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Puis-je simuler une séquence précédente et suivante de mes fichiers fasta ?


J'ai des séquences fasta d'une protéine virale qui avait subi une mutation en 2008 et ce mutant avait une aptitude accrue par rapport à la souche sauvage (selon la littérature).Je veux simuler si mes séquences ont été soumises en 2009 (j'ai des séquences de 2009 et 2010) ou avant pour effectuer une mutation et simuler les prochaines séquences pour vérifier si la population de mutants devient vraiment majoritaire. Comment puis-je faire cela ? Mon virus est un ARN -ss. Un outil à utiliser que je peux représenter graphiquement? Ou en simplifiant… Je veux simuler les séquences passées et futures de mon jeu de données.


D'après la description du modèle qui vous intéresse, vous n'avez probablement pas besoin de simulations numériques. Une simple attente analytique pourrait suffire. Mais de toute façon, si vous souhaitez effectuer des simulations numériques (peut-être que vous ne voulez pas supposer la panmixie), alors vous avez un certain nombre de choix.

Le simulateur dont vous aurez besoin doit pouvoir implémenter la sélection. Il doit donc s'agir d'un simulateur d'anticipation et non d'un simulateur coalescent. J'ai personnellement fait l'expérience de 4 simulateurs d'anticipation différents ; SimBit, Maigrir, SFS_code et Némo.

Si je ne me trompe pas, SFS_code ne pourra pas simuler les individus haploïdes et sera probablement plus lent que SimBit et SLiM. Dans SimBit, SLiM et Nemo, vous ne pouvez pas non plus faire d'haploïdes, cependant, vous pouvez définir le taux de clonage à 100%, ce qui sera essentiellement le même que la simulation d'haploïdes.

D'après mon expérience et de manière générale, SLiM et SimBit sont plus rapides que Nemo. Parce que votre taux de mutation est élevé et parce que votre taux de recombinaison sera très faible (il sera probablement nul), SimBit devrait être très très rapide et SLiM relativement lent. De plus, SimBit offrira des sorties beaucoup plus agréables pour la statistique qui vous intéresse que SLiM.

Veuillez noter que je suis l'auteur de SimBit et que je pourrais donc être en conflit d'intérêts ici. Voici le lien vers SimBit.


Puis-je simuler une séquence précédente et suivante de mes fichiers fasta ? - La biologie

NOTE -- CECI EST OBLIGATOIRE ET EN COURS DE RÉÉCRIT EN C++

La version python est assez boguée et instable, j'ai donc entrepris une reconstruction complète. Vous pouvez trouver la nouvelle version ici.

(Seule la dernière version a des binaires ici pour le moment)

Après le téléchargement, vous trouverez quelques conseils d'utilisation situés plus bas

Remarque rapide - ce programme est toujours activement développé. Bien que les progrès aient ralenti avec la réouverture du monde, je vais continuer à essayer de l'améliorer. Ce n'est pas tout à fait complet mais cela fonctionne assez bien pour ce que j'avais l'intention de faire à l'origine, je dois admettre que ce n'est pas très stable cependant. Si vous l'aimez mais que quelque chose manque ou est cassé, veuillez laisser une note dans l'onglet Problèmes.

Linnaeo est un programme python que j'ai fait principalement comme un exercice pour apprendre à coder une interface graphique. mais aussi pour résoudre un problème de base que j'avais : rien là-bas n'est très bon pour faire, stocker et visualiser les alignements de protéines.

Oui, il existe dans le monde d'innombrables séquences d'acides aminés, et leurs séquences (et leurs petites différences) sont liées aux fonctions des protéines. mais c'est souvent difficile à voir. Ce programme est destiné à y contribuer en répondant à quelques critères de base :

  1. Cela devrait être rapide.
  2. Il devrait stocker n'importe quelle séquence que vous voulez. (mais pour le moment, juste des séquences de protéines FASTA, désolé)
  3. Il doit être facile de créer, stocker et exporter des alignements.

C'est une idée de base. Très probablement, ces critères changeront.

Voici une capture d'écran au 14 juin 2020 :

Voici une autre capture d'écran plus récente de la version Windows, montrant le thème "Conservation" et la fonction d'info-bulle pour voir les différents numéros de résidus de séquence des différentes séquences alignées :

Une explication des thèmes que j'ai conçus (jusqu'à présent) est disponible ici.

Nouveau pour la v0.4.0 (branche devel uniquement) :

  • ClustalO renvoie désormais l'ordre d'alignement, plutôt que l'ordre d'entrée. Cela nécessitait une extension Clustalo-Python personnalisée (également ici sur mon github), elle ne fait donc pas partie de master pour le moment.
  • Ajout d'un mini-terminal pour MacOS, car il fonctionne fenêtré et sans terminal en tant que .app
  • utilisations de la mémoire grandement améliorées (tant de dels !)
  • Passé à un installateur pour Windows
  • ajouté une icône et nettoyé
  • Peut maintenant charger plusieurs séquences et alignements à la fois.
  • Recherche et affichage de structure secondaire grâce à DSSP
  • Sélection de la séquence de référence pour ne mettre en évidence que les résidus identiques.
  • Plein d'autres petites améliorations.

