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La première polymérase


Sachant que la protéine polymérase est nécessaire à la transcription des gènes, quelle polymérase est utilisée dans la transcription de la protéine polymérase elle-même ?


Chez les eucaryotes, son ARN polymérase II. Chez les bactéries, c'est l'ARN polymérase normale. Bien qu'il soit vrai que les polymérases sont maintenant nécessaires à la transcription de plus de polymérases, ce mécanisme n'a peut-être pas toujours été présent. Dans l'hypothèse du monde de l'ARN, l'ARN code pour des protéines et non pour l'ADN, donc avec l'émergence de l'ADN, des ARN polymérases peuvent également s'être formées. Pour produire des protéines à partir d'ARN, les organismes utilisent des complexes appelés ribosomes, qui sont des ribozymes (enzymes ARN), qui ont subi de nombreux cycles d'évolution à partir des ribosomes originaux, il n'y a donc pas eu de problème avec la production de protéines à partir d'ARN et tout au long de la évolution, les polymérases se sont ensuite développées, mais elles n'ont été nécessaires qu'avec l'essor de l'ADN.


Histoire de la réaction en chaîne par polymérase

Les histoire de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été diversement décrit comme un classique "Eureka!" moment, [1] ou comme exemple de travail d'équipe coopératif entre chercheurs disparates. [2] Voici une liste d'événements avant, pendant et après son développement :


Réplication, maintenance et organisation des nucléoïdes de l'ADNmt

Mara Doimo, . Sjoerd Wanrooij , dans Le génome mitochondrial humain , 2020

1.2.3 Allongement de la réplication de l'ADNmt

Après l'amorçage de la synthèse de l'ADNmt, l'élongation de l'amorce de réplication est catalysée par la POL codée par le noyau, qui a été la première polymérase isolée des mitochondries de cellules HeLa humaines [71] . POL γ a besoin de l'aide de l'hélicase mtDNA Twinkle et du mtSSB pour répliquer l'ADNmt dans les cellules humaines. Ensemble, POL , Twinkle et mtSSB constituent le réplisome minimal de l'ADNmt ( Fig. 1.3 ) et sont essentiels pour la reconstitution de la réplication mitochondriale in vitro [72] .

Graphique 1.3. Les protéines de fourche de réplication de l'ADN mitochondrial central (ADNmt).

L'hélicase TWINKLE (bleu) se déplace dans une direction de 5′ à 3′ pendant le déroulement de l'ADNdb. La protéine mtSSB (vert foncé) stabilise la conformation simple brin de l'ADN et stimule la synthèse de l'ADN par POLγ (rouge (A) et gris (B)). POLRMT (vert clair) synthétise l'amorce d'ARN (Ligne jaune) nécessaire pour la synthèse d'ADN de brin en retard.

1.2.3.1 L'ADN polymérase mitochondriale POL γ

La POL a d'abord été décrite comme une ADN polymérase ARN-dépendante [73] . L'holoenzyme est constituée d'une sous-unité catalytique POL A de 140 kDa et de deux sous-unités accessoires POL γB de 55 kDa [74–76] . La sous-unité catalytique possède des activités ADN polymérase et 3′–5′ exonucléase en plus de l'activité 5′-désoxyribose phosphate lyase [77,78] . En général, l'activité exonucléase intrinsèque de POL fonctionne comme un mécanisme de relecture lors de la réplication, ce qui garantit la fidélité de la polymérase grâce à une sélectivité élevée en nucléotides et une extension lente des mésappariements [79] . POL γ peut basculer entre les activités polymérase et exonucléase sans se dissocier de la matrice d'ADN car il peut transférer l'ADN naissant du site polymérase au site exonucléase et inversement via un mécanisme de transfert de brin intramoléculaire [80] . Avec un taux d'erreur inférieur à 1 × 10 -6 par nucléotide, POL γ est l'une des polymérases les plus précises [79] .

La sous-unité accessoire POL B est également connue sous le nom de facteur de processivité car elle augmente la processivité de POL A en augmentant son affinité de liaison à l'ADN. De plus, POL γB stimule à la fois les activités d'exonucléase et de polymérase, et il peut également améliorer la liaison et l'incorporation des nucléotides, augmentant ainsi la vitesse de polymérisation de l'holoenzyme [81,82] . En solution, les dimères de POL B forment un hétérotrimère avec la sous-unité catalytique POL γA par liaison étroite du dimère POL γB au monomère POL γA [75] . Chaque unité POL B dans l'holoenzyme a une fonction spécifique : le monomère proximal à POL γA dans l'holoenzyme augmente l'interaction avec l'ADN, tandis que le monomère distal POL γB est responsable de l'amélioration de la vitesse de réaction [83] . La modélisation de la liaison de POL à l'ADN suggère que POL A se lie à environ 10 pb d'ADN matrice et que l'interaction avec POL γB augmente l'empreinte de POL A sur l'ADN à 25 pb. Bien que POL γB ait une activité de liaison à l'ADNdb [84] , il n'interagit pas avec l'ADN amorce-matrice [85] . Bien qu'elle ne soit pas essentielle à la stimulation de POL A, l'activité de liaison à l'ADNdb de POL γB est requise pour la fonction du réplisome d'ADNmt sur une matrice d'ADNdb grâce à la coordination de POL γ et de Twinkle à la fourche de réplication [86] .

