Informations

Une protéine tombant en dessous d'un seuil peut-elle déclencher une autre réponse ?


Est-il possible que la chute de la concentration d'une protéine en dessous d'un seuil déclenche la libération ou la production d'une autre protéine ?


Bien sûr, c'est possible. Je vais donner un exemple simple. Si votre protéine (X) est un inhibiteur de l'autre protéine (Y), alors lorsque X chute, Y augmente. Ce ne serait pas vraiment « seuillé ».

Il existe de nombreux mécanismes qui peuvent conduire au seuillage qui incluent la coopération (dans l'action de X) et les rétroactions positives. Le fonctionnement de ces mécanismes serait une toute autre question. (Une lecture rapide serait cet article wikipedia).


Recommandations pour la transfusion de plasma et de plaquettes

L'indication principale de la transfusion de plasma est de corriger les déficits en facteurs de coagulation, pour lesquels un concentré spécifique n'est pas disponible, chez les patients présentant une hémorragie active. Les produits disponibles sont : le plasma frais congelé (FFP), le plasma ayant subi une inactivation virale par traitement solvant/détergent (S/D FFP), au bleu de méthylène (MB FFP) ou aux psoralènes, notamment l'amotosalène (S59) et la lumière 1 une technologie d'inactivation utilisant la riboflavine sera bientôt disponible 2 .

Plasma frais-congelé

Définition

Un composant sanguin préparé à partir de sang total ou collecté par aphérèse, congelé dans des délais et à une température tels qu'ils préservent adéquatement les facteurs de coagulation labiles 3 – 5 .

Les FFP préparés à partir d'unités de sang total et ceux issus d'aphérèse sont thérapeutiquement équivalents en termes d'hémostase et d'effets secondaires (Grade de recommandation : 1A) 4 .

Propriétés

Le FFP contient des niveaux normaux de facteurs de coagulation stables, d'albumine et d'immunoglobulines. Il contient au moins 70 % du facteur VIII coagulant d'origine et des quantités au moins similaires des autres facteurs de coagulation labiles et des inhibiteurs naturels de la coagulation 1 , 3 &# x02013 5 .

Le FFP à usage clinique ne doit pas contenir d'anticorps anti-érythrocytes irréguliers cliniquement significatifs. Afin d'augmenter sa sécurité, FFP peut être mis en quarantaine pendant une période minimale de 4 mois.

Les différences individuelles physiologiques dans les concentrations de protéines plasmatiques signifient que la définition générique de FFP est appliquée à des produits qui diffèrent notablement par la qualité.

Plasma traité au solvant/détergent

S/D FFP est un produit pharmaceutique, obtenu à partir d'un pool d'environ 1 000 unités de FFP, présentant les caractéristiques suivantes 2 , 6 – 34 :

- standardisation élevée lot par lot

- concentration/activité déclarée des protéines biologiquement actives

- réduction des risques immunologiques liés à la présence d'anticorps, de cellules (ou de leurs fragments)

- inactivation de la majorité des agents pathogènes potentiellement transmissibles

- élimination sélective des unités contaminées par le virus de l'hépatite A ou le parvovirus B19.

Plasma traité au bleu de méthylène

Le bleu de méthylène (MB) est un colorant phénothiazine avec un effet virucide 2 , 35 &# x02013 40 . MB FFP n'est pas un produit pharmaceutique, mais est dérivé de l'utilisation d'une méthode d'inactivation appliquée à des unités individuelles de plasma.

La teneur en protéines biologiquement actives de ce produit ne peut pas être standardisée, la variabilité biologique des unités reste donc élevée.

La diminution potentielle du risque infectieux résiduel est la même que pour le S/D FFP.

Il existe des preuves dans la littérature que les méthodes d'inactivation virale provoquent une diminution des concentrations de certains facteurs de coagulation et inhibiteurs de la coagulation 33 &# x02013 40 .

Les indications

La transfusion de FFP est indiquée dans les situations suivantes ( Tableau I ) :

Correction des déficiences congénitales en facteurs de coagulation, pour lesquelles il n'existe pas de concentré spécifique, ou des déficiences acquises en plusieurs facteurs de coagulation, lorsque le PT ou aPTT, exprimé sous forme de ratio, est de > 1,5, dans les circonstances énumérées ci-dessous 1 , 3 , 4 , 41 – 67 :

Saignements en cours chez les patients atteints d'une maladie du foie (Grade de recommandation : 1C+) 41 – 51 , 56 – 58 , 67 .

Prévention des saignements, en cas de chirurgie ou de procédures invasives, chez les patients atteints d'une maladie du foie (Grade de recommandation : 2C) 41 – 51 , 56 – 58 , 67 – 70 .

Patients traités par des antagonistes de la vitamine K, en présence d'hémorragie majeure ou d'hémorragie intracrânienne ou en préparation d'une intervention chirurgicale qui ne peut être différée (Grade de recommandation : 1C+) 42 – 51 , 56 – 58 , 67 , si le concentré de complexe prothrombique, le traitement de premier choix, n'est pas disponible 55 , 59 – 65 .

Patients présentant une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) aiguë et un saignement actif, en association avec la correction de la cause sous-jacente (Grade de recommandation : 1C+) 41 – 51 , 53 , 54 , 56 – 58 , 67 .

Correction des saignements microvasculaires chez les patients subissant une transfusion massive. Si le PT et le TCA ne peuvent être obtenus dans un délai raisonnable, le FFP peut être transfusé dans tous les cas pour tenter d'arrêter le saignement (Grade de recommandation : 1C+) 41 – 51 , 56 – 58 , 66 , 67 .

Carences en facteurs de coagulation uniques, en l'absence de concentré spécifique (par exemple, déficit en facteur V), en présence d'un saignement actif ou afin de prévenir les saignements, en cas de chirurgie ou de procédures invasives (Grade de recommandation : 1C+) 41 – 51 , 56 – 58 , 67 .

Traitement aphérétique des microangiopathies thrombotiques (purpura thrombotique thrombocytopénique, syndrome hémolytique et hémolytique, anémie hémolytique élévation des enzymes hépatiques et syndrome de faible numération plaquettaire [HELLP]), en tant que liquide de remplacement (Grade de recommandation : 1A) 41 – 52 , 56 – 58 , 67 .

Reconstitution de sang total pour exsanguinotransfusion (Grade de recommandation : 2C) 71 , 72 .

Angio-œdème héréditaire par déficit en estérase, en l'absence de l'inactivateur de C1 dérivé plasmatique spécifique (Grade de recommandation : 2C+) 50 .

Tableau I

Indications pour la transfusion de plasma

État cliniqueGoR
1. Correction des déficiences congénitales ou acquises en facteurs de coagulation (pour lesquelles il n'existe pas de concentré spécifique), lorsque le rapport PT ou aPTT est de ϡ,5 :
  - Maladie du foie :
    - saignement actifng1C+
    - prévention des saignements en cas de chirurgie ou de procédures invasives2C
  - Pendant le traitement par antivitamine K (si le complexe prothrombine, qui est le traitement de premier choix, n'est pas disponible) :1C+
     - en cas d'hémorragie majeure ou intracrânienne
     - en vue d'une intervention chirurgicale qui ne peut être retardée
  - Coagulation intravasculaire disséminée aiguë avec saignement actif, en association avec la correction de la cause sous-jacente1C+
  - Saignements microvasculaires lors de transfusions massives (ϡ volume sanguin), avant même les résultats du PT et du TCA1C+
  - Carences en facteurs de coagulation uniques, en l'absence de concentrés spécifiques (par exemple de FV), en présence d'un saignement actif ou pour prévenir le saignement lors d'une procédure invasive1C+
2. Traitement aphérétique des microangiopathies thrombotiques (purpura thrombocytopénique thrombotique, syndrome hémolytique et urémique, syndrome HELLP), en tant que liquide de remplacement1A
3. Reconstitution de sang total pour les exsanguinotransfusions2C
4. Angio-œdème héréditaire dans le cas où l'inhibiteur de la C1-estérase n'est pas disponible2C+

Légende : GoR : Grade de recommandation HELLP : anémie hémolytique enzymes hépatiques élevées et faible numération plaquettaire

Indications chez le nouveau-né

Les temps de coagulation chez le nouveau-né, qui sont en moyenne plus longs que ceux de l'adulte, ne sont pas nécessairement liés au risque de saignement 71 – 74 . C'est encore plus le cas chez les nouveau-nés prématurés ainsi, des résultats anormaux aux tests de coagulation, en l'absence de symptômes ou de risque hémorragique, ne sont pas une indication pour la transfusion de FFP.