Ajouts précédents pour la v0.1.6 :

  • Import/export de séquences et alignements de protéines
  • Enregistrez/Chargez des espaces de travail pour conserver votre travail
  • Combinez les séquences selon vos besoins pour créer de nouveaux alignements à l'aide de ClustalO
  • Les séquences et les alignements peuvent être renommés et organisés en sous-dossiers selon les besoins
  • Les alignements s'enroulent dynamiquement dans la taille de la fenêtre
  • Comprend une règle et une info-bulle contextuelle au clic qui montre le résidu actuellement en surbrillance (et les numéros correspondants pour les autres séquences)
  • Thème préliminaire des résidus, plusieurs thèmes disponibles (plus à venir, sous réserve de modifications)
  • Sélection de la police et de la taille des points pour la fenêtre
  • Peut exporter la fenêtre d'alignement au format PNG.

Il y a encore beaucoup de choses que je veux faire ! Consultez l'onglet « Problèmes » pour les éléments dont je sais qu'ils sont défectueux. Une liste rapide des fonctionnalités que je souhaite ajouter :

  • Actuellement, ne prend en charge que l'algorithme Clustal Omega, et l'appelle même pour seulement deux séquences
  • Je souhaite ajouter une meilleure fonctionnalité de glisser-déposer, telle que faire glisser une nouvelle séquence sur une fenêtre d'alignement, supprimer des séquences d'un alignement ou réorganiser l'ordre (les 2 premières seraient non destructives)
  • Je veux améliorer les thèmes de couleurs
  • Je veux créer un thème sombre pour l'application elle-même
  • Annotations de résidus pour marquer les commentaires et les observations.

REMARQUE : La dernière version (v0.4.0-pre) est basée sur la branche DEVEL et utilise une extension clustalo-python modifiée. C'est pour que je puisse renvoyer l'ordre d'alignement de clustalo (au lieu de simplement sortir l'ordre d'entrée !), mais rend la standardisation plus difficile. Veuillez noter que pour exécuter la branche devel, vous devrez cloner et créer mon référentiel clustalo-python (disponible ici aussi) pour que cela fonctionne !

J'ai essayé de créer des binaires portables pour tous les Mac et Windows. J'espère qu'ils fonctionnent, mais j'apprends encore cette partie.

Si vous voulez essayer de le construire vous-même, ou si cela ne fonctionne pas, voici quelques instructions :

Si vous êtes sous Linux, il y a fort à parier que vous avez déjà fait quelque chose comme ça. Voici le processus de base :

  • Créer un nouvel environnement virtuel
  • Clonez le github dans un dossier et démarrez votre virtualenv
  • Installez tout le nécessaire pour l'exécuter et lancez-le.

Essayez mon ClustalO prédéfini pour la roue python, mais si cela ne fonctionne pas, vous devrez suivre les étapes pour compiler vous-même ClustalO et le wrapper (voir la section Mac pour obtenir des conseils).

Disons que vous voulez essayer de le construire à partir de la source. peut-être la dernière version de développement ou quelque chose. Voici comment. Installez homebrew si vous ne l'avez pas. cela vous facilitera considérablement la vie. Suivez ensuite ces étapes :

Déplacez-vous là où vous voulez que l'application vive et clonez Linnaeo, et préparez votre environnement :

Installez d'abord PyClustalo dedans. C'est le plus délicat, et j'espère que cela fonctionnera pour vous.

Enfin, installez linnaeo et exécutez le programme.

Notez que si vous souhaitez utiliser la fonctionnalité DSSP, vous devrez également créer et installer un binaire DSSP sur votre PATH. Malheureusement, je ne pense plus que DSSP soit inclus dans Homebrew. Cependant, les binaires que j'ai téléchargés devraient avoir un binaire fonctionnel et n'avoir besoin de rien en externe.

Installez Anaconda3 et créez un nouvel environnement :

Sous Windows, j'ai un fichier de roue clustalo pré-compilé qui semble fonctionner normalement. S'il vous plaît laissez-moi savoir si ce n'est pas le cas.

Une fois ouvert, vous serez accueilli par la fenêtre principale. Essayez d'ouvrir certains fichiers de séquence précédemment téléchargés ou d'autres alignements que vous avez effectués (uniquement au format clustal - .clustal ou .aln - ou des fichiers fasta, désolé). Vous pouvez également copier une séquence au format fasta et la coller directement dans le programme.

Les séquences et les alignements peuvent être renommés ou organisés en dossiers. Je vous recommande d'obtenir vos séquences auprès d'UniProt car je l'ai intégré à la fonction de recherche DSSP (elle utilise l'ID de séquence).

Renommer une séquence ne changera pas l'ID sous-jacent, alors n'hésitez pas à l'appeler comme vous voulez ! Vous pouvez accéder à l'ID en copiant une séquence ou en l'exportant. L'exportation d'un alignement utilise les noms affichés à la place.

Mettez en surbrillance quelques séquences (maintenez la touche ctrl enfoncée) et double-cliquez ou appuyez sur le bouton d'alignement pour créer un nouvel alignement.

Il existe également un panneau d'options qui permet de choisir une police, un thème, d'augmenter la taille de la police, etc.

Enfin, essayez de maintenir le bouton de la souris enfoncé sur un résidu dans la fenêtre d'alignement - vous verrez l'ID de résidu (et les identifiants équivalents pour les séquences alignées) dans une info-bulle contextuelle !

Profitez et espérons que cela fonctionnera pour vous, l'intrépide testeur précoce ! J'apprécie vos commentaires !

Des référentiels pour lesquels je suis éternellement reconnaissant - ils m'ont aidé à mettre cela sur Windows - et doivent citer :


FAQ sur les génomes

Que dois-je faire si j'ai des informations sur l'affectation ?