1.2.3.2 L'hélicase à ADN mitochondrial Twinkle

Twinkle (protéine de type gp4 T7 avec localisation nucléoïde intramitochondriale) est l'hélicase réplicative mitochondriale codée dans le noyau. Il partage une similarité structurelle avec la primase/hélicase du phage T7 et colocalise avec l'ADNmt dans des complexes nucléoprotéiques [87] . Twinkle est nécessaire pour le déroulement de la matrice d'ADN double brin avant POL qui ne peut utiliser que l'ADNsb comme matrice [72] . Il s'agit d'une hélicase à ADN dépendante de NTP qui déroule l'ADN dans une orientation 5'-3' et nécessite une structure en forme de fourche avec un site de chargement d'ADN 5' simple brin et une courte queue 3' pour initier le déroulement [88] . L'activité hélicase de Twinkle est considérablement stimulée par le mtSSB [88] , mais il ne peut dérouler de plus longs étirements d'ADNdb qu'en présence de POL γ [72] . Des rapports antérieurs suggéraient que Twinkle est hexamérique [87,89] , tandis qu'une analyse plus récente par microscopie électronique a révélé des preuves à la fois de formes hexamériques et heptamériques [90,91] .

1.2.3.3 La protéine mitochondriale de liaison à l'ADN simple brin

La mtSSB humaine est une protéine de 15 kDa qui partage une similitude de séquence avec Escherichia coli SSB [92] , et forme un tétramère qui lie 59 nt d'ADN simple brin [93] . L'ADN simple brin s'enroule une fois autour du tétramère mtSSB [94,95] . Le MtSSB stimule l'activité polymérase POL ainsi que l'activité hélicase Twinkle [88,96,97] . Il a été suggéré que l'effet stimulateur sur l'activité de la polymérase POL se produisait sans aucune interaction directe entre les protéines, grâce à la capacité du mtSSB à organiser la matrice d'ADNsb et à éliminer toute structure d'ADN secondaire [98] . Des études sur Drosophile mtSSB a montré que mtSSB augmente Drosophile POL γ principalement en augmentant la reconnaissance et la liaison des amorces et, par conséquent, augmente le taux d'initiation de la synthèse d'ADN [99, 100] . En plus de stimuler l'activité polymérase POL , Drosophile mtSSB peut même stimuler l'activité exonucléase de POL γ [101] .

1.2.3.4 Le réplisome de l'ADN mitochondrial

Dans les tests biochimiques, POL seul est incapable d'utiliser l'ADNdb comme matrice, mais l'ajout de Twinkle améliore considérablement la polymérisation par POL sur une matrice de mini-cercle amorcée et permet la synthèse de vastes étendues d'ADN dans un mode de réplication en cercle roulant [ 72] . L'interaction Twinkle-POL γ permet également à Twinkle de dérouler de plus longues étendues d'ADNdb bien que les protéines ne semblent pas former un complexe stable [72] . L'ajout de mtSSB améliore encore la synthèse d'ADN permettant la formation de produits d'ADN allant jusqu'à la longueur du génome [72] . En conclusion, l'ADNmt polymérase POL γ avec Twinkle et mtSSB constituent la machinerie de base nécessaire pour répliquer l'ADNmt dans les cellules humaines. L'importance de ces protéines pour le maintien de l'ADNmt in vivo est soulignée par le fait que des défauts dans ces composants centraux du réplisome de l'ADNmt conduisent à une instabilité de l'ADNmt et à une maladie mitochondriale [87, 102-106] .


Processus de transcription

La transcription commence par la liaison de l'enzyme RNAP à une partie spécifique de l'ADN, également connue sous le nom de région promotrice. Cette liaison nécessite la présence de quelques autres protéines – le facteur sigma chez les procaryotes et divers facteurs de transcription chez les eucaryotes. Un ensemble de protéines appelées facteurs de transcription généraux est nécessaire pour toute activité transcriptionnelle eucaryote et comprend les facteurs d'initiation de la transcription II A, II B, II D, II E, II F et II H. Ceux-ci sont complétés par des molécules de signalisation spécifiques qui modulent l'expression des gènes par des segments d'ADN non codants situés en amont. Souvent, l'initiation est interrompue plusieurs fois avant qu'un tronçon de dix nucléotides ne soit polymérisé. Après cela, la polymérase dépasse le promoteur et perd la plupart des facteurs d'initiation.