Le FFP est indiqué pour les saignements causés par une carence en vitamine K et les saignements (ou risque élevé de saignement) dus à la CIVD. Il est également indiqué pour le traitement des déficiences congénitales en facteurs de coagulation uniques, lorsque le concentré spécifique n'est pas disponible (Grade de recommandation : 2C) 4 , 71 – 74 .

Le FFP doit de préférence être « sûr » dans le sens d'avoir subi une inactivation virale ou d'avoir été mis en quarantaine.

Pour plus de détails, se référer aux recommandations conjointes de la Société italienne de néonatologie et du SIMTI 72 .

Modes d'utilisation

Le FFP doit être décongelé entre 30 ଌ et 37 ଌ dans un bain-marie sous agitation continue ou avec un autre système capable d'assurer une température contrôlée. Le plasma doit être transfusé dès que possible après décongélation, mais en tout cas dans les 24 heures, s'il est conservé à 4 ± 2 ଌ 4 , 5 .

Se référer à la fiche récapitulative du produit pour connaître le délai maximum entre la fin de la décongélation du S/D FFP et le début de sa transfusion.

Les FFP ne doivent pas être recongelés une fois décongelés (Grade de recommandation : 1C+) 4 .

Schéma posologique

La dose thérapeutique recommandée de FFP est de 10 ml/kg de poids corporel 1 , 4 , 43 , 44 , 47 . La dose de FFP dépend cependant de la situation clinique et des paramètres de laboratoire (Grade de recommandation : 1C+) 1 , 4 , 43 , 44 , 47 , 50 , ce qui peut justifier l'administration de doses plus élevées 75 – 77 .

Compatibilité ABO/RhD

Le plasma utilisé doit être compatible ABO avec le receveur ( Tableau II ) (Grade de recommandation : 1C+) 3 , 4 , 50 .

Tableau II

Thérapie transfusionnelle avec FFP : sélection du phénotype ABO des unités à transfuser

Phénotype ABO du receveurPhénotype ABO des unités à transfuser (par ordre de préférence)
OO, A, B, AB
UNEA, AB
BB, AB
UN BUN B

FFP n'a pas besoin d'être Rh-compatible La prophylaxie anti-D n'est pas nécessaire chez les receveurs Rh D-négatif de FFP Rh D-positif (Grade de recommandation : 1C+) 3 , 4 .

Indications inappropriées

- Expansion du volume circulatoire

- correction des déficits immunitaires

- correction des déficits congénitaux ou acquis en facteurs de coagulation en l'absence d'hémorragie, ou correction des troubles de l'hémostase chez les patients atteints d'une maladie hépatique chronique qui ne saignent pas (Grade de recommandation : 1C+) 4 , 42 – 51 , 56 – 58 , 68 , 69 , 71 – 73 , 77 – 80 .

Contre-indications

Les contre-indications absolues à l'utilisation de FFP sont une intolérance documentée au plasma ou à ses composants et un déficit congénital en immunoglobulines A (IgA) en présence d'anticorps anti-IgA 4 .

Les contre-indications relatives sont l'insuffisance cardiaque et l'œdème pulmonaire.

Indices de suivi pour l'audit clinique

- L'utilisation de la thérapie transfusionnelle avec FFP dans les situations suivantes :

expansion du volume circulatoire

correction des déficiences immunitaires

correction des déficits congénitaux ou acquis en facteurs de coagulation en l'absence d'hémorragie, ou correction des troubles de l'hémostase chez les patients atteints d'une maladie hépatique chronique qui ne saignent pas.

- Evaluation de la pertinence de la dose de FFP.

Effets indésirables à la transfusion de FFP

légère (urticaire) : survient chez 1 % des patients

sévère et anaphylactique : surviennent avec une fréquence inférieure à 1 cas pour 100 000 transfusions.

- Traumatisme pulmonaire aigu lié à la transfusion (TRALI) 81 – 85 : œdème pulmonaire non cardiogénique se développant dans les 4𠄶 heures suivant la transfusion de FFP. Cette complication peut être évitée en utilisant du plasma de donneurs masculins n'ayant jamais été transfusés et de donneuses nullipares n'ayant jamais été transfusées, ou en utilisant le S/D FFP.

- Réactions fébriles 3 , 4 , 42 – 51 , 56 – 58 , 71 – 73 : elles surviennent chez moins de 1% des patients transfusés avec FFP et jusqu'à 10% des patients subissant un échange plasmatique.

- Toxicité du citrate 3 , 4 , 42 – 51 , 56 – 58 , 71 – 73 : elle peut survenir après la transfusion rapide de grands volumes de plasma et est particulièrement importante chez les nouveau-nés et chez les patients atteints d'une maladie du foie.

- Transmission des infections 3 , 4 , 42 – 51 , 56 – 58 , 71 – 73 : le processus de congélation inactive les bactéries contamination et croissance bactérienne, avec libération d'endotoxines, avant congélation est extrêmement improbable. Il existe cependant toujours un risque, bien que minime, de transmission d'infections virales ou d'infections dues à d'autres agents pathogènes inconnus ou non testés.

- Maladie du greffon contre l'hôte (GvHD) 4 : aucun cas de GvHD associé à la FFP n'a jamais été rapporté. La congélation provoque la lyse des lymphocytes, l'irradiation du plasma n'est donc pas nécessaire.

- Surcharge circulatoire 3 , 4 , 42 – 51 , 56 – 58 , 71 – 73 : elle peut survenir notamment chez les patients présentant une insuffisance rénale ou cardiorespiratoire.

- Inhibiteurs contre les protéines déficientes 86 : ceux-ci peuvent se développer après la transfusion de plasma chez les patients présentant des déficits sévères en facteurs de coagulation.

Les références


INTRODUCTION

Au cours de la mitose, les microtubules fusiformes sondent l'espace tridimensionnel de la cellule dans un processus de « recherche et capture » ​​qui est important pour l'interaction efficace des microtubules et des extrémités avec le cortex cellulaire et les kinétochores (examiné dans Kline-Smith et Walczak, 2004) . On pense qu'une augmentation de la dynamique des microtubules au début de la mitose facilite l'orientation et l'alignement opportuns des chromosomes en métaphase. Un autre changement dans la dynamique des microtubules a également été proposé pour contribuer aux forces qui séparent les chromosomes et allongent le fuseau mitotique en anaphase (examiné dans Scholey et al., 2003). L'inhibition de la dynamique des microtubules par des mutations dans les protéines qui s'associent aux extrémités plus des microtubules ou par l'ajout de médicaments entraîne des défaillances de l'alignement et de la ségrégation des chromosomes (Berlin et al., 1990 Dujardin et al., 1998 Gruss et al., 2002 Maiato et al., 2002 Rogers et al., 2002 Andrews et al., 2004 Cassimeris et Morabito, 2004 Kline-Smith et Walczak, 2004 Vaughan, 2004). Ainsi, réguler correctement les propriétés dynamiques des microtubules est essentiel pour assurer la ségrégation précise des chromosomes en mitose.

Bien que les changements dans la dynamique des microtubules au cours de la mitose soient bien documentés, les mécanismes qui contrôlent le comportement des microtubules sont moins clairs. Un certain nombre de protéines associées aux microtubules ainsi que des facteurs solubles émanant des chromosomes ont été impliqués dans la régulation de la dynamique des microtubules, suggérant qu'un réseau complexe de protéines contrôle les microtubules pendant la mitose. Les extrémités positives des microtubules sont un site de liaison important pour les protéines qui régulent les microtubules. Il a été démontré que la famille de protéines dite +TIPs régule la dynamique des microtubules dans un certain nombre de systèmes et comprend EB1, CLIP-170, CLASP, la dynéine, LIS1, la sous-unité de dynactine p150 collée et la polypose adénomateuse (APC examiné dans Karsenti et Vernos, 2001 Kline-Smith et Walczak, 2004 Vaughan, 2004). En plus de partager une localisation commune aux extrémités plus des microtubules, ces protéines modulent généralement les transitions entre la croissance et le rétrécissement des microtubules. L'un des +TIP les mieux caractérisés est EB1, dont la fonction de facteur « anti-pause » est bien conservée. L'inhibition d'EB1 dans un certain nombre de systèmes entraîne des microtubules non dynamiques qui passent la majorité du temps dans un état de pause (Tirnauer et al.,1999, 2002b Rogers et al., 2002). Expériences d'immunodéplétion EB1 dans Xénope extraits entraîne une réduction spectaculaire de la longueur des microtubules. De même, l'épuisement de l'ARNi d'EB1 dans Drosophile embryons entraîne une stabilité des microtubules réduite et des fuseaux mitotiques perturbés (Rogers et al., 2002 Tirnauer et al., 2002b). En revanche, il a été rapporté que d'autres protéines +TIP, y compris LIS1, suppriment la dynamique des microtubules in vitro en réduisant les catastrophes. et al., 2000 Coquelle et al., 2002 Taï et al., 2002). Ainsi, il est probable qu'un équilibre des activités aux extrémités des microtubules plus optimise le processus de recherche et de capture, garantissant que les extrémités des microtubules plus trouvent efficacement leurs sites de fixation.