Si vous choisissez l'option génome unique, vous serez invité dans les formulaires à fournir des informations sur les séquences appartenant aux chromosomes, aux plasmides ou aux organites. Si vous choisissez l'option batch, vous devez inclure ces informations dans les en-têtes FASTA. Exigences supplémentaires : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/genomesubmit/#batch_assignment

Quelles informations dois-je être prêt à fournir au sujet des lacunes dans ma soumission de génome ?

Vous devrez confirmer que vous n'avez pas fusionné les séquences au hasard en une seule séquence et fournir des détails sur l'approche que vous avez adoptée. La valeur par défaut dans le formulaire de soumission est que 10 N d'affilée représentent un écart et que les « extrémités appariées » sont la preuve que les séquences de chaque côté de l'écart sont liées. Si cela est incorrect, faites les sélections appropriées pour votre génome.


MetaPASSAGE – Simulations et analyses automatisées de familles de gènes

:: LA DESCRIPTION

MetaPASSAGE, un pipeline logiciel pour générer des communautés bactériennes in silico, simule un échantillon de lectures de fusil de chasse d'une famille de gènes représentée dans la communauté, oriente ou traduit les lectures et produit un alignement basé sur le profil des lectures à partir duquel un arbre phylogénétique de la famille des gènes peut être construit.

:: CAPTURES D'ÉCRAN

:: CONDITIONS

:: PLUS D'INFORMATION


Commenter

Le fichier ADNmt d'ADN vivant a une utilisation limitée, car il ne contient qu'une sélection particulière de marqueurs qu'ils ont choisis pour prédire votre haplogroupe d'ADNmt. Je suppose que vous pourriez l'utiliser pour voir quels marqueurs ils ont testés. Leur prédiction peut être ou non pour votre brindille finale spécifique sur le phylotree d'ADNmt. Afin de vraiment découvrir ce "twig" (si vous êtes intéressé), vous devrez passer le test FTDNA mtDNAFullSequence, qui teste toutes les 16 569 paires de bases, et est actuellement en vente. Vous seul pouvez savoir si c'est quelque chose que vous voulez faire. Avec la séquence complète, vous pouvez faire quelques choses avec, y compris utiliser les sites Web que j'ai mentionnés dans mon dernier message, et d'autres publiés ci-dessous dans ce post.

Je dirai que 23andMe prédit les haplogroupes d'ADNmt de la même manière que l'ADN vivant (par une sélection de marqueurs), et ils ont prédit mon haplogroupe d'ADNmt comme K1a3. C'était le même haplogroupe que ce que Geno 2 de National Geographic m'avait prédit (encore une fois, en ne testant qu'une sélection de marqueurs). Quand j'ai fait la séquence complète FTDNA mtDNA, j'ai pensé que je pourrais aller un peu plus loin dans l'arbre mtDNA, mais il s'est avéré que j'étais toujours K1a3. J'ai une mutation unique, pour ce qu'elle vaut. Ce n'est que mon expérience avec d'autres qui ont fait la séquence complète et leurs résultats les ont poussés plus loin sur leur branche d'origine.

Vos autres informations sur l'ADN vivant sont utiles pour y trouver des correspondances autosomiques. Peut-être qu'un jour ils fourniront des correspondances d'ADNmt. Vous avez raison de vérifier les choses avant de tester, mais considérez cela comme une leçon apprise. Habituellement, les gens testent leur ADN dans l'un des "trois grands" (FTDNA, 23andMe ou Ancestry), mais maintenant qu'il existe plusieurs autres sociétés, cela complique les choses. Lisez toujours les politiques de confidentialité et les conditions d'utilisation des entreprises avant de consentir à quoi que ce soit.

En plus d'utiliser les résultats de la séquence complète de l'ADNmt sur les autres sites Web que j'ai mentionnés précédemment, une autre chose que vous pouvez faire avec un fichier Fasta de séquence complète de l'ADNmt FTDNA (le fichier de données brutes mentionné par l'irfu) est d'abord d'en savoir plus sur Genbank, puis si vous le souhaitez, téléchargez votre fichier mtDNA Fasta sur Genbank pour aider la science. Vous pouvez lire comment effectuer le téléchargement sur cette page du site Web de Ian Logan : séquences d'ADNmt sur « GenBank » (vous pouvez également lire une interview avec Ian Logan, bien qu'il n'y ait pas beaucoup d'informations sur Genbank là-bas). Il est possible que votre fichier soit utile pour ajouter une autre sous-clade à votre haplogroupe. Seule la personne dont l'ADNmt a été testé peut autoriser Genbank à utiliser le fichier.

Avec vos autres informations ADNmt :
L'ADNmt peut contenir des mutations sur des conditions médicales. Si vous le souhaitez, vous pouvez obtenir un rapport d'Ann Turner, membre de l'ISOGG (interview ici) et médecin qui fournit ce service. Elle n'utilise pas le fichier mtDNA Fasta, mais aurait besoin du .pdf de votre certificat mtDNA de FTDNA. Notez que FTDNA ne traite pas les problèmes médicaux liés à l'ADNmt. Cette page ISOGG, "Rapports personnalisés sur l'ADN mitochondrial", contient une description de son service et contient également un lien vers une copie du type de rapport qu'elle fournit.[/LIST]


Puis-je simuler une séquence précédente et suivante de mes fichiers fasta ? - La biologie

J'ai créé ce dépôt de biogrinder principalement pour lire le README.md d'une manière mieux formatée et plus facile.