Ceci est suivi par le déroulement de l'ADN double brin, également connu sous le nom de "fusion" pour former une sorte de bulle où se produit une transcription active. Cette "bulle" semble se déplacer le long du brin d'ADN à mesure que le polymère d'ARN s'allonge. Une fois la transcription terminée, le processus est terminé et le brin d'ARN est traité. Les RNAP procaryotes et les ARN polymérases I et II eucaryotes nécessitent des protéines de terminaison de transcription supplémentaires. RNAP III termine la transcription lorsqu'il y a un tronçon de bases de thymine sur le brin d'ADN non-matrice.


7.1 : Présentation de la réaction en chaîne par polymérase

  • Contribution de Clare M. O&rsquoConnor
  • Professeur agrégé émérite (biologie) au Boston College

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) a révolutionné la biologie moléculaire. Avec la PCR, les chercheurs disposaient d'un outil pour amplifier des séquences d'ADN d'intérêt à partir de quantités extrêmement faibles
d'une matrice d'ADN. En effet, des milliards de copies peuvent être synthétisées à partir d'une seule molécule d'ADN dans une réaction PCR typique. Le développement de la PCR est né de la recherche sur les ADN polymérases et de la découverte d'ADN polymérases thermostables capables de résister à des traitements thermiques prolongés qui dénaturent la plupart des protéines (Sakai et al., 1988). Aujourd'hui, la PCR est une technique standard largement utilisée pour analyser des molécules d'ADN et construire de nouvelles molécules recombinantes.

Les ADN polymérases thermostables sont au cœur de la PCR. La première description de la PCR utilisée
une ADN polymérase de E. coli, qui se dénaturait et devait être remplacé après chaque tour de
Synthèse de l'ADN (Sakai et al., 1985). La procédure a été grandement améliorée en remplaçant le E.
coli
polymérase avec une ADN polymérase de Thermus aquatique, une bactérie qui se développe
dans les sources thermales du parc national de Yellowstone. Les T. aquaticus ADN polymérase, ou Taqpolymérase, fonctionne mieux à des températures de 70-75 ̊C et peut résister à une incubation prolongée (mais pas indéfinie) à des températures supérieures à 90 ̊C sans dénaturation. En quelques années, leTaq polymérase avait été clonée et surexprimée dans E. coli, augmentant considérablement sa disponibilité. Aujourd'hui, la sélection de polymérases disponibles pour la PCR a considérablement augmenté, car de nouvelles ADN polymérases ont été identifiées dans d'autres organismes thermophiles et des modifications génétiques ont été introduites dans Taq polymérase pour améliorer ses propriétés.

La PCR implique plusieurs cycles de synthèse d'ADN à partir des deux extrémités du segment d'ADN en cours d'amplification. Rappelez-vous ce qui se passe lors de la synthèse de l'ADN : une amorce oligonucléotidique simple brin se lie à une séquence complémentaire de l'ADN. Cette région double brin fournit
une ancre pour l'ADN polymérase, qui prolonge l'amorce, TOUJOURSvoyager dans le sens 5&rsquo à 3&rsquo. Les enquêteurs contrôlent les sites de départ pour la réplication de l'ADN en fournissant des oligonucléotides pour servir d'amorces pour la réaction (illustré ci-dessous pour Votre gène préféré Yfg). Pour concevoir des amorces PCR, les chercheurs ont besoin d'informations de séquence précises pour les sites de liaison des amorces dans l'ADN cible. (Remarque : les informations sur la séquence ne sont pas nécessaires pour la séquence entière qui sera amplifiée. La PCR est souvent utilisée pour identifier les séquences qui se produisent entre deux sites de liaison d'amorce connus.) Deux amorces sont nécessaires pour la PCR. Une amorce se lie à chaque brin de l'hélice d'ADN.

La PCR commence par une période de dénaturation de plusieurs minutes, au cours de laquelle le mélange réactionnel est incubé à une température suffisamment élevée pour rompre les liaisons hydrogène qui maintiennent ensemble les deux brins de l'hélice d'ADN. Une dénaturation efficace est essentielle, car l'ADN polymérase nécessite un ADN simple brin comme matrice. Le segment de dénaturation initial est plus long que les étapes de dénaturation suivantes, car les matrices biologiques pour la PCR, telles que l'ADN génomique, sont souvent de longues molécules complexes maintenues ensemble par de nombreuses liaisons hydrogène. Dans les cycles de PCR suivants, les produits (plus courts) des cycles précédents deviennent les modèles prédominants.