L'APC peut interagir directement avec les microtubules via sa région basique ou peut interagir indirectement avec les microtubules via son association avec la protéine associée à la kinésine II, KAP3a, ou avec le +TIP, EB1 (Nathke et al., 1996 Mimori-Kiyosue et al.,2000a, 2000b Mogensen et al., 2002 Etienne-Manneville et Hall, 2003 Wen et al., 2004). Par des études de liaison à double hybride et in vitro sur levure, il a été démontré que EB1 interagit avec l'extrémité carboxy de l'APC, tandis que KAP3a interagit avec le domaine amino terminal armadillo dans l'APC (Su et al., 1995 Jimbo et al., 2002). La liaison de l'extrémité carboxy d'APC à EB1 améliore la capacité d'EB1 à se lier le long des microtubules polymérisés in vitro, faisant valoir que l'APC peut fonctionner pour « charger » EB1 sur les extrémités des microtubules plus (Nakamura et al., 2001). Le lien physiologique potentiel entre APC et EB1 est soutenu par des travaux récents montrant que l'interaction entre ces deux protéines est importante pour la formation de microtubules stables dans les fibroblastes en migration (Wen et al., 2004). Ces découvertes soulèvent la possibilité que l'APC puisse réguler l'activité des +TIPs, comme EB1, en réponse aux signaux associés à des événements cellulaires polarisés.

Il est intéressant de noter que l'APC a également été impliquée dans le bon fonctionnement du fuseau mitotique. L'APC se localise aux extrémités plus des kinétochores-microtubules pendant la mitose, suggérant qu'elle peut également influencer la stabilité ou l'attachement des microtubules dans ce contexte. Conformément à cette hypothèse, les cellules ES dépourvues d'APC de type sauvage et les cellules exprimant des formes mutantes d'APC sont sensibles aux erreurs de ségrégation chromosomique (Fodde et al., 2001 Kaplan et al., 2001 Green et Kaplan, 2003 Dikovskaya et al., 2004 Louis et al., 2004). Des travaux récents démontrent que les erreurs de ségrégation des chromosomes et de positionnement du fuseau peuvent être dues à des défauts d'attachement des microtubules et des extrémités dans les cellules exprimant des formes mutantes de l'APC (Green et Kaplan, 2003 Tighe et al., 2004).Il est possible que les mutants APC affectent la capacité des microtubules à localiser leur site de liaison, en perturbant la dynamique des microtubules, ou encore en affectant l'intégrité du site de liaison. EB1 et APC ont également été impliqués dans le positionnement du fuseau chez les eucaryotes supérieurs (Lu et al., 2001 McCartney et al., 2001 Yamashita et al., 2003). Ainsi, il est raisonnable de supposer que EB1 et APC peuvent coopérer aux extrémités des microtubules et des microtubules pour réguler la dynamique des microtubules pendant la mitose.

Auparavant, nous avons montré qu'une forme tronquée d'APC (APC 1-1450), similaire à la protéine exprimée dans de nombreux cancers colorectaux, compromet de manière dominante les attaches des microtubules et des extrémités pendant la mitose, entraînant une perturbation du fuseau mitotique et des erreurs dans la ségrégation des chromosomes. Dans cet article, nous étudions la base moléculaire sous-jacente à ce phénotype dominant. Nous constatons que l'inhibition de EB1 ou APC provoque des défauts remarquablement similaires à ceux observés dans les cellules exprimant APC 1-1450. L'inhibition à la fois d'EB1 et d'APC n'a pas d'effet additif, faisant valoir que ces protéines fonctionnent ensemble pour réguler les fuseaux mitotiques. Nous constatons que l'inhibition de l'APC ou de l'EB1 provoque des défauts d'alignement des chromosomes mais pas d'arrêt mitotique en revanche, l'inhibition d'autres +TIPS entraîne à la fois des défauts d'alignement des chromosomes et un arrêt mitotique robuste. Conformément à une relation fonctionnelle entre l'APC et l'EB1, nous constatons que l'APC 1-1450 forme un hétéro-oligomère avec l'APC endogène et que la formation de ce complexe exclut l'association d'EB1 avec l'APC. L'imagerie en direct des comètes EB1-GFP révèle une augmentation significative de la fréquence des pauses dans les cellules exprimant APC 1-1450. Ensemble, ces résultats fournissent des preuves convaincantes que l'APC régule le fuseau mitotique via EB1.


Introduction

La diversité et la complexité des protéomes cellulaires ont conduit au développement d'une large gamme de protocoles pour améliorer les analyses par spectrométrie de masse (MS). Dans les expériences ascendantes traditionnelles, ces méthodes sont optimisées pour améliorer la profondeur de la couverture du protéome grâce à la génération de conditions favorables à la digestion protéolytique et à la récupération des échantillons (León et al, 2013 Tança et al, 2013 ) et ont conduit à la cartographie des protéomes presque complets de diverses lignées cellulaires de mammifères (Beck et al, 2011 Moghaddas Gholami et al, 2013 Branca et al, 2014 ). Cependant, les performances dans les expériences protéomiques chutent fortement lorsque les quantités de protéines sont limitées, en raison des inefficacités liées au traitement des échantillons et à la sensibilité de l'instrument. Bien que les innovations récentes dans l'instrumentation de spectrométrie de masse aient accéléré la vitesse et la sensibilité de l'analyse du protéome (Hebert et al, 2014 ), d'autres améliorations peuvent être obtenues en mettant l'accent sur l'optimisation, la simplification et la miniaturisation de la préparation des échantillons.

Pour améliorer le traitement des échantillons, des agents qui aident à la rupture et à la solubilisation des cellules, tels que les détergents et les chaotropes, sont souvent utilisés. De manière problématique, la majorité de ces additifs sont incompatibles avec la protéolyse et l'analyse MS et nécessitent donc une élimination par ultrafiltration (Wisniewski et al, 2009 ) et à base de billes (Bereman et al, 2011 Hengel et al, 2012 ) ou des approches de précipitation, chacune augmentant la manipulation et la perte subséquente de matière. Alors que la protéomique basée sur la MS se dirige vers l'analyse d'échantillons rares et limités en quantité, des flux de travail ultrasensibles qui éliminent ces pertes sont essentiels (Altelaar & Heck, 2012). Cela a conduit au développement de méthodologies qui minimisent la manipulation et favorisent une récupération élevée des échantillons (Ethier & Hou, 2006 Umar et al, 2007 errances et al, 2009 Wang et al, 2010 Di Palma et al, 2011 Wisniewski et al, 2011a Soleil et al, 2013 Erde et al, 2014 Koulak et al, 2014 Zougman et al, 2014 ). Cependant, ces protocoles ont une flexibilité limitée en raison de plusieurs lacunes, y compris les incompatibilités des réactifs (détergents, chaotropes, sels), l'utilisation requise d'alternatives aux détergents (par exemple, les amphipols), les restrictions liées au volume d'échantillon absolu, au débit et à une manipulation excessive. Par la suite, ces flux de travail ont généralement été limités au traitement de quantités de matière absolues > 1 g ou à une couverture réduite du protéome (

2 000 protéines totales) lors de l'examen de quantités de protéines inférieures au microgramme. Ces inconvénients ont largement empêché l'utilisation de la protéomique dans des applications où une reproductibilité, une sensibilité et un débit élevés sont nécessaires, comme dans les études cliniques ou le criblage de population.

L'expansion rapide du séquençage de nouvelle génération a incité le développement de méthodes se prêtant à la préparation de bibliothèques de génomes à haut débit qui sont grandement facilitées par l'application de billes paramagnétiques dans des plateformes manuelles et robotisées (DeAngelis et al, 1995 Wilkening et al, 2013 ). Cependant, l'utilisation des billes paramagnétiques n'est pas courante en protéomique générale, bien qu'elles aient été utilisées dans des applications spécialisées pour le couplage covalent ou la purification par affinité de protéines, la protéolyse immobilisée (Fan et al, 2014 ), et pour l'enrichissement de peptides modifiés post-traductionnellement (Yeh et al, 2012 Zeng et al, 2012 ). Des technologies récentes basées sur des particules de nanodiamants ont illustré l'épuisement des substances contaminantes et l'amélioration de la protéomique spécifique au compartiment (Chen et al, 2006 Pham et al, 2013 ). S'appuyant sur les développements technologiques mis au point par l'immobilisation réversible en phase solide (SPRI) (DeAngelis et al, 1995 ) et les technologies des nanodiamants (Chen et al, 2006 ), et dans le but d'améliorer et de simplifier le traitement des échantillons de protéomique générique, nous avons développé SP3. SP3 est un nouveau flux de travail protéomique à tube unique qui fournit une liaison efficace et impartiale des protéines et des peptides, permettant l'achèvement rapide et efficace des flux de travail protéomique courants à haut débit.