La source a été téléchargée à l'origine à partir de

Une version plus récente est disponible dès maintenant sur

Ce référentiel ne permet pas de suivre correctement l'historique de développement de biogrinder, son historique de code est à

Veuillez consulter la fin de ce document pour savoir comment le cloner.

Un fusil de chasse omique polyvalent et un simulateur de lecture de séquençage d'amplicons

Grinder est un programme polyvalent permettant de créer des bibliothèques de séquences aléatoires de fusils de chasse et d'amplicons basées sur des séquences de référence d'ADN, d'ARN ou de protéines fournies dans un fichier FASTA.

Grinder peut produire des ensembles de données génomiques, métagénomiques, transcriptomiques, métatranscriptomiques, protéomiques, métaprotéomiques et amplicons à partir des technologies de séquençage actuelles telles que Sanger, 454, Illumina. Ces ensembles de données simulés peuvent être utilisés pour tester l'exactitude des outils bioinformatiques sous des hypothèses spécifiques, par ex. avec ou sans erreurs de séquençage, ou avec une diversité communautaire faible ou élevée. Grinder peut également être utilisé pour aider à décider entre des méthodes de séquençage alternatives pour un projet basé sur la séquence, par ex. si la bibliothèque est appariée ou non, combien de lectures doivent être séquencées.

  • bibliothèques de lecture de fusil de chasse ou d'amplicon
  • support omique pour générer des ensembles de données génomiques, transcriptomiques, protéomiques, métagénomiques, métatranscriptomiques ou métaprotéomiques
  • distribution arbitraire de la longueur de lecture et nombre de lectures
  • simulation d'erreurs de PCR et de séquençage (chimères, mutations ponctuelles, homopolymères)
  • prise en charge des ensembles de données appariées (paire mate)
  • paramètres de rang-abondance spécifiques ou abondance donnée manuellement pour chaque génome, gène ou protéine
  • création de jeux de données avec une richesse donnée (diversité alpha)
  • des ensembles de données indépendants peuvent partager un nombre variable de génomes (diversité bêta)
  • modélisation du biais créé par la variation de la longueur du génome ou du nombre de copies de gène
  • mécanisme de profil pour stocker les options préférées
  • disponible pour les biologistes ou les utilisateurs expérimentés via plusieurs interfaces : GUI, CLI et API

Brièvement, étant donné un fichier FASTA contenant une séquence de référence (génomes, gènes, transcrits ou protéines), Grinder effectue les étapes suivantes :

Lisez les séquences de référence et, pour les ensembles de données d'amplicons, extrayez les amplicons PCR de référence pleine longueur à l'aide des amorces PCR dégénérées fournies.

Déterminer la structure de la communauté en fonction de la diversité alpha fournie (nombre de séquences de référence dans la bibliothèque), de la diversité bêta (nombre de séquences de référence en commun entre plusieurs bibliothèques indépendantes) et du modèle de rang-abondance spécifié.

Effectuez des lectures au fusil de chasse à partir des séquences de référence ou des lectures d'amplicons à partir des amplicons PCR de référence pleine longueur. Les lectures peuvent être des lectures appariées lorsqu'une distribution de taille d'insertion est spécifiée. La longueur des lectures dépend de la distribution de longueur de lecture fournie et leur abondance dépend de l'abondance relative dans la structure de la communauté. La longueur du génome peut également biaiser le nombre de lectures à effectuer pour les ensembles de données de fusil de chasse à cette étape. De même, pour les ensembles de données d'amplicons, le nombre de copies du gène cible dans les génomes de référence peut biaiser le nombre de lectures à effectuer.

Modifiez les lectures en insérant des erreurs de séquençage (indels, substitutions et erreurs d'homopolymère) suivant un modèle spécifique à la position pour simuler les lectures créées par les technologies de séquençage actuelles (Sanger, 454, Illumina). Écrivez les lectures et leurs scores de qualité dans des fichiers FASTA, QUAL et FASTQ.


Tutoriel sur les formats de fichiers

Cette section explique certains des formats de fichiers couramment utilisés en bioinformatique. Les informations fournies ici sont basiques et conçues pour aider les utilisateurs à distinguer les différents formats. Veuillez vous référer au manuel d'utilisation ou à d'autres ressources d'information sur le Web pour plus de détails.

RAPIDE

Extensions de fichiers : fichier.fa, fichier.fasta, fichier.fsa

Le format Fasta est un moyen simple de représenter des séquences de nucléotides ou d'acides aminés d'acides nucléiques et de protéines. Il s'agit d'un format très basique avec deux lignes minimum. La première ligne appelée ligne de commentaire commence par « > » et donne des informations de base sur la séquence. Il n'y a pas de format défini pour la ligne de commentaire. Toute autre ligne commençant par '' sera ignorée. Les lignes avec '' ne sont pas une caractéristique courante des fichiers fasta. Après la ligne de commentaire, la séquence d'acide nucléique ou de protéine est incluse dans le code standard à une lettre. Tous les tabulateurs, espaces, astérisques, etc. dans l'ordre seront ignorés.

FASTQ

Extensions de fichiers : fichier.fastq, fichier.sanfastq, fichier.fq

Le format Fastq a été développé par l'institut Sanger afin de regrouper la séquence et ses scores de qualité (Q : score de qualité phred). Dans les fichiers fastq, chaque entrée est associée à 4 lignes.