Après la dénaturation initiale, la PCR implique une série de 30 à 35 cycles avec trois segments, effectués à différentes températures. Les réactions de PCR sont incubées dans des thermocycleurs qui ajustent rapidement la température d'un bloc de réaction métallique. Un cycle typique comprend :

  • une étape de dénaturation - généralement 94 ̊C
  • une étape de recuit d'amorce - généralement 55 ̊C
  • une étape d'extension - généralement 72 ̊C

Les réactions PCR comprennent plusieurs cycles de dénaturation, d'hybridation et d'extension.

la séquence d'amorce. Les ADN polymérases deviennent plus actives à la température d'extension, qui est plus proche de leur température optimale. Les chercheurs adaptent les températures et le calendrier des étapes ci-dessus pour s'adapter à différentes amorces, matrices et ADN polymérases.

Les produits PCR de la taille prévue s'accumulent de façon exponentielle

La PCR est en effet une réaction en chaîne, puisque la séquence d'ADN d'intérêt double à peu près
à chaque cycle. En dix cycles, une séquence sera amplifiée

1000 fois (2 10 = 1024). En vingt cycles, une séquence sera amplifiée

million de fois. En trente cycles, une séquence peut être théoriquement amplifiée

milliard de fois. Les réactions PCR en laboratoire impliquent généralement 30 à 35 cycles de dénaturation, d'hybridation et d'extension. Pour comprendre la PCR, il est important de se concentrer sur les premiers cycles. Les produits PCR de la taille prévue apparaissent d'abord dans le deuxième cycle. L'amplification exponentielle du produit de PCR prévu commence au troisième cycle.

Au cours du premier cycle, les ADN polymérases thermostables synthétisent l'ADN, prolongeant les extrémités 3&rsquo des amorces. Les ADN polymérases sont des enzymes processives qui continueront à synthétiser l'ADN jusqu'à ce qu'elles tombent littéralement de l'ADN. Par conséquent, les molécules d'ADN complémentaires synthétisées dans le premier cycle ont une grande variété de longueurs. Chacun des produits, cependant, a une position de départ définie, puisqu'il commence par la séquence d'amorce. Ces séquences " ancrées " deviendront des matrices pour la synthèse d'ADN au cours du cycle suivant, lorsque les produits PCR de la longueur voulue apparaîtront pour la première fois. Le modèle de départ pour la PCR continuera à être copié dans chaque cycle de PCR suivant, produisant deux nouveaux produits &ldquoanchored&rdquo à chaque cycle. Étant donné que les longueurs des produits « ancrés » sont assez variables, cependant, ils ne seront pas détectables dans les produits finaux de la réaction PCR.

Des brins d'ADN de la longueur voulue apparaissent pour la première fois au cours du deuxième cycle. La réplication à partir des fragments &ldquoanchored&rdquo génère des produits PCR de la longueur souhaitée. Le nombre de ces fragments de longueur définie doublera à chaque nouveau cycle et deviendra rapidement le produit prédominant dans la réaction.

La plupart des protocoles PCR impliquent 30-35 cycles d'amplification. Au cours des derniers cycles, les produits PCR souhaités ne s'accumulent plus de manière exponentielle pour plusieurs raisons. Comme dans toute réaction enzymatique, les substrats de PCR se sont épuisés et les cycles répétés d'incubation à 94 °C ont commencé à se dénaturer Taq polymérase.

Le recuit des amorces est essentiel à la spécificité de la PCR

Une bonne conception d'amorce est essentielle au succès de la PCR. La PCR fonctionne mieux lorsque les amorces sont hautement spécifiques de la séquence cible dans l'ADN matrice. Une erreur d'amorçage se produit lorsque les amorces se lient à des séquences qui ne sont que partiellement complémentaires, ce qui amène l'ADN polymérase à copier les mauvaises séquences d'ADN. Heureusement, les chercheurs sont généralement capables d'ajuster les paramètres expérimentaux pour maximiser la probabilité que les amorces s'hybrident avec les bonnes cibles.

Les amorces de PCR sont typiquement des oligonucléotides synthétiques d'une longueur comprise entre 18 et 25 bases. Lors de la conception d'une amorce, les chercheurs considèrent son Tm, la température à laquelle la moitié des hybrides formés entre l'amorce et la matrice fondra. En général, la stabilité thermique d'un hybride augmente avec la longueur de l'amorce et sa teneur en GC. (Rappelez-vous qu'une paire GC-base est stabilisée par trois liaisons H, contre deux pour une paire AT.) La formule suivante fournit une estimation approximative de la Tm d'hybrides d'oligonucléotides. Dans cette formule, m fait référence au nombre de nucléotides, et la concentration de cations monovalents est exprimée en unités molaires (M).