Dans cette étude, SP3 est appliqué à une variété d'applications protéomiques conventionnelles et ultrasensibles. Sur la base de l'observation que SP3 a fourni une plate-forme améliorée pour gérer des quantités inférieures au microgramme de matériel déterminé à partir de cellules HeLa profilant le protéome en profondeur, nous avons appliqué SP3 pour examiner le développement embryonnaire en utilisant Drosophile embryons. Bien qu'il existe une mine de données sur l'expression des gènes pour Drosophile, sa dynamique protéomique au cours du développement a fait l'objet de relativement peu d'études (Carmena, 2009 ). Avec une approche basée sur SP3, le protéome est ici profilé à une profondeur de > 6 000 protéines, des 18 000 protéines prédites dans le Drosophile génome, à partir d'embryons regroupés à 2 à 4 h (stades 5 à 7) et 10 à 12 h (stades 13 à 15) de développement. Cette analyse a été étendue pour capturer la dynamique dans un écran ultrasensible à une résolution d'un seul embryon. Ces données représentent le plus grand catalogue de la Drosophile protéome de l'embryon à ce jour, tout en offrant une sensibilité inégalée pour les comparaisons quantitatives qui ont le potentiel de révéler une nouvelle variance interindividuelle du protéome. En outre, l'utilisation de SP3 dans ces études illustre ses avantages potentiels dans d'autres domaines de la biologie du développement et de la biologie clinique où une analyse quantitative approfondie et reproductible est nécessaire pour expliquer la variation interindividuelle avec des quantités d'échantillons rares.


Excitabilité des muscles squelettiques

Nicolas Sperelakis , . Hugo Gonzalez-Serratos , dans Cell Physiology Source Book (quatrième édition) , 2012

XIII Conduite du Potentiel d'Action

Lorsque l'EPP, généré à la jonction neuromusculaire, atteint le seuil de déclenchement d'un PA dans la fibre musculaire squelettique des vertébrés, un PA se propage le long de la fibre musculaire dans les deux sens à partir de la plaque d'extrémité. (Dans certaines fibres musculaires, il y a une seconde plaque d'extrémité innervée par un motoneurone sortant de la moelle épinière à un autre niveau.) L'AP dépasse (à environ +40 mV) et se propage à une vitesse constante d'environ 5 m/s sur le sarcolemme superficiel. La propagation se fait au moyen de la courants de circuit local qui accompagnent l'impulsion, comme discuté au chapitre 19 . Le lecteur est prié de se reporter à ce chapitre pour plus de détails sur les courants radiaux (transmembranaires) et le courants longitudinaux (axiaux). Les courants longitudinaux externes peuvent utiliser tout l'espace ISF (puisque le courant emprunte le chemin de moindre résistance), permettant à l'électromyogramme (EMG) d'être enregistré à partir de la peau recouvrant un muscle squelettique activé. L'amplitude des potentiels EMG augmente lorsque davantage de fibres musculaires sont activées (sommation des fibres), en raison de la sommation des chutes de tension IR produites par chaque fibre activée simultanément. La fréquence des potentiels EMG reflète la fréquence et l'asynchronie d'activation du muscle.

Les fibres musculaires squelettiques sont formées par cellules myoblastiques qui ont fusionné bout à bout pour devenir de longs myotubes multinucléés puis des fibres cylindriques plus tard dans le développement. Ils se comportent comme des câbles semi-infinis. C'est-à-dire qu'un point d'accès peut se propager d'une extrémité de la fibre à l'autre, de manière uniforme et sans entrave. La constante d'espace ou constante de longueur (λ) du câble de fibre est d'environ 1,5 mm pour les fibres de grenouille sartorius ( Sperelakis et al., 1967 ) et d'environ 0,76 mm pour le muscle EDL de rat ( Sellin et Sperelakis, 1978 ). La constante de longueur est la distance sur laquelle une tension appliquée à une région décroîtrait à 1/e (1/2, 717 = 0,368) ou 36,8 % de la valeur initiale. Autrement dit, dans un câble passif, la tension décroît de façon exponentielle avec une certaine constante de longueur donnée par :

VX est la tension à la distance X et Vo est la tension à l'origine (X = 0). est donné par :

En admettant que ro (la résistance longitudinale extérieure) est négligeable par rapport à rje (ce serait vrai pour une fibre superficielle dans un faisceau immergé dans un grand bain) :

rm (Ω·cm) et rje (Ω/cm) sont la résistance membranaire et la résistance longitudinale interne normalisées pour une unité de longueur de fibre, Rm (Ω·cm 2 ) est la résistance de membrane normalisée pour le rayon et la longueur de la fibre, Rje (Ω·cm) est la résistivité du myoplasme (normalisée pour la longueur et la section transversale), et une (cm) est le rayon de la fibre. Rm est souvent appelée résistivité membranaire, mais ce n'est pas exact car pour la vraie résistivité membranaire (ρm) il doit y avoir une correction pour l'épaisseur de la membrane δ :

Les facteurs qui déterminent la vitesse active de propagation (θ??) comprennent l'intensité du courant du circuit local, le potentiel de seuil et les propriétés du câble passif, et τm. Comme discuté précédemment, plus le taux de montée de l'AP est élevé, plus l'intensité du courant du circuit local est grande, donc plus le est grand??. En plus de sa dépendance à la densité des canaux Na + rapides (déterminant de la conductance Na + maximale, g ¯ Na ), des propriétés cinétiques du gating du canal et du potentiel de seuil (Ve), max dV/dt est également déterminé par le PR (ou potentiel de décollage) (lié au h contre Em courbe), comme discuté précédemment ( Fig. 42.9 ). De plus, comme le refroidissement diminue l'activation du canal Na (Q103), max dV/dt et?? sont ralentis en conséquence. Rm est augmenté par le refroidissement, le Q10 pour RK dans les fibres de grenouille sartorius étant d'environ 2,8 (la diffusion des ions en solution libre a un Q10 d'environ 1,2) ( Sperelakis, 1969 ). Pour une description de la conduction passive, voir l'annexe III de ce chapitre.

FIGURE 42.9 . Représentation graphique de la vitesse maximale de montée de l'API (max dV/dt) en fonction du repos Em ou potentiel de décollage. Max dv/dt est une mesure de l'intensité du courant entrant (la capacité membranaire étant constante), qui dépend du nombre de canaux disponibles pour l'activation h est le facteur d'inactivation de Hodgkin-Huxley comme gN / A = g ¯ Na m 3 h , où gN / A est la conductance Na +, g ¯ Na est la conductance maximale et m et h sont des variables h représente h à t = ∞ ou régime permanent (pratiquement, après 20 ms). Les canaux Na + rapides commencent à s'inactiver à environ -75 mV et l'inactivation presque complète se produit à environ -30 mV (h meugler). Par conséquent, max dV/dt diminue parce que h diminue.


3. RÉSULTATS

3.1 L'expression de haut niveau de TIR1 provoque un appauvrissement indépendant de l'auxine de la protéine cible

Tout d'abord, nous avons comparé les souches PADH1-701-TIR1 et PADH1-409-TIR1 qui expriment constitutivement TIR1 à des niveaux élevés ou faibles, respectivement (Figure 1a,b). À cette fin, nous avons marqué en C-terminal le facteur d'épissage Prp22 avec une fusion entre un degron tronqué dépendant de l'auxine, nommé AID* (Morawska & Ulrich, 2013) et six répétitions en tandem de l'épitope FLAG, dans les souches PADH1-701-TIR1 et PADH1–409-TIR1. Pour mesurer le taux d'épuisement des protéines cibles, nous avons ajouté de l'auxine (acide indole-3-acétique) aux cultures (temps 0) et des échantillons ont été prélevés après 5, 15 et 30 min et congelés.

