparer les différences entre 2 groupes et une analyse de variance à un facteur (ANOVA) a été utilisée pour examiner les différences de diamètre des sphéroïdes au fil du temps en culture.

Les estimations de nombre obtenues par le fractionneur et celles dérivées en combinant le principe de Cavalieri et la méthode du dissecteur ont été soumises à un test de corrélation. Les données non transformées sont présentées dans les tableaux.

Fraction volumique (Vv) de la cellule occupée par le noyau. Les fractions de volume de la cellule BeWo occupée par le noyau sont données dans le tableau I. Le Vv était numériquement plus grand dans les sphéroïdes BeWo de 7 jours (D7) que les sphéroïdes de 1 jour (D1), mais ce n'était pas significatif à P 0,05. Le coefficient de variation de cette caractéristique dans les sphéroïdes D1 (5 %) était similaire à celui du groupe D7 (4 %).

Dimensions du profil nucléaire et rapport axial du profil nucléaire. Les dimensions du profil nucléaire des cellules D7 étaient plus grandes (P < 0,001) que les sphéroïdes D1 (tableau I). Le rapport axial du profil nucléaire des deux groupes était remarquablement similaire. Les coefficients de variation du rapport axial pour les sphéroïdes D1 et D7 étaient les mêmes (3%).

Diamètre moyen des sphéroïdes. Pendant la période de culture, le diamètre (mesuré directement) des sphéroïdes a augmenté (P < 0,001, ANOVA) linéairement d'une moyenne de 103 ± 26 µm le premier jour à 361 ± 33 µm le jour 7. Le diamètre moyen après fixation et traitement des sphéroïdes âgés de 7 jours était de 315 ± 28 µm. Ceci était significativement (P < 0,001) inférieur (de 13%) au diamètre moyen du sphéroïde de 361 ± 33 µm obtenu par mesure directe. Il y avait une forte corrélation positive (r = 0,998 P < 0,01) entre le diamètre du sphéroïde des deux méthodes.

Volume de sphéroïdes. Les estimations de volume pour les sphéroïdes âgés de 1 et 7 jours pour les méthodes basées sur la conception et basées sur un modèle sont données dans le tableau II. Le volume moyen des sphéroïdes âgés de 7 jours était de 2,6 + 0,4 x 10-3 mm3. C'était significativement (P < 0.01) plus grand que le volume moyen des sphéroïdes d'un jour (1,4 ± 0,2 x 10-4 mm3). Les estimations de volume de sphéroïde obtenues par la méthode basée sur un modèle ont augmenté de manière significative (P < 0.01) de 1,7 ± 0,6 x 10-3 mm3 à 2,9 ± 1,0 x 10-2 mm3. Les coefficients de variation de cette caractéristique pour les estimations fondées sur un modèle étaient environ le double de ceux des estimations fondées sur le plan.

Estimations de densité numérique. La densité numérique moyenne des sphéroïdes fixés après 7 jours de culture était significativement (P < 0,001) inférieure à celle des sphéroïdes D1 (tableau II). Les valeurs moyennes pour les sphéroïdes âgés de 1 et 7 jours des méthodes DeHoff & Rhines et Disector sont comparées dans les tableaux III et IV. La densité numérique moyenne des sphéroïdes D1 obtenus par la méthode DeHoff & Rhines était de 2,96 ± 0,19 x 105 mm-3. Ceci était significativement (P < 0,001) inférieur (de 63%) à la valeur du dissecteur de 7,95 ± 0,59 x 105 mm-3 (tableau III). Il n'y avait pas de corrélation entre les données des deux techniques (tableau III).

Pour les sphéroïdes de 7 jours, la densité numérique obtenue par la méthode du dissecteur, en utilisant une section supposée.

épaisseur de 0,5µm (3,21 ± 0,25 x 105 mm-3) était significativement (P < 0,01) inférieure à celle obtenue en utilisant l'épaisseur de section mesurée (4,96 ± 0,34 x 105 mm-3) (tableau IV). De même, le Nv des sphéroïdes D7 obtenu par la méthode DeHoff & Rhines, en utilisant l'épaisseur de section mesurée était significativement (P < 0,001) inférieur (1,56 ± 0,14 x 105 mm-3), par rapport à la valeur Disector de 4,96 ± 0,34 x 105 mm-3 (tableau IV). Le Nv obtenu par la méthode DeHoff & Rhines en utilisant une épaisseur de section supposée de 0,5 µm (1,54 ± 0,14 x 105 mm-3) était également significativement (P < 0,01) inférieur à celui de la méthode Disector (3,21 ± 0,25 x 105 mm- 3) mais il n'y avait pas de corrélation entre ces résultats (tableau IV).