Applications de la PCR

Projet sur la santé humaine et le génome humain

La PCR est un outil essentiel qui peut être utilisé pour améliorer la santé et la vie humaines. En science médicale, la PCR est utilisée pour la détection d'organismes infectieux et la détection de mutations dans divers gènes. Dans le cas de la détection de maladies comme le SIDA, la PCR peut être utilisée pour étudier directement l'ADN du virus et elle est plus spécifique que la détection standardisée effectuée par ELISA. De plus, la PCR a un potentiel élevé dans l'application de la détection de maladies comme la maladie de Lyme, où elle peut identifier directement la présence d'ADN bactérien dans le traitement des articulations. La PCR est également utilisée pour la détection de Helicobacterium pylori et les maladies à virus sexuellement transmissibles. Le projet du génome humain fait référence à l'étude de tous les gènes humains. La PCR joue un rôle important dans ce projet car elle aide à identifier des gènes spécifiques ainsi que des mutations et des taux de mutations dans ces gènes.

Empreintes génétiques

Cette technique est utilisée en médecine légale pour comparer l'ADN d'une personne avec un échantillon donné, tel qu'un échantillon de sang trouvé sur une scène de crime. L'échantillon peut contenir une très petite quantité d'ADN. L'application de la PCR vient à cette partie pour amplifier la petite quantité d'ADN à partir d'échantillons comme le sang, le sperme, la salive, les cheveux, etc. Les fragments d'ADN amplifiés sont ensuite analysés par électrophorèse sur gel.

Détection des maladies héréditaires

Il est difficile de comprendre les maladies héréditaires en raison de son lien direct avec le génome. Ce processus complexe et difficile peut être facilement analysé par PCR. La PCR peut amplifier l'ADN et en utilisant un marqueur spécifique, le gène particulier qui est responsable de la maladie peut être détecté. En dehors de cela, le taux de mutation dans ce gène spécifique peut également être analysé en utilisant la PCR.

Le clonage de gènes a différentes applications à l'échelle industrielle ainsi qu'à l'échelle du laboratoire et la PCR peut être utilisée pour le clonage de gènes spécifiques. Lorsqu'un gène d'intérêt particulier doit être cloné, la PCR est utilisée pour amplifier le gène. Il est ensuite inséré dans un vecteur et le vecteur est ensuite encore transporté le gène à l'intérieur d'une cellule. Par conséquent, la PCR est nécessaire pour terminer les études de clonage de gènes.

Analyse de l'ADN ancien

La PCR peut être utilisée dans l'analyse de l'ADN ancien. Par exemple, l'ADN isolé des momies égyptiennes peut être amplifié par PCR pour d'autres études et l'identification de la personne. Le gène peut être utilisé pour comparer avec le gène de l'époque récente et l'analyse évolutive peut également être effectuée.


Structure de l'ADN polymérase ζ : capturer le conducteur de l'évasion

Au cours de la synthèse de la translésion, l'ADN polymérase eucaryote effectue une extension à partir d'un large éventail de lésions de l'ADN. L'élucidation de la structure cryo-EM de la polymérase révèle comment l'enzyme catalyse la synthèse des brins d'ADN au-delà de la lésion.

La synthèse par translésion (TLS) est une voie principalement sujette aux erreurs utilisée par les cellules pour contourner les dommages à l'ADN qui bloquent la réplication normale de l'ADN 1,2,3,4,5,6. Au cours de la TLS, l'ADN polymérase réplicative bloquée est remplacée par une ou plusieurs polymérases TLS spécialisées, qui effectuent la réplication à travers la lésion de l'ADN. Dans de nombreux cas, TLS nécessite deux polymérases spécialisées : un « insert » pour incorporer un nucléotide en face de la lésion d'ADN, et un « extenseur » pour catalyser une synthèse supplémentaire des brins d'ADN. La polymérase « extenseur » principale chez les eucaryotes est l'ADN polymérase (Pol) 7 . Alors que cette enzyme a été purifiée pour la première fois il y a près de vingt-cinq ans 8 , les études structurelles ont échoué, en partie à cause de l'incapacité d'obtenir des quantités suffisantes de la protéine pour la cristallographie aux rayons X. Maintenant, Malik et al. 9 rapportent une structure cryo-EM de Pol ζ de Saccharomyces cerevisiae et décrire les caractéristiques structurelles qui lui permettent de catalyser l'étape d'extension de TLS.