  • La ligne 1 commence par un caractère ‘ @ ‘ et est un identifiant de séquence et une description facultative.
  • Ligne 2 Séquence en code standard à une lettre.
  • La ligne 3 commence par un caractère ‘ + ‘ et est éventuellement suivie à nouveau par le même identifiant de séquence (et toute description supplémentaire).
  • La ligne 4 code les valeurs de qualité de la séquence de la ligne 2 et doit contenir le même nombre de symboles que les lettres de la séquence.

Description détaillée sur le format fastq :

Ligne 1: @K00188:208:HFLNGBBXX:3:1101:1428:1508 2:N:0:CTTGTA

Ligne 2: ATAATAGGATCCCTTTTCCTGGAGCTGCCTTTAGGTAATGTAGTATCTNATNGACTGNCNCCANANGGCTAAAGT

Ligne 4 : AAAFFJJJJJJJJJJJJJJJJJFJJFJJJJJFJJJJJJJJJJJJJJJ#FJ#JJJJF#F#FJJ#F#JJJFJJJJJ

Un score de qualité (échelle PHRED) pour chaque paire de bases. Il indique à quel point nous pouvons être sûrs que la base a été séquencée et identifiée correctement.

où p est la probabilité que l'appel de base correspondant soit incorrect.

Niveau de qualité Phred Probabilité que la base s'appelle fausse Précision de l'appel de base
10 1 sur 10 90%
20 1 sur 100 99%
30 1 sur 1000 99.90%
40 1 sur 10000 99.99%
50 1 sur 100000 100.00%

Fastq-sanger détient un score PHRED de 0-93 tandis que fastq-Illumina fournit des scores PHRED de 0-62. Plutôt que de donner des valeurs numériques du score PHRED, elles sont fournies en codes de caractères ASCII de 33 à 126. Pourquoi 33 à 126 ? Parce que 33 à 126 codes pour des caractères uniques, le score peut donc être représenté par un seul caractère. Référez-vous au tableau ci-dessous.

Basée sur le caractère de base (caractère qui représente zéro score PHRED), l'échelle PHRED est souvent appelée FHRED+33 (caractère ASCII !) ou FHRED+64 (caractère ASCII ?). La figure ci-dessous illustre l'utilisation de PHRED dans différentes notations de séquençage.

Il est essentiel de déterminer le type de score PHRED utilisé dans les fichiers .fastq avant de les traiter. Les fichiers Illumina .fastq actuels ont un score PHRED de +33. Veuillez consulter https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2847217/ pour plus de détails.

SAM (carte d'alignement de séquence)

Les Format SAM est un format texte pour stocker des données de séquence dans une série de colonnes ASCII délimitées par des tabulations. Le plus souvent, il est généré en tant que version lisible par l'homme de son format frère BAM, qui stocke les mêmes données sous une forme binaire compressée, indexée.

Les fichiers au format SAM sont générés après le mappage des lectures sur la séquence de référence. Il s'agit d'un format de texte délimité par des tabulations avec un en-tête et un corps. Les lignes d'en-tête commencent par « @ », contrairement aux lignes d'alignement. L'en-tête contient des informations génériques sur le fichier SAM ainsi que des informations sur la version, si le fichier est trié, des informations sur la séquence de référence, etc. Les enregistrements d'alignement constituent le corps du fichier. Chaque ligne/enregistrement d'alignement comporte 11 champs obligatoires décrivant les informations d'alignement essentielles.

Quelques termes utilisés dans le manuel SAM :

Modèle : Le fragment d'ADN qui a été mesuré

Lectures : Selon la méthodologie, un modèle peut produire une ou plusieurs lectures. Ces lectures peuvent couvrir le modèle entier ou juste une sous-section de celui-ci. Les lectures provenant du même modèle couvrent généralement différentes parties du modèle et peuvent représenter le modèle lui-même ou son complément inverse.

Segments : chaque lecture peut produire un ou plusieurs alignements qui à leur tour auront des régions alignées appelées segments. À partir de ces segments, il peut être possible de déduire la taille du modèle d'origine.


source : http://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf

Col. 1 QNAME :

Requête NOM. Les lectures/segments ayant le même QNAME sont considérés comme provenant du même modèle. Un QNAME « * » indique que l'information n'est pas disponible. Dans un fichier SAM, une lecture peut occuper plusieurs lignes d'alignement, lorsque son alignement est chimérique .

Col. 2 DRAPEAU:

Combinaison d'indicateurs au niveau du bit.

BIT La description
1 0x1 modèle comportant plusieurs segments dans le séquençage
2 0x2 chaque segment correctement aligné selon l'aligneur
4 0x4 segment non mappé
8 0x8 segment suivant dans le modèle non mappé
16 0x10 SEQ complémenté à l'envers
32 0x20 SEQ du segment suivant dans le modèle étant inversé complété le premier segment dans le modèle
64 0x40 le premier segment du modèle
128 0x80 le dernier segment du modèle
256 0x100 alignement secondaire
512 0x200 ne pas passer les filtres, tels que les contrôles de qualité de la plate-forme/du fournisseur
1024 0x400 PCR ou duplicata optique
2048 0x800 alignement supplémentaire

Col. 3 RNAME:

Nom de la séquence de référence. Il fait généralement référence au nombre de chromosomes.