La densité numérique moyenne dérivée par la méthode DeHoff & Rhines en supposant que l'épaisseur de la section est négligeable, l'épaisseur de la section mesurée et l'épaisseur de la section supposée se sont avérées être de 1,60 + 0,14 x 105 mm-3, 1,56 + 0,14 x 105 mm-3 et 1,54 ± 0,14 x 105 mm-3 respectivement (tableau V). Cela a entraîné des réductions significatives (P < 0,001) de 68 %, 69 % et 69 % par rapport à la valeur du dissecteur de 4,96 + 0,34 x 105 mm-3.

Estimations du nombre. Les estimations de nombre obtenues en combinant la méthode Disector avec le principe de Cavalieri pour la détermination du volume dans les sphéroïdes D1 et D7 étaient de 107 ± 9 et 1211 ± 145 respectivement (tableau VI) et les valeurs étaient significativement différentes (P < 0,001). Les estimations du nombre obtenues par la méthode du fractionnement étaient de 108 ± 9 (D1) et 1070 ± 60 (D7), ce qui était également significativement (p < 0,001) différent. Pour les sphéroïdes âgés de 1 et 7 jours, les estimations de nombre obtenues à l'aide des deux techniques ne différaient pas significativement (P ) et il y avait une forte corrélation positive (r = 0,850 P < 0,05) entre les résultats des deux techniques. Cependant, les estimations de nombre dérivées par la méthode DeHoff & Rhines étaient significativement inférieures à celles obtenues par les méthodes basées sur le plan (43 ± 8 pour D1 et 415 ± 86 pour D7). Les coefficients de variation de cette caractéristique pour les estimations fondées sur un modèle étaient environ le double de ceux des estimations fondées sur le plan.

La présente étude a examiné la morphologie détaillée d'une lignée cellulaire de choriocarcinome BeWo en utilisant un système de culture où les cellules se développent dans des sphéroïdes. Cela semble être la première étude de la détermination du volume et du nombre de cellules BeWo à l'aide de méthodes morphométriques basées sur la conception. Des comparaisons ont été faites entre les méthodes morphométriques basées sur le plan et celles basées sur un modèle. Des différences importantes ont été observées entre les estimations obtenues par ces deux méthodes morphométriques.

Les résultats quantitatifs et qualitatifs de la présente étude ont montré que les sphéroïdes BeWo se composent de deux types de cellules, des cellules de type cytotrophoblaste et de type syncytiotrophoblaste, les cellules de plus grand diamètre nucléaire ne représentant qu'environ 1% de la population cellulaire. These appear to be syncytiotrophoblast-like cells. The predominant cell type of the BeWo spheroids appeared to be relatively undifferentiated and cytotrophoblast-like. This finding is in agreement with previously published reports although their conclusions were based on qualitative analyses. Aplin reported that the BeWo cell line is heterogenous with a population of approximately 1% multinuclear giant cells.

About 10% of the BeWo cells in the present study were mitotic indicating a highly proliferative population. Grümmer et al. (1990) used the bromo-deoxyuridine anti-bromo-deoxyuridine technique to detect proliferating cells in BeWo spheroids. The authors reported that proliferating cells were distributed all over spheroids at all stages of cell division and in class sizes of spheroids up to 520 µm in diameter. Cell proliferation in human trophoblast cells (Genbacev et al., 1993) has been assessed using proliferative cell nuclear antigen (PCNA) antibodies specific for dividing cells (Waseem & Lane, 1990). Genbacev et al. (1993) have shown that cytotrophoblast cells of the cell columns or clusters, some villous cytotrotrophoblast cells, and migrating extravillous trophoblast (EVT) cells from tissue explants of anchoring villi are PCNA positive. However, nuclei of syncytiotrophoblast and EVT cells outside the cell columns remained unstained (Okudaria et al., 1991). The proliferative capacity of cyto-trophoblast cells has also been assessed using a different antibody raised against dividing cell nuclear antigen Ki67 (Castellucci et al., 1991 Genbacev et al., 1992). The localization and distribution of Ki67 antigen in first trimester placentae has been reported to be the same as that for PCNA (Genbacev et al., 1993 Hermes et al., 2008). Therefore, it appears that under both in vivo and in vitro conditions migrating cytotrophoblast cells, cytotrophoblast cells in clusters, and BeWo cells retain proliferative activity.