Fonction ARN polymérase

L'ARN polymérase est l'enzyme la plus importante dans le processus de transcription. N'oubliez pas que la transcription est le processus de copie de l'ADN double brin en un seul brin d'ARN. Ils peuvent sembler légèrement différents, mais ils sont tous deux écrits dans la langue de nucléotides. Pour que l'ARN polymérase puisse commencer son travail, elle doit d'abord trouver un région du promoteur. Cette région peut être ciblée par facteurs de transcription chez les eucaryotes. Ces protéines se lient au site, créant un arrangement approprié pour que l'ARN polymérase se lie et démarre la transcription. Chez les bactéries, il n'y a qu'un seul promoteur, le facteur d'initiation sigma. Ce processus peut être observé avec la molécule de polymérisation d'ARN généralisée illustrée ci-dessous, transcrivant l'ADN. Les facteurs de transcription ne sont pas représentés.

Lorsque l'ARN polymérase se lie à l'ADN, elle change conformation, ou forme. Cela démarre la réaction en chaîne enzymatique qui fait croître une nouvelle chaîne de nucléotides en une molécule d'ARN basée sur la matrice présentée. Une fois que l'ARN polymérase a créé cette nouvelle molécule, l'ARN doit être traité et libéré de la noyau. Maintenant appelé ARN messager, ou ARNm, il rencontrera un ribosome qui possède les mécanismes appropriés pour le processus de Traduction.

Tout comme la traduction de l'anglais vers l'espagnol, le ribosome doit « lire » la séquence de l'ARN et convertir le message dans la langue de acides aminés. Ces petites molécules forment de longues chaînes, qui se replient en formes complexes pour devenir des protéines biochimiquement actives. Ces protéines, à leur tour, créent et maintiennent des parties de l'ADN, ainsi que répliquent l'ADN. Des parties de l'ADN stockent l'information génétique de la protéine ARN polymérase elle-même, qui est d'abord décodée par une molécule d'ARN polymérase. Cette situation est vraiment la base de la poule et de l'œuf si vous y réfléchissez.


Étape d'achèvement de réplication : ADN polymérase I

Une fois que l'ADN polymérase III associe la majorité des nucléotides D complémentaires sur le brin principal et le brin retardé en développement, les amorces d'ARN sont toujours présentes. Une autre enzyme ADN polymérase, ADN polymérase I lit à la fois les brins principaux et retardés de 5 'à 3' des brins parentaux en remplaçant les nucléotides R par des nucléotides D. Alors que le brin principal est synthétisé en continu, il existe toujours une amorce d'ARN à l'origine de la bulle de réplication. Elle est également remplacée par l'ADN polymérase I.

Étape d'achèvement de réplication : ligase

Après que l'ADN polymérase I remplace les amorces d'ARN, il n'y a pas de liaison phosphodiester entre les fragments d'Okazaki. Une autre enzyme, ligature, descend le long du brin en retard créant une liaison phosphodiester reliant les fragments d'Okazaki.

La ligase lie les fragments d'Okazaki entre eux.

Étape d'achèvement de réplication : télomérase

Chez les procaryotes, une fois que la ligase a fini de connecter les fragments d'Okazaki, l'ADN a été répliqué avec succès. Cela est dû à la forme circulaire de leur ADN. Cependant, l'ADN eucaryote est linéaire. Dans le brin en retard, cela pose un problème. À la fin des chromosomes, connue sous le nom de télomères, il n'y a nulle part où l'ADN polymérase III se connecte en raison de l'absence d'une amorce d'ARN. Si ces D-nucléotides au niveau des télomères n'étaient pas synthétisés, les brins d'ADN finiraient par devenir plus courts à chaque réplication. On pense que le vieillissement est le produit d'un dysfonctionnement de la télomérase.

La télomérase étend les extrémités (télomères) du brin retardé.

La télomérase est une enzyme qui se fixe à l'extrémité non synthétisée du brin retardé et catalyse la synthèse d'ADN à partir de sa propre matrice d'ARN, ce qui s'apparente à l'ingénierie inverse. À une extrémité de la télomérase, quelques R-nucléotides se combinent avec l'extrémité du brin non répliqué. La télomérase ajoute ensuite des D-nucléotides à l'extrémité du brin retardé.

Les extrémités opposées de la télomérase sont identiques. Le côté opposé de la télomérase (si vous lisez de gauche à droite) se termine par les mêmes R-nucléotides (AUU). La télomérase utilise ce phénomène pour se détacher une fois que le brin retardé a été étendu, puis se rattacher à l'extrémité du brin retardé étendu. La télomérase rattachée réplique une autre copie exacte sur le brin en retard. Ce processus se produit plusieurs fois et la télomérase est finalement supprimée.

