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Analyse par cytométrie en flux


J'ai réalisé une expérience dans laquelle j'ai stimulé des cellules (lignée cellulaire) avec un médicament à différents moments - sous sa forme non modifiée (Drug) ou modifiée (H-Drug ou M-Drug).

Toutes les cellules sont ensemencées à la même concentration et toutes sont récoltées pour analyse le même jour.

Méthode:

Les cellules ont été ensemencées le même jour. Les cellules ont été stimulées à 3h00 un mercredi (point de temps de 24 heures). Les cellules ont ensuite été stimulées à 09h00 le jeudi (heure à 6 heures) suivies de 12 heures le jeudi (heure à 3 heures) et ainsi de suite jusqu'à 15 heures le jeudi - à ce moment-là TOUS les cellules ont été récoltées et placées dans des tubes séparés selon ce avec quoi elles ont été stimulées et quand, par ex. Médicament M de 3 heures.

Tous les tubes ont été analysés en séquence pour mesurer le pourcentage de cellules dans ce tube à essai qui se sont révélées positives pour ce médicament (c'est-à-dire comme moyen de mesurer l'absorption du médicament)

Question: J'ai mesuré le pourcentage d'absorption d'un médicament à différents moments (0,5 à 24 heures) pour les trois variantes de médicament. Le % d'absorption est considéré comme le % de cellules qui se colorent positivement pour ce médicament

Quel serait le bon test de statistiques ? Une ANOVA à 3 voies aurait-elle un sens ?


Cytométrie en flux

La cytométrie en flux est une technologie qui utilise un ou plusieurs lasers pour fournir une analyse multiparamétrique de cellules individuelles. Chaque cellule ou particule est analysée par diffusion de lumière visible ou par fluorescence car les cellules passent rapidement devant chaque laser. Indépendamment de l'analyse de diffusion de la lumière, les mesures de fluorescence sont obtenues par transfection et expression de protéines fluorescentes courantes (par exemple, la protéine fluorescente verte, GFP) et par coloration avec des anticorps conjugués par fluorescence ou des colorants fluorescents. La cytométrie en flux est une technologie puissante qui est couramment utilisée dans les applications de recherche en biologie moléculaire et cellulaire, y compris l'immunologie, la biologie du cancer et la recherche sur les maladies.


Cytométrie en flux

L'installation de cytométrie en flux du Kimmel Cancer Center est la seule installation partagée de ce type sur le campus TJU à fournir des capacités de tri et d'analyse de cellules activées par fluorescence à la pointe de la technologie. En plus des membres du Kimmel Cancer Center (KCC), de nombreux chercheurs de plusieurs départements du campus utilisent régulièrement l'installation. Les applications les plus couramment utilisées sont le phénotypage de surface cellulaire multicolore, la détection de cytokines intracellulaires et de molécules de signalisation, les mesures de transfection, les études d'apoptose, l'analyse du cycle cellulaire, la prolifération cellulaire et l'analyse en temps réel de la cinétique de mobilisation du Ca2+. Les trieurs, analyseurs et postes de travail permettent une caractérisation abordable, fiable et précise d'une grande variété d'échantillons biologiques.

Les services fournis par l'installation sont adaptés pour s'adapter à des conceptions expérimentales dans une variété de domaines. Nous fournissons des conseils sur les protocoles actuels, les techniques d'analyse et la présentation des données. Cette ressource joue un rôle essentiel en aidant les chercheurs du campus KCC et TJU à effectuer divers projets de recherche directement liés à la compréhension de la biologie et du traitement du cancer. L'installation soutient des projets de chercheurs en biochimie, biologie du cancer, dermatologie, immunologie et microbiologie, médecine, neurologie, pathologie, pharmacologie et chirurgie, ainsi que de nombreux autres domaines scientifiques.


Formation et soutien à la cytométrie en flux

Trouvez des outils, des protocoles et des informations plus détaillées ou acquérez une compréhension de base des techniques pour vous aider à planifier et à exécuter vos expériences.