The volume fraction of BeWo cells occupied by nucleus was not significantly different in the D7 and D1 spheroids although the nuclear profile dimensions were significantly larger in D7 cells compared with D1 cells. This was due to a corresponding increase in cytoplasmic volume during 7 days in culture as confirmed by cell volume estimates. Increased nuclear profile diameter often reflects increased transcription in the nucleus (Junqueira et al., 1992).

In the present study, determination of nuclear profile dimensions was made in order to assess the changes in size and shape of the BeWo cells during the culture period. In addition, it was used in combination with volume fraction estimates to make comparisons about both nuclear changes and alterations in other parts of the cell, such as in relative cytoplasmic or overall cell volume. While it is recognized that the nuclear profile diameter has its limitations as a direct estimator of nuclear dimensions, it was found in the present study that it was useful for interpreting Vv data. Grümmer et al. (1990) reported a "high nuclear to cytoplasm ratio" when BeWo cells were put in suspension culture compared with monolayer BeWo cultures. Their conclusions were made on purely qualitative basis whereas in the present study Vvs were estimated by point counting techniques and the nuclear profile dimensions measured directly.

The present data show a significant increase in diameter between the D1 and D7 spheroids. These results are in agreement with some published reports. Grümmer et al. (1990) reported on the effect of time in culture on the diameter of BeWo spheroids grown in suspension culture. The sizes of the spheroids in their study were bigger (226 ± 49 µm on day 1 and 524 ± 117 µm on day 9) than those of the present study. In another study Grümmer et al. (1994) reported that after 11 days in culture the mean diameter was 500 µm for BeWo, 660 µm for Jeg-3, and 1000 µm for JAr spheroids. White et al. (1988) grew JAr cells in suspension culture and reported that the diameter of the spheroids increased with time in culture from a mean of 125.1 ± 8.8µm on day 5 to a mean of 841.3 ± 76µm on day 15. The differences between values obtained in these studies and the present study was probably due to differences in content of FCS, 10% (White et al. 1988) and 15% (Grümmer et al., 1990, 1994) compared with 2.5% used in the present study. However, Yuhas & Li (1978) reported that multicellular spheriod growth rates remained identical when the FCS concentration of the medium was varied between 2 and 10%.

Other investigators (Yuhas & Li Landry et al., 1982) have reported that spheroids from other cell types such as fibrosarcoma induced by methylcholanthrene in a C3H mouse (FSA) and a radiation induced mammary carcinoma from a BALB/c mouse (MCa-11) enlarge exponentially for a few days and then continue on a linear growth curve before reaching a critical diameter beyond which there is no further increase in size.

Some necrotic cells were found scattered in the spheroids in the present study, but there was no evidence of a central zone of necrosis. In addition the BeWo spheroids had small cavities which were devoid of cells adjacent to and surrounded by areas of viable cells. It is likely that the diffusion of nutrients and metabolites was still sufficient to support all cells at this stage and so few cells died by necrosis. The observation of intercellular cavities within the spheroids together with the scarce scattered pattern of necrosis formation are similar to the findings of Grümmer et al. (1990) and White et al., although in the latter study JAr cells and not BeWo cells were used. Development of central necrosis has been shown to vary considerably in spheroids of different cell lines although in most spheroid systems a central necrotic core begins to develop at diameters greater than 250 µm (Soranzo et al., 1986 White et al.). For example, V79 spheroids of more than 250 µm in diameter develop a necrotic core (Grümmer et al., 1990) while spheroids of other cell lines such as spheroids of human bladder carcinoma origin could reach diameters of about 500 µm or even 700 µm before central necrosis occurred in them (Erlichman & Tannock, 1986 Hermes et al.).

Various cellular and extracellular processes such as hyperplasia, cellular hypertrophy, and interstitial growth may contribute to BeWo spheroid growth. Changes in spheroid diameter are not adequate for the detection of subtle changes in spheroids. Therefore, BeWo spheroid volume was estimated using a design-based morphometric method. A simple model-based method was also used in order to compare the results obtained in the present study to published reports. Spheroid volume estimates using Cavalieri's method increased, about 20 times between 1 and 7 days in culture, from 1.4 ± 0.2 x 10-4 mm3 to 2.57 ± 0.4 x 10-3 mm3. These were about 10 times lower than the estimates derived by the model-based method (1.7 ± 0.6 x 10-3 mm3 to 2.9 ± 1.0 x 10-2 mm3). Model-based volume estimates obtained in the present study are in broad agreement with those of earlier studies (White et al. Grümmer et al., 1990, 1994), but differ in detail there was a general increase in spheroid volume and spheroid growth was linear over the culture period. However, model-based volume estimates obtained in the present study (1.7 ± 0.6 x 10-3 mm3 to 2.9 ± 1.0 x 10-2 mm3) are lower than those of previous studies (6 x 10-3 mm3 to 7.5 x 10-2 mm3, reported by Grümmer et al., 1990). In these reports, unfixed spheroids were used and measurements were obtained from a phase contrast microscope fitted with an eyepiece graticule.