Une fois que la télomérase allonge le brin retardé parental, la primase s'attache en synthétisant une amorce d'ARN, ce qui permet à l'ADN polymérase III de répliquer les nucléotides D restants sur le brin non répliqué. La ligase fusionne le dernier segment restant en créant la liaison phosphodiester finale. Il en résulte deux copies exactes de l'ADN d'origine avec des télomères légèrement plus longs.

Réparer les erreurs

L'ADN polymérase III est extrêmement précise. Une autre ADN polymérase agit comme un correcteur, ADN polymérase II. Une fois la réplication terminée, l'ADN polymérase II parcourt la totalité du lien des brins d'ADN parentaux à la recherche de paires de bases incompatibles. Une fois qu'elle détecte une incompatibilité, l'ADN polymérase II supprime le D-nucléotide du nouveau brin d'ADN et le remplace par le D-nucléotide complémentaire du brin parental.

Cependant, même cette étape de relecture n'est pas tout à fait précise, une paire de bases non appariée manquante se produit environ une fois tous les milliards de fois. Ces erreurs conduisent à des mutations au niveau des nucléotides. De telles mutations sont le seul moyen par lequel de nouveaux allèles sont générés et sont généralement neutres ou délétères par rapport à la fitness. Parfois, ces mutations créeront des phénotypes bénéfiques permettant à ces organismes une plus grande probabilité de survie et de reproduction. De telles mutations ont tendance à s'amplifier dans les générations futures en raison de la sélection naturelle.


Réaction en chaîne par polymérase

Nos rédacteurs examineront ce que vous avez soumis et détermineront s'il faut réviser l'article.

Réaction en chaîne par polymérase ( PCR), une technique utilisée pour faire de nombreuses copies d'un segment spécifique d'ADN rapidement et avec précision. La réaction en chaîne par polymérase permet aux chercheurs d'obtenir les grandes quantités d'ADN nécessaires à diverses expériences et procédures en biologie moléculaire, analyse médico-légale, biologie évolutive et diagnostic médical.

La PCR a été développée en 1983 par Kary B. Mullis, un biochimiste américain qui a remporté le prix Nobel de chimie en 1993 pour son invention. Avant le développement de la PCR, les méthodes utilisées pour amplifier ou générer des copies de fragments d'ADN recombinant prenaient beaucoup de temps et de travail. En revanche, une machine conçue pour effectuer des réactions PCR peut effectuer de nombreux cycles de réplication, produisant des milliards de copies d'un fragment d'ADN, en quelques heures seulement.

La technique PCR est basée sur les processus naturels qu'une cellule utilise pour répliquer un nouveau brin d'ADN. Seuls quelques ingrédients biologiques sont nécessaires pour la PCR. Le composant intégral est l'ADN matrice, c'est-à-dire l'ADN qui contient la région à copier, comme un gène. Une seule molécule d'ADN peut servir de matrice. La seule information nécessaire à la réplication de ce fragment est la séquence de deux courtes régions de nucléotides (les sous-unités de l'ADN) à chaque extrémité de la région d'intérêt. Ces deux courtes séquences matrices doivent être connues pour que deux amorces - de courtes séquences de nucléotides qui correspondent aux séquences matrices - puissent être synthétisées. Les amorces se lient, ou s'hybrident, à la matrice au niveau de leurs sites complémentaires et servent de point de départ pour la copie. La synthèse d'ADN au niveau d'une amorce est dirigée vers l'autre, entraînant la réplication de la séquence intermédiaire souhaitée. Des nucléotides libres sont également nécessaires pour construire les nouveaux brins d'ADN et une ADN polymérase, une enzyme qui effectue la construction en ajoutant séquentiellement des nucléotides libres selon les instructions de la matrice.

La PCR est un processus en trois étapes qui est effectué en cycles répétés. L'étape initiale est la dénaturation, ou séparation, des deux brins de la molécule d'ADN. Ceci est accompli en chauffant le matériau de départ à des températures d'environ 95 °C (203 °F). Chaque brin est un modèle sur lequel un nouveau brin est construit. Dans la deuxième étape, la température est réduite à environ 55 °C (131 °F) afin que les amorces puissent s'hybrider à la matrice. Dans la troisième étape, la température est élevée à environ 72 °C (162 °F) et l'ADN polymérase commence à ajouter des nucléotides aux extrémités des amorces hybridées. A la fin du cycle, qui dure environ cinq minutes, la température est augmentée et le processus recommence. Le nombre de copies double après chaque cycle. Habituellement, 25 à 30 cycles produisent une quantité suffisante d'ADN.

Dans la procédure PCR d'origine, un problème était que l'ADN polymérase devait être reconstituée après chaque cycle car elle n'est pas stable aux températures élevées nécessaires à la dénaturation. Ce problème a été résolu en 1987 avec la découverte d'une ADN polymérase thermostable appelée Taq, une enzyme isolée de la bactérie thermophile Thermus aquatique, qui habite les sources chaudes. Taq polymérase a également conduit à l'invention de la machine PCR.