Col. 4 PDV:

Position de mappage la plus à gauche de la première base correspondante en lecture. Il a une indexation basée sur 1. Si pos est défini sur 0, cela représente une lecture non mappée. Pour une paire de lecture READ1/1 et READ1/2 et une seule Read2

Col. 5 MAPQ:

Il indique la qualité MAPpping. MAPQ= -10log10(Probabilité que la position cartographique soit erronée). MAPQ=255 indique que la qualité de mappage n'est pas disponible.

Col. 6 CIGARE:

Une chaîne qui décrit l'alignement.

OP BAM La description
M 0 correspondance d'alignement (peut être une correspondance ou une non-concordance de séquence)
je 1 insertion à la référence
2 suppression de la référence
N 3 région ignorée de la référence
S 4 écrêtage doux (séquences écrêtées présentes dans SEQ)
H 5 écrêtage dur (séquences écrêtées NON présentes dans SEQ)
P 6 remplissage (suppression silencieuse de la référence rembourrée
= 7 correspondance de séquence
X 8 non-concordance de séquence

La différence entre H et S est que si la séquence de non-concordance est signalée comme faisant partie de la séquence de lecture dans le fichier d'alignement, il s'agit d'un écrêtage logiciel. Souvent, la région de mésappariement correspond ailleurs dans la séquence de référence et dans ce cas, la région de mésappariement est supprimée de la séquence de lecture signalée dans l'alignement et est appelée écrêtage dur.

La valeur CIGAR de Read2 dans l'exemple POS sera :

cccc ne correspond nulle part ailleurs dans la référence donc un écrêtage doux. , 5 correspondances (GATAC), 2 insertions (TA), 4 correspondances (GTAA), 1(*) suppression, 3 correspondances (GAT), 2 (..)région ignorée de la référence (N), 4 correspondances (GTCT)

Col. 7 RNEXT , Col. 8 PNEXT:

RNEXT et PNEXT permettent de connaître la référence et la position d'un partenaire de lecture appariée pour les outils de visualisation. RNEXT est le nom du chromosome ou du contig sur lequel le modèle suivant d'une paire s'aligne. RNEXT de la valeur « = » signifie aligner sur la même référence et « * » ne représente aucune information disponible (séquençage à une seule extrémité). PNEXT où s'aligne l'autre lecture de la paire (Information non disponible =0, Sinon valeur POS de la paire).

Read1/1 et Read1/2 sont appariés et Read 3 n'est pas apparié. Ainsi, les valeurs RNEX et PNEXT seront

Col. 9 TLEN : LENgth du modèle observé

Il représente la longueur de référence couverte par les lectures de fin de paire. La distance entre la base mappée la plus à gauche et la base mappée la plus à droite dans les lectures appariées. Pour les lectures non appariées, c'est 0.

Col. 10 SEQ: Séquence de lecture ou Segment.

Col. 11 QUAL : valeurs de score PHRED de lecture. Si '*' aucune valeur n'est stockée.

Un fichier BAM (Binary Alignment/Map) est la version binaire compressée du Sequence Alignment/Map (SAM), une représentation compacte et indexable des alignements de séquences de nucléotides. Les données entre SAM et BAM sont exactement les mêmes. Les fichiers BAM binaires sont de petite taille et idéaux pour stocker des fichiers d'alignement. Exiger que samtools affiche le fichier.

VCF (format/fichier d'appel de variante)

VCF est un format de fichier texte avec un en-tête (version d'information VCF, échantillon, etc.) et les lignes de données constituent le corps du fichier.

Cela contient des méta-informations et est inclus après la chaîne « ## ». Il est recommandé d'inclure les entrées INFO, FILTER et FORMAT pour une meilleure explication du champ de données.

D'autres informations telles qu'un allèle alternatif, un champ d'assemblage, un champ contig, un champ d'échantillon, un champ de pedigree peuvent également être incluses.

Les lignes de données ont 8 colonnes obligatoires.

#CHROM, POS, ID, REF, ALT, QUAL, FILTRE, INFO.

Le format VCF a un manuel très bien expliqué disponible sur https://samtools.github.io/hts-specs/VCFv4.2.pdf .

GFF (format de caractéristiques générales ou format de recherche de gènes)

Extensions de fichiers : fichier.gff2, fichier. gff3, fichier.gff

Il a 8 premiers champs comme GFF2 mais diffère dans le champ 9 dans l'attribution d'attributs. 2 sont mis en évidence ici.
(a) GFF3 a une meilleure fonction d'imbrication. Lie les fonctionnalités à la balise parente

(b) La manière la plus générale de représenter un gène codant pour une protéine est ce que l'on appelle le « gène à trois niveaux ». Le niveau supérieur est une caractéristique du type « gène » qui regroupe les transcrits du gène. et les éléments réglementaires. Sous ce niveau se trouvent un ou plusieurs transcrits de type “mRNA”. Ce niveau peut également accueillir des promoteurs et d'autres éléments cis-régulateurs. Au troisième niveau se trouvent les composants des transcrits d'ARNm, le plus souvent des segments codant pour CDS et des UTR. Cet exemple montre comment représenter un gène nommé “EDEN” qui possède trois transcrits d'ARNm épissés alternativement :

Source : http://gmod.org/wiki/GFF3
GFF (format de caractéristiques générales ou format de recherche de gènes). GFF peut être utilisé pour tout type de caractéristique (transcriptions, exon, intron, promoteur, 3 'UTR, éléments répétitifs, etc.) associée à la séquence, tandis que GTF est principalement destinée aux gènes/transcriptions. GFF3 est la dernière version et une amélioration par rapport au format GFF2. Cependant, de nombreuses bases de données ne sont toujours pas équipées pour gérer la version GFF3. Les différences seront expliquées plus loin dans le texte.