La quantification des protéines dans les échantillons (Figure 1b,c) montre qu'au temps 0 (pas d'auxine), les niveaux de Prp22 étaient 47 % plus faibles dans PADH1-701-TIR1 que dans PADH1-409-TIR1. Comme PADH1-701-TIR1 exprime constitutivement TIR1 à un niveau plus élevé, cela peut indiquer qu'une trop grande quantité de TIR1 peut provoquer une déplétion incontrôlée de la protéine cible. De plus, le taux de déplétion en Prp22 était plus élevé dans PADH1–701-TIR1 que dans PADH1–409-TIR1. 30 minutes après l'ajout d'auxine, les niveaux de Prp22 étaient tombés en dessous de 6 % des valeurs initiales dans PADH1-701-TIR1, contre 35 % restant dans PADH1-409-TIR1, suggérant que des niveaux élevés de TIR1 favorisent un épuisement plus rapide.

Nous avons donc créé une souche inductible-TIR1 en plaçant le OsTIR1 gène sous contrôle du promoteur Z4EV (Z4EVpr). Cela a été fait en remplaçant les éléments non essentiels APE2 dans la souche YMN3 exprimant le Z4EV (McIsaac et al., 2013 ) avec un Z4EVpr-OsTIR1-Cassette V5 (Figure 1a). Pour favoriser la localisation de la protéine TIR1 dans le noyau, où se trouvent nos cibles protéiques, nous avons fusionné un signal de localisation nucléaire (NLS) SV40 au TIR1-séquence codante. La souche résultante, PZ4EV-NTIR1, produit la protéine TIR1-V5 rapidement après l'ajout de β-estradiol au milieu de culture (figure 1b), et l'auxine a été ajoutée après pré-induction de TIR1 pendant 30 min. Dans ces conditions, Prp22 a été épuisé rapidement après l'ajout d'auxine, sans épuisement indépendant de l'auxine détectable (figure 1b, c).

Ensuite, pour tester l'hypothèse selon laquelle les niveaux de TIR1 sont inversement corrélés avec les niveaux de la protéine cible en l'absence d'auxine, une culture de PZ4EV-NTIR1 avec AID*-6FLAG-tagged PRP22 a été incubé avec du β-estradiol mais sans auxine, et les niveaux de Prp22 ont été mesurés au cours du temps. Conformément à notre observation précédente, à 50 min d'incubation de β-estradiol, le niveau de Prp22 avait chuté de manière significative et avait atteint 35% de la valeur initiale à 2 heures d'incubation, moment auquel la protéine TIR1-V5 était bien induite (Figure 2 ). L'épuisement indépendant de l'auxine de Yhc1 et Rrp44 est montré dans la figure S2 et était moins prononcé avec le Rrp44 plus abondant. Nous concluons que des niveaux élevés de TIR1 peuvent provoquer un appauvrissement indépendant de l'auxine de la protéine cible chez la levure en herbe.

3.2 Le taux de déplétion peut être ajusté en modulant la durée de la préincubation du β-estradiol

Ensuite, nous avons étudié comment le taux d'épuisement induit par l'auxine est influencé par la durée de la préincubation du β-estradiol. Sur la base des résultats précédents, nous avons anticipé que non seulement des temps de préincubation plus longs conduiraient à une déplétion plus rapide, mais également une déplétion plus indépendante de l'auxine et qu'il pourrait y avoir un temps de préincubation optimal, qui est susceptible d'être spécifique à la cible. Pour tester cela, nous avons utilisé comme cibles d'épuisement, Prp22 (232 copies/cellule), Prp2, un autre facteur d'épissage essentiel avec une abondance similaire (211 copies/cellule) et l'enzyme de décapsulation la plus fortement exprimée, Dcp1 (4 189 copies/cellule Kulak , Pichler, Paron, Nagaraj et Mann, 2014). Nous avons effectué une analyse d'épuisement au cours du temps dans laquelle les cultures de ces souches marquées AID* ont été préincubées avec du β-estradiol pendant différentes durées (20, 30, 40 ou 60 min) avant l'ajout d'auxine. Des échantillons ont ensuite été prélevés pour l'analyse des protéines à des intervalles de 5 minutes. Comme les niveaux de TIR1 augmentent avec le temps d'incubation du β-estradiol, cela nous a permis de mesurer la relation entre l'abondance de TIR1 et le taux d'épuisement dépendant de l'auxine de différentes protéines cibles.

L'analyse de quantification des protéines (figure 3) montre que différentes protéines cibles ont été épuisées à des vitesses différentes. Une préincubation de 20 minutes avec du -estradiol était suffisante pour réduire Prp22 et Prp2 à de faibles niveaux (≤ 20 %) dans les 15 minutes suivant l'ajout d'auxine, mais des préincubations plus longues avec du β-estradiol ont entraîné une dégradation indépendante de l'auxine. En revanche, le Dcp1 plus abondant nécessitait 60 minutes de préincubation de l'-estradiol pour obtenir un épuisement tout aussi rapide et efficace, car plus de protéines Dcp1 doivent être dégradées pour obtenir un épuisement efficace en termes de pourcentage de la quantité de départ, et cela nécessite évidemment plus Protéine TIR1. Notamment, avec les trois protéines cibles, il y avait une corrélation directe entre la durée de préincubation du -estradiol et le taux d'épuisement, de sorte que la durée du traitement au β-estradiol devrait être optimisée pour chaque protéine cible (voir également la figure S2).

3.3 -est AID codé par le plasmide et effet de la localisation de la protéine TIR1 sur l'efficacité de la déplétion ciblée

Pour faciliter l'insertion des composants β-est AID dans la levure en herbe, nous avons construit un plasmide centromérique, pZTRL, qui contient P ACTE 1 -Z4EV et Z4EVp-OTIR1 (sans NLS) cassettes d'expression (Figure 4a). Nous avons ensuite testé pZTRL et, en même temps, étudié l'effet de la fusion d'un NLS à TIR1 sur l'efficacité d'épuisement d'une protéine nucléaire. À cette fin, nous avons mesuré les niveaux de protéines cibles TIR1 et Prp22 dans la souche porteuse de pZTRL, et dans deux souches qui contiennent des TIR1, avec (PZ4EV-NTIR1) ou sans (PZ4EV-TIR1) NLS sur le N-terminal de TIR1 (Figure 4b,c).

Nous avons observé que le niveau de protéine TIR1 induit par le β-estradiol était environ trois fois plus élevé dans le système génomique. TIR1 (PZ4EV-TIR1) par rapport à la souche génomique NLS-TIR1 (PZ4EV-NTIR1) ou encodé par un plasmide TIR1 souches, indiquant que TIR1 est mieux exprimé lorsqu'il est génomiquement intégré et n'a pas de NLS.Fait intéressant, Prp22, qui est une protéine localisée dans le noyau, a été rapidement épuisée indépendamment de la présence ou de l'absence du NLS dans l'extrémité N-terminale de la protéine TIR1. Cela suggère que, pour l'épuisement des protéines nucléaires, un SV40 NLS n'a pas besoin d'être ajouté à TIR1. Notamment, l'épuisement ciblé était plus lent dans la souche TIR1 codée par le plasmide par rapport aux deux autres souches, atteignant 15 % contre 2 % des valeurs initiales de Prp22 30 min après l'ajout d'auxine, probablement en raison d'une expression plus faible de TIR1 dans cette souche.


Le lancer de pièces peut-il remplacer les expérimentations animales ?

Au lieu de répéter une expérience dans un modèle murin de maladie dans leur laboratoire, des chercheurs de Berlin, en Allemagne, ont utilisé un tirage au sort pour confirmer si un médicament protégeait le cerveau contre un accident vasculaire cérébral, comme indiqué dans leur article publié le 9 avril dans le journal en libre accès. PLOS Biologie.

Avec cette expérience provocatrice et apparemment absurde, Sophie Piper et ses collègues du Berlin Institute of Health (BIH) et de la Charité -Universitätsmedizin Berlin exposent de manière drastique un problème qui affecte potentiellement de nombreuses études en biomédecine expérimentale. De petites tailles d'échantillon, souvent inférieures à 10, et des seuils presque universellement lâches pour accepter la signification statistique (5 %) conduisent à un taux élevé de résultats faussement positifs et à une surestimation des effets réels. Leur étude alerte les chercheurs que, contrairement aux attentes communes, la réplication d'une étude - dans des contextes communs à de nombreux laboratoires dans le monde - peut ne pas ajouter plus de preuves à ce qui pourrait être gagné en tirant à pile ou face.