Parce que l'ADN provenant d'un large éventail de sources peut être amplifié, la technique a été appliquée à de nombreux domaines. La PCR est utilisée pour diagnostiquer une maladie génétique et pour détecter de faibles niveaux d'infection virale. En médecine légale, il est utilisé pour analyser d'infimes traces de sang et d'autres tissus afin d'identifier le donneur par son « empreinte digitale » génétique. La technique a également été utilisée pour amplifier des fragments d'ADN trouvés dans des tissus préservés, comme ceux d'un mammouth laineux congelé vieux de 40 000 ans ou d'un humain de 7 500 ans trouvé dans une tourbière.

Cet article a été récemment révisé et mis à jour par Erik Gregersen, rédacteur en chef.


Quelle est la fonction de l'ADN polymérase ?

La réplication de l'ADN nécessite le déroulement de la structure complémentaire à deux brins de l'ADN. Ce processus est médié par la rupture des liaisons hydrogène qui maintiennent les bases ensemble, le résultat est la formation de deux brins simples.

L'apparence en forme de Y qui en résulte dans cette région de l'ADN est appelée fourche de réplication. L'initiation de la réplication se produit sur des sites spécifiques appelés origine de réplication (ori). Suite à l'établissement de la fourche de réplication est le réplisome, plusieurs facteurs qui permettent à la réplication d'avoir lieu.

Les ADN polymérases sont l'un de ces facteurs cruciaux. Ce sont des enzymes multi-sous-unités qui participent au processus de réplication de l'ADN dans la cellule. Ils catalysent l'ajout de nucléotides sur des brins d'ADN existants. Il existe de nombreuses familles d'ADN polymérase qui jouent un rôle dans la réplication de l'ADN, il y en a au moins 15 chez l'homme et sont nécessaires à différents moments du processus.

Fonction polymérase lors de la réplication de l'ADN

Les enzymes ADN polymérase fonctionnent généralement par paires, chaque enzyme réplique l'un des deux brins qui composent la double hélice d'ADN. Ceux-ci s'appellent le brin principal et le brin retardé et sont nommés en fonction de la vitesse relative à laquelle ils sont répliqués.

Les brins répliqués sont synthétisés en utilisant les brins avant et arrière comme modèles. Par conséquent, les deux nouvelles molécules d'ADN double brin produites consistent en un brin de l'hélice d'origine (soit le brin principal, soit le brin retardé) et un nouveau brin. Ce processus est appelé réplication semi-conservative et est essentiel car il permet la transmission de l'information génétique de génération en génération.

Les activités des deux ADN polymérases sont coordonnées par deux structures appelées chargeur de pince coulissante et pince coulissante. The sliding clamp loader contacts single-stranded binding proteins that coat the separated helix as well as the sliding clamp.

Two sliding clamps encircle the two strands of DNA, and together with accessory proteins called the clamp loader complex, provide a stable binding site for the two DNA polymerases. The unwound single-stranded DNA templates move toward the complex the behavior of the clamp loader on the leading and lagging strand differ because of a property called directionality.

This is determined by the orientation of the phosphate bond and characterized by the conventions 5’ to 3’ and 3’ to 5’. Each of the two strands of the helix necessarily possess opposite directionality this is essential for base pairing to occur. Their pairing is also referred to as antiparallel.

DNA polymerase synthesizes only in a 5′ to 3′ direction. Consequently, the strand with the complementary 3’ to 5’ directionality, the leading strand, is synthesized as one continuous piece. Conversely, the strand with 5’ to 3’ directionality is synthesized as a series of small fragments called Okazaki fragments.

The lagging strand orientation of 5’ to 3’ is incompatible with DNA polymerase to accommodate this requirement, the clamp loader must continually release and reattach at a new location. This requires the lagging strand to bubble out from the replisome.

Polymerases for DNA repair

Several polymerases exist in both prokaryotes and eukaryotes. They provide polymerase activity under two broad categories normal replication and repair. Under conditions of normal replication, DNA polymerase corrects errors by 3′ → 5′ exonuclease activity.

Outside of normal replicative events, DNA repair is an ongoing process that is necessary to maintain the integrity of the genome. Both endogenous and exogenous insults result in damaged DNA for example, single-strand and double-strand breaks, strand cross-linking, base loss, and base modification.

Multiple pathways exist to repair these DNA damage events in a selective manner. These include mismatch repair, nucleotide excision repair, base excision repair, double-strand break repair, and inter-strand cross-link repair. The biochemical difference that exists between these polymerases allows them to fulfill distinct roles under these specific conditions of repair.


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