The reliability of model-based methods depends on how closely the model mimics the real object. The traditional model-based volume methods used by these investigators as a means of quantifying the growth of BeWo, Jar, and Jeg-3 spheroids rely on perpendicular measurements of spheroid diameter and calculation of the volume using the equation V = 4/3pr3, which assumes that the spheroids are perfect spheres. However, BeWo spheroids differ in shape and often deviate considerably from sphericity. In addition, since the formula used for the volume estimates used the radius as part of the product, it is sensitive to even small changes in diameter. Therefore, the results obtained by this method are likely to be, at least to some extent, inaccurate and unreliable.

In order to make improved estimates of volume, it is necessary to use appropriate stereological methods of proven reliability and accuracy (Mayhew et al., 1990). The Cavalieri principle as used in this study combines a point counting technique with section thickness measurements and does not require assumptions about object shape or spatial orientation (Mayhew). The great advantage of this method is that it is design-based and not model-based and offers unbiased estimates free of simplistic and often erroneous assumptions. Application of the Cavalieri principle to a wide variety of tissues and organs has demonstrated high efficiency and reliability, although it has been reported to be time-consuming and labour-intensive (Mayhew et al., 1990).

Mayhew, 1991 and others have shown that the volume of anything which can be recognized unequivocally from its profiles can be determined by generating slices and estimating volumes from the slices. The two requirements of the Cavalieri principle are (i) a complete set of parallel sections through the entire object and the mean distance between the sections must be available, (ii) the slices are selected in a systematic random manner. The Cavalieri principle has been used to estimate the volume of brain (Mayhew et al., 1990) multicellular colon carcinoma spheroids (Bauer et al., 1995) and breast tumor volume (Ladekarl et al., 1997). These authors reported that the Cavalieri principle is an efficient, reproducible and unbiased method.

Mayhew et al. (1990) have shown that, for physical slices, the volume obtained by fluid displacement correlates extremely well with Cavalieri volume estimates. Weibe & Laursen (1995) estimated the volume of human lung using both the Cavalieri's principle and fluid displacement. They concluded that both methods are reliable, with Cavalieri's principle being superior. Therefore the Cavalieri-based volume estimates from the present study are likely to be reliable and accurate.

The growth within BeWo spheroids were also assessed using design-based stereological methods. The results of the present study show that the volume of the spheroids increased with time in culture. The question then arises as to whether the increase is due to hypertrophy of the cells or hyperplasia. Growth within the spheroids was monitored as total number of nuclei (a measure of nuclear proliferation) and volume per nucleus (a measure of hypertrophy). The latter was estimated by calculating the volume of the spheroid associated with each nucleus qualitative light and electron microscopic studies showed cells to be mononuclear.

There was a significant decrease (38%) in the numerical density of BeWo cell nuclei after 7 days in culture. It is likely that an increase in the overall volume containing the cells contributed to the observed decrease in numerical density of the day 7 BeWo spheroids compared with the day 1 spheroids.

The results of the present study demonstrate that total cell number increased about 12 times during the culture period whereas the volume per cell increased about 2 times, from 1300 µm3 on day 1 to 2400 mm3 on day 7 (combining spheroid Cavalieri volume estimates and total cell number obtained by the Fractionator method). Therefore overall growth of BeWo spheroids is due to both hyperplasia and hypertrophy. However, it appears that cell proliferation outstrips volumetric growth. The present study shows that BeWo cells proliferate and that some of the cells are lost by necrosis. However, this loss is replaced by mitosis and that the total number of cells actually increases.

Grümmer et al. (1990) used a haemocytometer to determine the cell number in BeWo multicellular spheroids. They reported that the number of cells per spheroid increased from 813 at a volume of 6 x 10-3 mm3 to 8913 cells at a volume of 7.5 x 10-2 mm3. Simpson et al. (1992) and Mayhew et al. (1994) using human placentae, also showed that trophoblast, stroma, and endothelial cells proliferate from the first trimester of pregnancy to term. They concluded that placental growth occurs, wholly or in part, by hyperplasia. Therefore the present study appears to support the notion that during gestation, cytotrophoblast cells proliferate thereby contributing to the increasing volume of the placenta.