De nombreux domaines de recherche sont aux prises avec ce que l'on a appelé « la crise de la réplication ». Très souvent, les résultats d'un laboratoire ne peuvent pas être reproduits par les chercheurs d'un autre laboratoire, avec des taux de réplication réussis tombant souvent en dessous de 50 %. Cela a ébranlé la confiance dans la robustesse de l'entreprise scientifique en général et stimulé la recherche de causes sous-jacentes. À cette fin, de nombreux chercheurs ont commencé à répéter des expériences au sein de leurs laboratoires dans le cadre d'une science solide et de bonnes pratiques scientifiques. Pourtant, dans leur article, Piper et ses collègues examinent l'utilité de répliquer des expériences au sein de laboratoires et envoient un surprenant message de prudence concernant les pratiques de réplication actuelles. Ils fournissent des informations théoriques et pratiques détaillées sur la manière de mener et de rapporter correctement des études de réplication pour aider les scientifiques à économiser des ressources et à éviter une utilisation futile des animaux, tout en augmentant la robustesse et la reproductibilité de leurs résultats.

« La réplication est fondamentale pour le processus scientifique. Nous pouvons tirer des leçons des réplications réussies et des réplications échouées, mais seulement si nous les concevons, les exécutons et les rapportons correctement », ont déclaré les auteurs.


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Résumé

Objectif- Des études antérieures suggèrent que la protéine de choc thermique (HSP) 60 a un rôle contributif dans le développement de l'athérosclérose. Nous avons examiné si la protéine HSP70 circulante et les anticorps anti-HSP70 sont associés à la maladie coronarienne (CAD).

Méthodes et résultats— Des échantillons de sang de 421 patients (62 % d'hommes, âge moyen 57 ans) évalués pour la coronarographie par coronarographie ont été testés. Le sérum HSP70 était détectable chez 67 % des sujets de l'étude avec des taux allant de 0,2 à 27,1 ng/mL (moyenne, 1,08 médiane, 0,5). Les taux de HSP70 étaient plus élevés chez les patients non coronariens que chez les patients coronariens (médiane : 0,72 contre 0,34 P= 0,0006). Les individus avec des niveaux de HSP70 supérieurs à la médiane (0,5 ng/mL) présentaient la moitié du risque de coronaropathie que les individus avec des niveaux inférieurs à la médiane (rapport de cotes ajusté, 0,52 limite de confiance à 95 %, 0,32 à 0,86). L'association de niveaux élevés de HSP70 avec un faible risque de coronaropathie était indépendante des facteurs de risque traditionnels de coronaropathie (P=0,011). La gravité de la maladie (nombre de vaisseaux malades) était également inversement associée aux taux de protéine HSP70 (P=0,010). L'odds ratio ajusté d'avoir une maladie multivasculaire pour les patients présentant des niveaux élevés de protéine HSP70 était de 0,54 (limite de confiance à 95 %, 0,36 à 0,81). En revanche, aucune association entre la séropositivité des IgG anti-HSP70 et la prévalence de la coronaropathie n'a été trouvée (P=0.916).

Conclusion— Ces données fournissent la première preuve que des niveaux élevés de HSP70 humaine sont associés au faible risque de coronaropathie, probablement en raison de ses multiples effets protecteurs sur la réponse d'une cellule au stress.

Les protéines de choc thermique (HSP) constituent une grande famille de protéines qui aident à la réponse d'une cellule au stress aigu. L'importance de ces protéines est évidente par le fait qu'elles sont omniprésentes et hautement conservées à travers les espèces. Bien que les HSP soient principalement des molécules intracellulaires, lorsqu'elles sont surexprimées en réponse au stress, elles peuvent être transportées et résider dans la membrane cellulaire, où elles peuvent être reconnues par le système de surveillance immunitaire et fonctionner comme des auto-antigènes. Ils peuvent également être libérés des cellules dans le sang et avoir une activité biologique. 1,2 Ainsi, lorsqu'elles sont surexprimées, les HSP peuvent évoquer des réponses autres que celles associées à leur localisation intracellulaire, et ces réponses peuvent avoir le potentiel d'avoir des conséquences délétères. Par exemple, les taux sériques de HSP60 étaient significativement élevés chez les sujets présentant une prévalence/incident d'athérosclérose carotidienne ainsi que chez les patients présentant une hypertension limite. 3,4 Il a été rapporté que les anticorps anti-HSP60 sont associés à la fois à la présence et à la gravité d'une maladie coronarienne (CAD) cliniquement significative. 5

Des preuves expérimentales suggèrent un rôle cardioprotecteur d'un autre membre de cette famille, HSP70, dans plusieurs exemples de stress myocardique aigu. 6-8 Par exemple, les cœurs de souris transgéniques surexprimant HSP70 présentent une résistance accrue aux lésions ischémiques. 8 Étant donné que des anticorps anti-HSP70 ont été détectés, comme ils l'ont été pour HSP60, cela soulève la possibilité que HSP70 puisse déclencher des réponses auto-immunes qui pourraient atténuer les effets cellulaires bénéfiques intrinsèques ou, comme la réponse à HSP60, même exacerber le développement de l'athérosclérose. Cependant, des données expérimentales ou cliniques limitées concernant les effets de HSP70 sur l'athérogenèse sont disponibles.

Le but de la présente enquête était de déterminer si des associations existent entre l'expression de HSP70 et l'athérogenèse. Plus précisément, nous avons déterminé si la protéine HSP70 circulante et les anticorps anti-HSP70 sont associés à la CAD.

Méthodes

Sujets

Quatre cent vingt et une personnes, en vertu d'un protocole approuvé par le National Institutes of Health Institutional Review Board, ont participé à l'étude. La cohorte de l'étude était composée de personnes souffrant de douleurs thoraciques ou avec des tests non invasifs compatibles avec une ischémie myocardique qui ont été référés pour une coronarographie. Tous les participants ont subi un examen clinique et une évaluation de l'exposition actuelle et passée aux facteurs de risque traditionnels de coronaropathie, comme décrit précédemment. 5 Un patient était défini comme ayant une coronaropathie s'il y avait des signes angiographiques d'athérosclérose (≥50 % de sténose d'au moins une artère coronaire principale par angiographie coronaire). Les patients présentant une cardiopathie valvulaire significative ou une cardiomyopathie non athéroscléreuse ont été exclus. Aucun patient admis dans l'étude n'a eu d'infarctus du myocarde au cours des 3 derniers mois.

Sérum Protéine HSP70 et Anticorps Anti-HSP70

Des échantillons de sérum ont été obtenus des sujets de l'étude avant le moment de l'angiographie coronaire. Les échantillons ont été congelés à -80°C et les aliquotes ont été décongelées uniquement lors de la réalisation de tests spécifiques. Les taux sériques de protéine HSP70 ont été déterminés à l'aide de kits ELISA disponibles dans le commerce (StressGen Biotechnologies Corp). Les concentrations de protéine HSP70 ont été déterminées par comparaison avec une courbe standard selon les instructions du fabricant. La courbe standard a une plage de 0,78 à 50 ng/mL, et la sensibilité du dosage est de 0,2 ng/mL.

Les anticorps IgG dirigés contre la HSP70 humaine ont été déterminés par ELISA. Des plaques de microtitrage à quatre-vingt-seize puits ont été recouvertes de 5 g/mL de HSP70 recombinante (StressGen Biotechnologies Corp) dans 100 L de tampon carb/Bicarb (pH 9,6) par puits à 4°C pendant une nuit. Après lavage avec du tampon de lavage (Wampole) et blocage avec 3% de BSA dans du PBS à température ambiante pendant 3 heures, les plaques ont été incubées avec 100 L d'échantillons de sérum dilués dans Serum Diluent (Wampole) à 1 pour 50 à température ambiante pendant 1 heure. Après un lavage supplémentaire, les plaques ont été incubées avec des IgG anti-humaines de chèvre conjuguées à la peroxydase de raifort et diluées à 1 pour 10 000 avec du PBS. Après lavage, 100 pi de solution de chromogène/substrat contenant de la tétraméthylbenzidine (Wampole) ont été ajoutés aux puits. L'absorbance à 450 nm a été mesurée 10 minutes après l'ajout de la solution d'arrêt (Wampole). Après correction de l'absorbance de fond, un échantillon de sérum a été considéré comme positif pour les anticorps dirigés contre la HSP70 humaine si la densité optique dépassait une valeur seuil définie prospectivement de 0,60. Cette valeur seuil est calculée à partir des valeurs d'absorbance de contrôle négative et positive.

Taux de protéines sériques réactives C

La protéine C-réactive sérique (CRP) a été mesurée par la technologie de dosage immunologique par polarisation de fluorescence (FPIA) (analyseur TDxFLEx, Laboratoire Abbott). En utilisant ce test, 95 % des individus sains (n ​​= 202) avaient un niveau de CRP 0,5 mg/dL et 98 % avaient des niveaux ≤ 1,0 mg/dL, respectivement, dans leur sérum. Le coefficient de variation inter-séries de ce test (n=31) était de 4,3 % et 2,2 % à des niveaux moyens de 1,10 et 2,94 mg/dL, respectivement.