Cet outil en ligne vous guide tout au long de la conception de panneaux de cytométrie en flux, offrant une expérience simplifiée et personnalisable pour répondre à vos besoins de conception de panneaux de cytométrie en flux.


Nous avons fourni une collection de tutoriels et d'exemples afin d'aider les utilisateurs à utiliser plus facilement le package TASBE :

Si vous utilisez le package TASBE Flow Analytics, veuillez citer la publication suivante :

  • Jacob Beal, Cassandra Overney, Aaron Adler, Fusun Yaman, Lisa Tiberio et Meher Samineni. "TASBE Flow Analytics: A Package for Calibrated Flow Cytometry Analysis", ACS Synthetic Biology, 8 (7), pp 1524-1529, mai 2019

Les utilisateurs sont encouragés à signaler tout bogue à l'aide du Github Issue Tracker qui peut être trouvé ici.


ANALYSE CELLULAIRE/CYTOMÉTRIE EN FLUX : Cytométrie en flux : instruments, composants et impact

La cytométrie est l'analyse quantitative des cellules. Comme l'explique le célèbre expert en cytométrie Howard M. Shapiro dans son livre Cytométrie en flux pratique (que Beckman Coulter a mis gratuitement à disposition sur son site Web sous forme de fichier PDF consultable et imprimable de 733 pages), il s'agit d'un processus conçu pour mesurer les caractéristiques physiques et/ou chimiques de cellules individuelles. 2 Cela comprend l'identification, le comptage et la caractérisation par de multiples moyens, mais plus particulièrement grâce à l'utilisation de cytomètres en flux, qui mesurent les cellules en suspension dans un fluide lorsqu'elles zooment en file indienne devant une source d'éclairage.

Les tendances récentes de l'instrumentation commerciale de cytométrie en flux sont la réduction de la taille, la modularité et la facilité d'utilisation pour une accessibilité plus large, une disponibilité accrue des longueurs d'onde et des cibles et l'incorporation de capacités d'imagerie. Et d'autres avancées techniques se profilent à l'horizon (voir Fig. 1).

Les tendances de l'industrie sont à la consolidation, car les quelques entreprises qui ont dominé ce marché continuent de le faire par le biais d'acquisitions. Et selon les rapports « The 2012 Flow Cytometry Market » de Venture Planning Group (New York, NY), les progrès dans les diagnostics moléculaires, les anticorps monoclonaux, les lasers et les technologies de l'information, ainsi que la compréhension croissante des forces immunologiques régulant les maladies systémiques, auront un impact profond sur les marchés de la cytométrie en flux dans le monde entier.

Hellma (Plainview, NY), fabricant de micro-canaux d'écoulement pour les systèmes de cytométrie, appelle la cytométrie « l'une des technologies les plus puissantes et les plus importantes pour les sciences appliquées au 21e siècle ».

Preuve sur le marché

Traditionnellement, le marché de la cytométrie en flux a été dominé par quelques grands acteurs, dont Beckman Coulter (Brea, CA) et Becton, Dickinson and Co. (BD Franklin Lakes, NJ). Alors qu'un certain nombre de startups se sont lancées pour commercialiser des innovations technologiques, la domination de quelques-uns continue, pour la plupart, alors que les piliers achètent les startups. Il n'est donc pas surprenant que les tendances technologiques mentionnées ci-dessus soient évidentes dans les annonces d'acquisition. Par exemple, le communiqué d'avril 2012 de Beckman Coulter annonçant son acquisition du fabricant de systèmes automatisés et de réactifs Blue Ocean Biomedical (Pembroke Pines, FL) se concentre sur la facilité d'utilisation et une accessibilité plus large. Selon la déclaration de Beckman Coulter Life Sciences, cette décision fournit à la société "des analyseurs de faible complexité qui intègrent la préparation automatisée des échantillons" afin de répondre directement aux "tendances émergentes du marché de la cytométrie en flux". La technologie de Blue Ocean adopte une approche d'échantillonnage et de résultat, et la société prétend offrir la première véritable intégration de la préparation, de la manipulation, de l'analyse et de la gestion des données d'échantillons : " selon le PDG et co-fondateur de Blue Ocean, Mike Brochu.