Le format GFF a 9 colonnes obligatoires et elles sont séparées par des tabulations. Les 9 colonnes sont les suivantes.

Col. 1 Séquence de référence:

Il s'agit de l'ID de la séquence de référence utilisée pour établir le système de coordonnées pour l'annotation. Généralement le nom ou le numéro du chromosome.

Col. 2 La source:

Cela explique comment l'annotation d'entité est dérivée. La source est un qualificateur de texte libre destiné à décrire l'algorithme ou la procédure d'exploitation qui a généré cette fonctionnalité. Il s'agit généralement du nom d'un logiciel, tel que “Genescan” ou d'un nom de base de données, tel que “Genbank.” En effet, la source est utilisée pour étendre l'ontologie des caractéristiques en ajoutant un qualificateur au type créant un nouveau type composite qui est une sous-classe du type dans la colonne type. Il n'est pas nécessaire de spécifier une source. S'il n'y a pas de source, mettez un “.” (un point) dans ce champ.

Col. 3 Caractéristique:

Le nom du type d'entité, comme “gene” ou “exon”. Dans un fichier GFF bien structuré, toutes les caractéristiques enfants (exons, introns, etc.) suivent toujours la ligne caractéristique de leurs parents (transcription). De cette façon, ils font partie d'un seul bloc

Col. 4 Début:

Génomique Début de la fonctionnalité.

Début génomique de la fonctionnalité

Col. 6 But:

Valeur numérique qui indique généralement la confiance de la source sur l'entité annotée. Une valeur de “.” (un point) est utilisée pour définir une valeur nulle. La sémantique de la partition est mal définie. Au format GFF3, il est fortement recommandé d'utiliser les valeurs E pour les caractéristiques de similarité de séquence et les valeurs P pour les caractéristiques de prédiction de gènes ab initio. S'il n'y a pas de score, mettez un “.” (un point) dans ce champ.

Col. 7 Brin:

Champ qui indique le brin de détection de l'entité. « + » : brin Watson et « - » : brin crick. « ? » peut être utilisé pour les fonctionnalités dont l'échouage est pertinent, mais inconnu.

Col. 8 Trame (GFF2 et GTF) ou Phase (GFF3) :

Pour les entités de type “CDS”, la phase indique où commence la caractéristique en référence au cadre de lecture. La phase est l'un des nombres entiers 0, 1 ou 2, indiquant le nombre de bases qui doivent être retirées du début de cette caractéristique pour atteindre la première base du codon suivant. En d'autres termes, une phase de 𔄘” indique que le prochain codon commence à la première base de la région décrite par la ligne courante, une phase de 𔄙” indique que le prochain codon commence à la deuxième base de cette région, et une phase de 𔄚” indique que le codon commence à la troisième base de cette région. A NE PAS confondre avec la trame, qui est simplement start modulo 3. S'il n'y a pas de phase, mettez un “.” (un point) dans ce champ.

Pour les entités de brin avant, la phase est comptée à partir du champ de départ. Pour les entités à brin inversé, la phase est comptée à partir du champ de fin.

La phase est obligatoire pour toutes les fonctionnalités de CDS.

Expliqué, disons que ### et *** représentent des exons consécutifs.

CTG C ​​est la première base (0), T est la deuxième base (1), G est la troisième base (2)

Col. 9 Champ Attribut ou Groupe :

Toutes les lignes du même groupe sont liées entre elles en un seul élément. Le terrain de groupe est un défi. Il est utilisé de plusieurs manières distinctes :

  • pour regrouper une seule caractéristique de séquence qui s'étend sur une plage discontinue, telle qu'un alignement avec intervalle.
  • pour nommer une caractéristique, ce qui permet de la récupérer par son nom.
  • pour ajouter une ou plusieurs notes à l'annotation.
  • pour ajouter un autre nom

L'un des problèmes de GFF2 est qu'il n'est capable de représenter qu'un seul niveau d'imbrication de fonctionnalités. Ceci est principalement un problème lorsqu'il s'agit de gènes qui ont plusieurs transcrits épissés alternativement. GFF2 est incapable de gérer la hiérarchie à trois niveaux de gène transcription exon. La plupart des gens contournent ce problème en déclarant une série de transcriptions et en leur donnant des noms similaires pour indiquer qu'ils proviennent du même gène.

La deuxième limitation est que si GFF2 vous permet de créer des hiérarchies à deux niveaux, telles que transcription exon, il n'a aucune notion de la direction de la hiérarchie. Il ne sait donc pas si l'exon est une sous-fonction de la transcription, ou vice-versa. Cela signifie que vous devez utiliser des “agrégateurs” pour trier les relations. C'est une douleur importante dans le cou. Pour cette raison, le format GFF2 a été déprécié au profit des bases de données au format GFF3.

GTF (format de transfert de gènes)

GTF a le même format que les fichiers GFF. Il a les mêmes 9 champs qui décrivent les caractéristiques liées au gène/transcrit. The group/attribute field has been expanded into a list of attributes. Each attribute consists of a type/value pair. Attributes must end in a semi-colon, and be separated from any following attribute by exactly one space. The attribute list must begin with the two mandatory attributes:

gene_id value: A globally unique identifier for the genomic source of the sequence.

transcript_id value: A globally unique identifier for the predicted transcript.