Analyses statistiques

Les données distribuées normalement sont présentées comme la moyenne et l'écart type (SD), tandis que les données distribuées de manière non normale sont présentées comme la médiane et l'intervalle interquartile (IQR). Les comparaisons entre les points finaux ont été faites en utilisant t tester les distributions paramétriques et le Mann-Whitney U tester les distributions non paramétriques. Les données catégorielles ont été analysées par le test du 2 ou le test exact de Fisher pour les petits échantillons. Tous les tests étaient bilatéraux. Les variables dichotomiques indiquant la présence et la gravité de la coronaropathie ont été modélisées en fonction d'autres facteurs à l'aide d'une régression logistique multiple. L'odds ratio (OR) a été utilisé comme mesure de la présence et de la gravité de la coronaropathie chez les patients présentant un facteur de risque donné par rapport à ceux sans ce facteur ou comme facteur multiplicatif pour chaque augmentation unitaire de l'âge ou des niveaux de HSP70. Les covariables considérées étaient l'âge, le sexe masculin, le tabagisme, le diabète, l'hypercholestérolémie, l'hypertension (facteurs de risque traditionnels de coronaropathie), la CRP sérique, la protéine HSP70 et les taux d'anticorps anti-HSP70. Toutes les covariables ont été examinées en tant que prédicteurs de la présence et de la gravité de la coronaropathie dans les analyses univariées et en tant que groupe dans un modèle multivarié.

Résultats

Caractéristiques des patients

Au total, 421 sujets ont été étudiés, 62 % étaient des hommes et 72 % étaient de race blanche, âgés de 30 à 82 ans (moyenne, 57,3 ans, médiane, 57,0 ans). Il y avait 258 (61 %) avec des preuves angiographiques de coronaropathie (≥ 50 % de sténose d'au moins une artère coronaire principale par angiographie coronaire). À l'exception de l'hypertension, les facteurs de risque traditionnels de coronaropathie (âge, sexe masculin, diabète et hypercholestérolémie) étaient significativement associés au risque de coronaropathie par les analyses univariées et multivariées. Le tabagisme était significativement associé à la coronaropathie en analyse univariée mais pas en analyse multivariée (tableau 1).

TABLEAU 1. Association de la présence de CAD avec les facteurs de risque traditionnels

Relation entre la protéine HSP70 et les anticorps HSP70 et le risque de coronaropathie

La protéine sérique HSP70 était détectable chez 283 des 421 (67 %) sujets de l'étude, avec des taux allant de 0,2 à 27,1 ng/mL (moyenne, 1,08 médiane, 0,5 ng/mL). Les taux de protéine HSP70 étaient plus élevés chez les patients non-CAD que chez les patients CAD (médiane, 0,72 et IQR, 1,42 versus médiane, 0,34 et IQR, 1,21 ng/mL P= 0,001). De plus, le groupe à niveau élevé de HSP70 (au-dessus de la valeur médiane >0,5 ng/mL) contenait 51 % de patients atteints de coronaropathie, tandis que le groupe à faible taux de HSP70 comptait 71 % de patients atteints de coronaropathie (P<0.001). Une analyse de régression logistique multivariée a révélé que les individus présentant des niveaux élevés de HSP70 présentaient la moitié du risque de coronaropathie que les individus présentant des niveaux faibles (OR ajusté, 0,52 limite de confiance à 95 % [CL], 0,32 à 0,86). L'association d'un niveau élevé de HSP70 avec un faible risque de coronaropathie était indépendante des facteurs de risque traditionnels de coronaropathie (P=0.011).

La figure 1 montre les effets de la protéine HSP70 sur le risque de coronaropathie dans chaque groupe de concentration de protéine HSP70 (affiché par quartile HSP70). Les individus dans le quartile le plus élevé des niveaux HSP70 (>75th) avaient 59 % moins de risque de coronaropathie par rapport à ceux du quartile le plus bas (25th). Les OR avec un risque de MC à 95 % associé à une concentration de protéine HSP70 égale ou supérieure aux 25e, 50e, 75e et 90e centiles de la distribution témoin étaient de 0,42 (0,26 à 0,66), 0,46 (0,28 à 0,75), 0,44 ( 0,24 à 0,79) et 0,38 (0,17 à 0,85), respectivement. L'ajustement pour les facteurs de risque traditionnels de CAD n'a eu aucun impact sur la réduction du risque. Il y avait une non-linéarité de la relation entre la concentration en protéine HSP70 et la réduction du risque de coronaropathie. Contrairement à la protéine HSP70, des anticorps anti-HSP70 humaine ont été détectés chez seulement 34 % des sujets de l'étude. Aucune différence dans la prévalence de la séropositivité anti-HSP70 entre les patients CAD et non CAD n'a été trouvée (34,2 % contre 33,71 %, respectivement P=0.916).

Figure 1. OU avec 95% CL pour CAD dans le groupe de concentration de protéine HSP70 individuel qui est affiché par quartile HSP70.

Relation entre la protéine HSP70 et les anticorps HSP70 et la gravité de la CAD

Une association similaire de niveaux de protéine HSP70 tombant en dessous ou au-dessus de la médiane (>0,5 ng/mL) a également été observée avec la gravité de la maladie, telle qu'évaluée par le nombre de vaisseaux malades (Figure 2). Les taux de protéine HSP70 supérieurs à la médiane étaient liés à une moindre gravité de la coronaropathie (P pour tendance=0,01). L'OR ajusté d'avoir une maladie multivaisseaux pour les patients avec des niveaux élevés de HSP70 était de 0,54 (LC à 95 % : 0,36 à 0,81 P=0,003). Cependant, il n'y avait aucune association entre les anticorps anti-HSP70 et la gravité de la coronaropathie (P=0.264).

Figure 2. Prévalence de la gravité de la CAD par rapport au niveau de protéine HSP70. Un patient a été défini comme ayant une coronaropathie à 1, 2, 3 ou sans vaisseau sur la base de la documentation angiographique d'une sténose ≥ 50 % de chacune des 3 artères coronaires principales. Les données sont présentées à partir de 395 patients pour lesquels des données sur le nombre total de vaisseaux malades étaient disponibles. *P<0,01 lors de la comparaison des groupes multivaisseaux dans les groupes HSP70 faible et élevé à l'aide d'un test univarié.

Relation entre la protéine HSP70 et les anticorps HSP70 et les facteurs de risque traditionnels de la coronaropathie

L'association de la protéine HSP70 aux facteurs de risque de coronaropathie est présentée dans le tableau 2. Des taux élevés de protéine HSP70 n'étaient pas associés au sexe masculin, au tabagisme, au diabète, à l'hypercholestérolémie ou à l'hypertension en analyse univariée et multivariée (tous P>0.05). Bien que la protéine HSP70 soit significativement associée à l'âge, le faible niveau de protéine HSP70 chez les patients atteints de coronaropathie était indépendant de l'âge. Aucune association entre la présence d'anticorps HSP70 et les facteurs de risque de coronaropathie n'a été trouvée (tous P>0,05, données non présentées).

TABLEAU 2. Association des niveaux de HSP70 avec les facteurs de risque de CAD traditionnels

Relation entre la protéine HSP70 et les anticorps HSP70 et l'inflammation

Le niveau moyen de CRP était de 0,84 ± 0,04 chez les individus ayant un niveau élevé de protéine HSP70 et de 0,90 ± 0,05 mg/dL ± SE dans le groupe à faible teneur en protéine HSP70 (P= 0,361). Le niveau moyen de CRP était de 0,88 ± 0,05 chez les individus ayant une séropositivité anti-HSP70 et de 0,87 ± 0,04 mg/dL ± SE chez les personnes ayant une séronégativité anti-HSP70 (P=0.905). Aucune corrélation entre les niveaux de CRP et les niveaux de protéine HSP70 ou la présence d'anticorps HSP70 n'a été observée (les deux P>0.05).