À peine un an auparavant, en février 2011, le conglomorat de dispositifs médicaux et rival de Beckman Coulter, BD, avait acheté Accuri Cytometers, Inc. (Ann Arbor, MI) – qui aurait payé plus de 200 millions de dollars pour avoir l'opportunité d'étendre la présence de BD dans « le nouveau marché personnel abordable et abordable. l'espace du cytomètre en flux", et d'étendre l'utilisation de la technologie du flux à des disciplines telles que les études environnementales qui n'ont pas traditionnellement utilisé la cytométrie en flux.

Toujours en 2011 (août), EMD Millipore (Billerica, MA), la division des sciences de la vie de Merck KGaA en Allemagne, a acheté Amnis Corp. (Seattle, WA), fabricant de systèmes d'analyse cellulaire qui intègrent la cytométrie en flux et la microscopie et traitent une gamme des applications (le site Web d'Amnis a un bon aperçu : https://www.amnis.com/applications.html). Par exemple, le système à haute résolution d'Amnis, ImageStream, a trouvé une niche en oncologie pour la recherche sur la leucémie et le lymphome, grâce à sa capacité à effectuer plusieurs tâches à la fois : caractériser le rapport noyau:cytoplasme, produire un index mitotique précis, mesurer le signal transduction, suivre l'absorption des médicaments dans les cellules et mesurer l'apoptose. Le système de paillasse plus compact et abordable d'Amnis, FlowSight, reflète la vision de la taille et de l'abordabilité de l'acquisition en 2009 par EMD Millipore de la gamme de produits de cytométrie en flux Guava. Guava Technologies (Hayward, CA) avait développé une vision pour permettre la cytométrie en flux en dehors d'un laboratoire centralisé et a introduit des systèmes de paillasse utilisant la technologie microcapillaire, qui s'adapte à des volumes d'échantillons relativement plus petits (voir Fig. 2). De plus, la société a proposé des kits optimisés pour divers domaines de recherche (cellules souches, biologie du cancer, etc.) afin d'éviter aux scientifiques d'avoir à se procurer des réactifs et de développer leurs propres tests. -id="5ffcc153e949df4263e0dc68" data-embed-element="span" data-embed-size="640w" data-embed-alt="FIGURE 2. Lorsque des cellules marquées par fluorescence sont aspirées dans la cellule d'écoulement microcapillaire d'EMD Millipore&aposs goyave easyCyte 8HT, une diode laser rouge ou bleue excite l'échantillon. Chaque cellule émet ensuite des signaux qui sont détectés individuellement par des photomultiplicateurs et une photodiode. Les modules logiciels de goyave affichent immédiatement toutes les données et tous les résultats pertinents. data-embed-src="https://img.laserfocusworld.com/files/base/ebm/lfw/image/2015/12/1205bowgoode.png?auto=format&fit=max&w=1440" data-embed-caption=" FIGURE 2. Lorsque des cellules marquées par fluorescence sont aspirées dans la cellule d'écoulement microcapillaire de l'EMD Millipore&aposs goyave easyCyte 8HT, une diode laser rouge ou bleue excite l'échantillon. Chaque cellule émet ensuite des signaux qui sont détectés individuellement par des photomultiplicateurs et une photodiode. Les modules logiciels de goyave montrent toutes les données et tous les résultats pertinents immédiatement." ]>%

Le S1000Ex de Stratedigm (San Jose, CA), l'un des innovateurs qui n'a pas encore été acheté par un plus grand rival, illustre les tendances à la fois de la modularité et de plus de couleurs. Ce cytomètre en flux phare de Stratedigm est équipé de jusqu'à quatre lasers pour mesurer jusqu'à 18 paramètres. Il intègre l'architecture Smart Detect de la société, qui permet l'utilisation d'un seul tube photomultiplicateur (PMT)/module électronique intégré pour la détection de plusieurs fluorophores avec des longueurs d'onde d'émission similaires, mais des lasers d'excitation différents. Selon le PDG de Stratedigm, Shervin Javadi, cela permettra des analyseurs multicolores capables d'améliorer les performances à des prix inférieurs à ceux des produits conventionnels.