So far nothing appears to have been reported in the literature about the use of quantitative techniques to estimate the number of cells present in BeWo spheroids. Estimates of the number of cells obtained by the Fractionator method was numerically lower for D1 spheroids and higher for D7 spheroids when compared with those obtained by the haemocytometer and the dissecting microscope. However, the estimates obtained by combining the Disector method and the Cavalieri's principle for volume estimation were not significantly (P 0.05) different from the Fractionator values.

The great advantage of the combined Cavalieri principle and the Disector method is that they are both design-based and not model-based. Mayhew et al. (1994) studied the growth of the human placenta during gestation using numerical density estimates based on the Disector and the corresponding volume estimates. West & Gundersen (1990) used this technique to estimate the number of neurons in the human hippocampus. Ladekarl et al. (1997) estimated the total number of cancer cell nuclei in breast cancer tumors using the optical Disector and the volume of the tumor (estimated by the Cavalieri principle). They concluded that the estimates obtained by this technique are unbiased and highly reproducible.

There was no correlation between the results obtained by the Disector and the model-based method in the present study. The reasons for this remain unclear but it appears to suggest that as well as producing different absolute values, the two methods are different in distribution estimates. Similar results were obtained by Akbar (1991) in the nervous system.

Comparison of numerical density values for D7 spheroids obtained by the Disector was made using both assumed (0.5µm) and measured section thicknesses. These results showed that the numerical density estimates based on the assumed section thickness were consistently lower, compared with values based on the measured section thickness. Since the measured section thickness was found to be consistently less than the assumed section thickness, the lower numerical density estimates was as predicted. The importance of accurately determining section thickness is therefore apparent, especially for the Disector where it contributes to the product in the denominator. In contrast, the Fractionator does not require the thickness of the individual sections.

As above, the results for the DeHoff & Rhines method showed estimates using measured section thickness to be consistently lower than those where t = 0 but numerically marginally higher compared with values based on the assumed section thickness. This was entirely to be expected from the formula used for the numerical density estimation. Also the correlation of the data based on the three section thicknesses was excellent.

As mentioned above, the Disector and the Cavalieri methods for volume estimation both require serial sectioning and knowledge of the distance between the sections, usually found from the true section thickness. It is therefore necessary to measure the exact thickness of the sections being used for both methods. In the present study section thicknesses were measured by interferometry. This method was chosen because of its accuracy and reproducibility (Goldstein & Hartmann-Goldstein Williams). A drawback of this method, however, is that sections have to be measured before staining and mounting. A solution to this problem was reported by Bedi (1987). He showed that a light vertical cut can be made on one side of the face of the block dividing it into small and large portions. The smaller piece is collected and its thickness measured while the larger one is stained and mounted for the appropriate measurement.

It is well documented that the true thickness of sections is often different from the microtome setting (Bedi Akbar, 1991 Warren, 1992). Such differences may be due to variations in mechanical and thermal changes and compression during sectioning (Mori & Christensen, 1980 Ohno, 1980). Using interferometry, the measured section thickness of semi-thin Araldite-embedded sections (mean 0.44µm, range 0.16-0.80µm) and ultra-thin (mean 54.4 nm, range 43.4-71.2 nm) were found to be an underestimate of the microtome setting (0.5 µm) (Warren, 1992). The estimation of section thickness from interference colours has also been reported to be subject to large and inconsistent errors (Williams, 1977). Neither the advance setting of the ultramicrotome nor the evaluation of section thickness by observing the reflected light interference colour can be relied upon. Therefore the actual section thickness of sections for quantitative studies must be verified by measurement.

In conclusion, these quantitative data show that BeWo cells grow mainly by hyperplasia and provide baseline values for further studies. In addition, the results show that BeWo cell morphology has marked similarities to that reported for human trophoblast, making it a useful model for subsequent in vitro studies. Furthermore results of the present study reinforce the need to base conclusions on objective unbiased estimates rather than traditional model-based methods.


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Dr. Chrissie Stansie Abaidoo
Department of Anatomy
School of Medical Sciences
Kwame Nkrumah University of Science and Technology
Kumasi
GHANA

Received: 01-06-2010
Accepted: 23-09-2010

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