7. Correct the assembly¶

Sequences from PacBio can have more errors than those from Illumina. Therefore, although it is useful to use the long PacBio reads to assemble the genome, we can also use the shorter and more accurate Illumina reads to correct errors in the PacBio assembly.

Make an alignment file¶

  • Aligns Illumina R1.fq and R2.fq to the PacBio assembly genome.fasta .
  • This produces a .bam file
  • | pipes the output to samtools to sort (required for downstream processing)
  • > pilon_aln . bam redirects the sorted bam to this file

Run Pilon¶

  • --genome is the name of the input assembly to be corrected
  • --frags is the alignment of the reads against the assembly
  • --output is the name of the output prefix
  • --fix is an option for types of corrections
  • --mindepth gives a minimum read depth to use
  • --changes produces an output file of the changes made
  • --verbose prints information to the screen during the run
  • --threads : number of cores

  • We can see lots of cases where a deletion (represented by a dot) has been corrected to a base.
  • Type q to exit.

We now have the corrected genome assembly of Staphylococcus aureus in .fasta format, containing a chromosome and a small plasmid.

Questions¶

Why don&rsquot we correct earlier in the assembly process?

Answer (click to reveal) We need to circularise the contigs and trim overhangs first.

Why can we use some reads (Illumina) to correct other reads (PacBio) ?

Answer (click to reveal) Illumina reads have higher accuracy.

Could we just use PacBio reads to assemble the genome?

Answer (click to reveal) Yes, if accuracy adequate.


Sequences and Alphabets¶

The alphabet object is perhaps the important thing that makes the Seq object more than just a string. The currently available alphabets for Biopython are defined in the Bio.Alphabet module. We’ll use the IUPAC alphabets here to deal with some of our favorite objects: DNA, RNA and Proteins.

Bio.Alphabet.IUPAC provides basic definitions for proteins, DNA and RNA, but additionally provides the ability to extend and customize the basic definitions. For instance, for proteins, there is a basic IUPACProtein class, but there is an additional ExtendedIUPACProtein class providing for the additional elements “U” (or “Sec” for selenocysteine) and “O” (or “Pyl” for pyrrolysine), plus the ambiguous symbols “B” (or “Asx” for asparagine or aspartic acid), “Z” (or “Glx” for glutamine or glutamic acid), “J” (or “Xle” for leucine isoleucine) and “X” (or “Xxx” for an unknown amino acid). For DNA you’ve got choices of IUPACUnambiguousDNA, which provides for just the basic letters, IUPACAmbiguousDNA (which provides for ambiguity letters for every possible situation) and ExtendedIUPACDNA, which allows letters for modified bases. Similarly, RNA can be represented by IUPACAmbiguousRNA or IUPACUnambiguousRNA.

The advantages of having an alphabet class are two fold. First, this gives an idea of the type of information the Seq object contains. Secondly, this provides a means of constraining the information, as a means of type checking.

Now that we know what we are dealing with, let’s look at how to utilize this class to do interesting work. You can create an ambiguous sequence with the default generic alphabet like this:

However, where possible you should specify the alphabet explicitly when creating your sequence objects - in this case an unambiguous DNA alphabet object:


Reproducibility with Scripts

It is highly unlikely that an analysis of this type is performed only once. More often than not, we’ll wish to adjust or replace the input files, compare to different protein sets, or adjust the parameters for the programs ran. Thus it make sense to capture the analysis we just performed as an executable script, perhaps called runhmmer.sh .

Note in the above that we’ve broken the long hmmsearch line into two by ending it midway with a backslash and continuing it on the next line. The backslash lets bash know that more of the command is to be specified on later lines. (The backslash should be the last character on the line, with no spaces or tabs following.) After making this script executable with chmod , we could then rerun the analysis by navigating to this directory and running ./runhmmer.sh .

What if we wanted to change the input file, say, to argonase-1s.fasta instead of p450s.fasta ? We could create a new project directory to work in, copy this script there, and then change all instances of p450s.fasta in the script to argonase-1s.fasta .

Alternatively, we could use the power of environment variables to architect our script in such a way that this process is easier.

Now the file names of interest are specified only once, near the top of the script, and from then on the script uses its own identifiers (as environment variables) to refer to them. Reusing this script would be as simple as changing the file names specified in three lines.

We can go a step further. It turns out that shell scripts can take parameters from the command line. The first parameter given to a script on the command line will be automatically stored in a variable accessible to the script called $1 , the second parameter will be stored in $2 , and so on. We can thus further generalize our script:

We could have replaced all instances of $query with $1 , but this organization makes our script easier to read in the future, an important consideration when programming. Now we can run a full analysis by specifying the three relevant file names on the command line, as in: ./runhmmer.sh p450s.fasta dmel-all-translation-r6.02.fasta p450s_hmmsearch_dmel.txt .

Cette runhmmer.sh is a good candidate for inclusion in our $HOME/local/bin so that we can run it from anywhere, though we may want to add lines immediately following the #! line, to provide some help text for anyone who attempts to run the script without providing the correct inputs:

The “if block” above will only execute if the number of parameters given ( $# ) is not equal to 3. Although languages like Python provide much nicer facilities for this sort of logic-based execution, the ability to conditionally provide usage information for scripts is important. As usual for bash , the interpreter ignores lines that start with # .