Les composants alimentent le progrès

Les fournisseurs des développeurs d'instruments s'efforcent de faciliter ces tendances technologiques. Venture Planning Group note que les systèmes laser compacts et faciles à utiliser étendront davantage les applications de la cytométrie en flux aux laboratoires cliniques de routine. L'iChrome de Toptica Photonics en est un exemple : le produit a été récompensé lors de sa sortie pour sa taille compacte et sa capacité à cibler plusieurs fluorophores spécifiques avec une sortie à bande étroite réglable automatiquement.

Dans son article de 2011, « Voir plus de détails avec la cytométrie », Monde de la biooptique le rédacteur en chef, Mike May, décrit l'approche à faible coût d'Omega Optical (Brattleboro, VT) pour permettre plus de longueurs d'onde : créer plusieurs réseaux le long d'une fibre optique, chacun pouvant être ajusté à une longueur d'onde centrale particulière. Il explique également le travail des chercheurs de l'Université de Californie à Los Angeles, qui ont réussi à augmenter le débit de cytométrie en flux avec un dispositif microfluidique à 256 canaux qui précipitait 28 000 000 cellules par seconde.

Au-delà des suspects habituels, c'est-à-dire les sources lumineuses, l'optique et les canaux d'écoulement, Venture Planning Group note que les influences sur la cytométrie en flux proviendront d'autres sources. Par exemple, les technologies de l'information réduiront éventuellement le coût de fabrication des instruments et la garantie de service, et permettront le développement de l'auto-dépannage, de l'auto-étalonnage et d'autres fonctionnalités avancées, telles que l'analyse automatisée des anomalies chromosomiques, du contenu en ADN et des sous-ensembles de lymphocytes. Cela rendra les procédures de routine qui sont encore aujourd'hui quelque peu exotiques, apportant les avantages de la cytométrie en flux à de plus en plus de consommateurs de soins de santé.

En attendant, les dernières nouvelles font état de progrès vers des systèmes portables pour les applications au point de service : des chercheurs de l'Université de Toronto (Toronto, ON, Canada) ont développé un cytomètre en flux spécialement conçu pour suivre la progression du VIH dans les pays en développement. Alors que les cytomètres compacts d'aujourd'hui ont souvent la taille d'une photocopieuse, cet appareil a la taille d'un pain et l'équipe prévoit de le réduire pour qu'il tienne dans la paume. Le coût du système est ciblé entre 5 000 $ et 10 000 $, avec des communications de données sans fil, un GPS et une caméra intégrés. L'objectif de l'équipe est d'avoir la version portable prête à être utilisée sur le terrain d'ici la mi-2012. Et LeukoDx (Jérusalem, Israël) a récemment annoncé un investissement pouvant atteindre 8 millions de dollars au cours des trois prochaines années pour permettre le développement ultérieur de sa propre plate-forme de cytométrie en flux, qui espère fournir des résultats de test en 10 minutes à partir d'une seule goutte de sang. L'appareil promet de permettre une prise de décision clinique rapide dans les unités de soins néonatals et intensifs, les services d'urgence et dans les endroits éloignés.


Nouvelles politiques de facilité FACS Sysbio et FICR en place en raison des restrictions de Covid-19***

L'accès aux installations sera dicté par les fermetures de bâtiments mandatées par l'université/l'hôpital pour la désinfection/le nettoyage quotidiens. Les EPI obligatoires, la distanciation sociale et les nouvelles politiques de désinfection seront en vigueur dans tout l'établissement. La formation aux instruments sera suspendue jusqu'à ce que les directives de distanciation sociale soient assouplies. AUCUNE UTILISATION D'INSTRUMENTS WALK-UP NE SERA AUTORISÉE. Toute utilisation doit être réservée dans PPMS/iLab avant l'heure du rendez-vous.

Les utilisateurs FICR existants réserveront les instruments via iLab comme d'habitude, mais toutes les réservations nécessiteront une approbation de base, une planification préalable est donc requise.


CYTOMETRIE EN FLUX ET TRI CELLULAIRE ACTIVE PAR FLUORESCENCE

HYUN S. LILLEHOJ , ALISON MARTIN , dans Antibody Techniques , 1994

INTRODUCTION

La cytométrie en flux (FCM) est une méthode qui mesure les caractéristiques chimiques et/ou physiques des particules lorsqu'elles traversent un dispositif de détection dans un flux de fluide. En immunofluorescence FCM, les propriétés des particules, généralement des cellules, sont évaluées par une molécule d'anticorps conjuguée à un colorant fluorochromatique. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est un processus dans lequel les cellules viables avec des propriétés prédéfinies sont séparées par FCM. Les particules biologiques qui ont été analysées par FCM et FACS comprennent des cellules procaryotes et eucaryotes, des cellules normales et tumorales, des virus, des champignons, des parasites, des organites cellulaires et des chromosomes. Les cytomètres en flux disponibles dans le commerce comprennent des capteurs de rayonnement optiques, électroniques et nucléaires sophistiqués ainsi que des ordinateurs pour l'analyse des données.

Avec l'avènement des anticorps monoclonaux contre les antigènes de surface cellulaire, le FCM est devenu un outil de recherche standard. L'analyse FCM est utile non seulement pour quantifier des sous-populations distinctes de cellules, mais également pour caractériser la réponse des anticorps de l'hôte aux bactéries, virus ou parasites. La plupart des applications immunologiques actuelles de la cytométrie en flux concernent l'identification et la quantification de populations cellulaires hétérogènes. Aussi, des analyses des caractéristiques physiques (taille et forme des cellules, granularité cytoplasmique, fluorescence des protéines, teneur en ADN) ainsi que des caractéristiques fonctionnelles (activité enzymatique, état redox, récepteurs intracellulaires, endocytose, récepteurs de surface, Ca 2+ membranaire et cytoplasmique, pH intracellulaire) sont possibles à l'aide du cytomètre en flux.

L'une des applications les plus populaires de la FCM est dans les sciences biologiques, en particulier l'immunologie, pour l'isolement et la caractérisation de sous-populations de cellules au sein de populations hétérogènes. Les applications expérimentales et cliniques les plus réussies de l'analyse par cytométrie en flux dans la pratique médicale se situent dans les domaines connexes de l'immunologie clinique et de l'hématologie pour une variété de tâches impliquant le comptage et la classification des cellules sanguines. Des applications sont également recherchées dans les domaines de la génétique, de la microbiologie, de l'oncologie, de la parasitologie, de la pharmacologie et de la toxicologie.

Divers types de cytomètres en flux commerciaux sont disponibles, mais la plupart de leurs fonctions de base sont similaires et peuvent être décrites comme suit. Des cellules individuelles en suspension liquide sont transportées à travers un dispositif de détection généralement éclairé par des faisceaux laser. Dans l'immunofluorescence FCM, les molécules de fluorochrome attachées à des molécules d'anticorps liées aux particules biologiques sont excitées à une longueur d'onde de lumière particulière lorsque les particules traversent un faisceau laser. Les fluorochromes se désintègrent ensuite et émettent une lumière d'une autre longueur d'onde qui est détectée par le dispositif optique. La diffusion de la lumière, collectée sur une ou plusieurs plages angulaires, est déterminée et la lumière est convertie en signaux électroniques par des tubes photomultiplicateurs (PMT). Des signaux électroniques dont les amplitudes sont proportionnelles à l'intensité de la lumière émise et diffusée sont amplifiés et évalués.


Voir la vidéo: The Principle of Flow Cytometry and FACS 1- Flow Cytometry (Décembre 2021).