Discussion

Les HSP sont des protéines intracellulaires abondantes, subdivisées en différentes familles selon leur poids moléculaire. Ils se trouvent à la fois dans les organismes procaryotes et eucaryotes et sont hautement conservés, et leur fonction principale semble être de chaperon, impliqué dans le repliement et le transport des protéines. 1,2

HSP70 est l'un des HSP les plus étudiés. Avec le stress, HSP70 se déplace vers le noyau et s'associe aux nucléoles. 9,10 Il partage de nombreuses fonctions de la classe HSP et, en plus, semble protéger contre les lésions ischémiques. Des études ont démontré que l'exposition de cœurs d'animaux isolés à un stress thermique ou ischémique induit l'expression de HSP70, 11 et des études ultérieures 12,13 ont montré qu'une exposition antérieure du corps entier à la chaleur, qui entraîne une augmentation des niveaux de HSP70, améliore la récupération des cœurs d'animaux de l'ischémie. -blessure induite. Des preuves plus convaincantes d'un rôle protecteur de HSP70 dans les lésions induites par l'ischémie ont été trouvées dans des études génétiques. Ceux-ci ont démontré que la surexpression de HSP70 dans des cellules cardiaques primaires cultivées protège ces cellules contre le stress thermique ou ischémique, alors que la surexpression de HSP56 et HSP60 n'a pas un tel effet protecteur. 14-16 Des études ont également montré que les cœurs de souris transgéniques surexprimant HSP70 sont plus résistants aux lésions ischémiques. 17-20

En raison des effets protecteurs connus des HSP mais de la possibilité que les HSP puissent conduire à long terme, par le développement d'auto-anticorps, à une maladie chronique (comme démontré pour HSP60), 1,2 la présente enquête a été entreprise. Nous avons cherché à déterminer si la protéine HSP70 circulante et les anticorps anti-HSP70 sont associés à la coronaropathie.

Dans notre étude, la HSP70 sérique était détectable chez près de 70 % des sujets de l'étude. Plus intéressant encore, il était significativement plus élevé chez les patients non coronariens que chez les patients coronariens, une association indépendante des facteurs de risque traditionnels. De plus, la gravité de la maladie, évaluée par le nombre de vaisseaux malades, était également inversement associée aux niveaux de HSP70. En revanche, les anticorps anti-HSP70 n'étaient présents que chez un tiers des sujets de l'étude, et il n'y avait aucune association entre les anticorps anti-HSP70 et la CAD.

Les mécanismes responsables de la relation inverse entre les taux sériques de HSP70 et la CAD sont, à l'heure actuelle, conjecturaux. Les taux sériques élevés eux-mêmes pourraient exercer des effets biologiques importants. Par exemple, la HSP70 administrée de manière exogène déclenche des cascades de signalisation pro-inflammatoire médiées par la surface cellulaire qui conduisent à l'expression de plusieurs cytokines inflammatoires. 21,22 Cependant, on s'attendrait à ce que cette activité exerce des effets proathéroscléreux plutôt qu'antiathéroscléreux. Fait important, les concentrations extracellulaires de HSP70 nécessaires pour exercer des effets de signalisation sont d'environ 2 ordres de grandeur plus élevées que les concentrations sériques que nous avons mesurées dans cette enquête. Nous pensons donc que les associations inverses que nous avons trouvées entre les taux sériques de HSP70 et de CAD résultent très probablement des effets intracellulaires de la molécule, les taux sériques que nous avons mesurés reflétant probablement, de manière approximative, les taux intracellulaires.

Les mécanismes de protection intracellulaires les plus évidents dérivent des effets de chaperon cellulaire primaire des actions de classe des HSP, qui ont de larges effets sur les protéines intracellulaires. D'autres actions pourraient soit dériver de cette fonction, soit représenter des activités indépendantes de HSP70. Par exemple, Suzuki et al 23 ont démontré que HSP72 (une protéine majeure de la famille HSP70) améliore l'activité de la superoxyde dismutase de manganèse. Cette enzyme préserve la fonction mitochondriale et limite l'apoptose liée aux mitochondries lors d'une lésion d'ischémie-reperfusion myocardique. Ethridge et al 24 ont trouvé une relation inverse entre les niveaux intracellulaires de HSP70 et l'activité de COX-2, une enzyme pro-inflammatoire majeure. Bien qu'il ait été démontré que cette relation dérive de COX-2 inhibant l'expression de HSP70, il a également été suggéré que cette relation réciproque fait partie d'une boucle de rétroaction négative. Si tel est le cas, cela représente un effet anti-inflammatoire important de HSP70. Fait important, Shimizu et al 25 ont démontré chez le rat que HSP70 forme des complexes avec des niveaux inhibiteurs de Bα et atténue l'activation du facteur nucléaire-κB. Étant donné que le facteur nucléaire-κB est un facteur de transcription clé modulant l'expression des gènes pro-inflammatoires, il s'agit d'une autre activité anti-inflammatoire clé de HSP70.

Les résultats disparates relatifs à l'association à la CAD de HSP60 versus HSP70 sont intéressants à considérer. Les anticorps anti-HSP60 sont courants dans la population et il a été démontré qu'ils sont associés au développement de l'athérosclérose. 1,26,27 Des taux sériques élevés de protéine HSP60 se sont également avérés être liés à l'athérosclérose. 3,4 En revanche, des anticorps anti-HSP70 élevés sont relativement rares. 28,29 À l'heure actuelle, on ne sait pas pourquoi un HSP a la capacité de déclencher une réponse auto-immune et de prédisposer à la coronaropathie alors qu'un autre n'en a pas.

Il convient également de souligner que Pockley et al 30 ont rapporté, contrairement à nos résultats, que 20 patients atteints de maladie vasculaire périphérique et 13 patients atteints de maladie vasculaire rénale présentaient des niveaux élevés de HSP70 circulant par rapport à leurs témoins du même âge et sexe. Dans ces études, il y avait une très large gamme de concentrations de HSP70 (0 à 74 550 ng/mL chez les patients atteints de maladie vasculaire périphérique et 0 à 1960 ng/mL chez les témoins). Nous avons étudié 421 patients et avons constaté que l'association entre des niveaux plus élevés de HSP70 et une prévalence plus faible de la coronaropathie et de la gravité de la coronaropathie persistait (OR ajusté, 0,52 CL à 95 %, 0,32 à 0,86) après ajustement pour les facteurs de risque traditionnels de la coronaropathie (âge, sexe masculin, tabagisme, diabète, hypercholestérolémie et hypertension). Ainsi, les résultats disparates entre notre étude et celle de Pockley et al peuvent être liés au type de patient étudié, au dosage utilisé pour quantifier les taux de HSP70 et aux ajustements de données inclus dans chacune des études. De plus, Schett et al 31 ont découvert qu'une lésion myocardique entraîne une libération de HSP60 et une suppression de la réponse immunitaire anti-HSP65.De tels résultats suggèrent que les différences dans les niveaux d'anticorps HSP70 ou HSP70 circulants chez les patients non-CAD et CAD pourraient être attribuables à une conséquence de la formation de complexes immuns. Un tel mécanisme possible serait un sujet très digne d'une enquête future.

En résumé, cette enquête fournit la première preuve que des niveaux élevés de HSP70 humaine, tels que reflétés par des niveaux sériques élevés, sont associés au faible risque de coronaropathie, vraisemblablement à travers ses multiples effets protecteurs intracellulaires sur la réponse d'une cellule au stress. Les résultats de cette étude suggèrent que le niveau sérique de la protéine HSP70 est un marqueur puissant de la diminution de la sensibilité à la coronaropathie et peut être utile, ainsi que d'autres facteurs de risque actuellement reconnus, pour transmettre plus précisément le risque global d'un individu pour la coronaropathie.


Autres variables

SUR LA BASE des résultats de la vision à long terme, AmBisyon2040, les données ont montré que 79,2% des Philippins ne veulent une vie simple et confortable que dans 25 ans. Seulement 3,9% des Philippins voulaient avoir la vie des riches.

Les exemples d'indicateurs sous Matatag consistent à demander aux Philippins s'ils sont en mesure de passer suffisamment de temps avec leur famille et leurs amis, tandis que ceux sous Maginhawa peuvent inclure l'incidence de la faim, la diversité de l'alimentation et les vacances, entre autres. Les indicateurs sous Panatag incluent ceux qui se rapportent à la sécurité et à la sûreté, y compris les économies.

"Cela donnera le pourcentage de ceux qui considèrent qu'ils profitent de la vie matatag, maginhawa et panatag [stable, confortable et sûre] qu'ils veulent", a déclaré Edillon. "Oui, cela peut répondre à la question sur le débat" décent "en ce qui concerne l'incidence de la pauvreté basée sur le FIES, car sur la base de l'enquête de 2016, cette [AmBisyon] est la vie que nous voulons."

Edillon a déclaré que la Neda avait déjà effectué le pré-test de la mesure AmBisyon. L'étude pilote a déjà été menée à l'échelle nationale mais n'a eu que 5 000 répondants. Elle a dit qu'il s'agissait d'un exercice destiné à piloter le questionnaire, de sorte que les chiffres obtenus à partir de l'enquête n'étaient pas définitifs.

Elle espère qu'avec l'approbation et la signature du budget 2019 lundi, le gouvernement pourra mener l'enquête de référence à l'échelle nationale pour l'AmBisyon dans l'année. La Neda proposera le projet à un tiers, plus probablement un institut de recherche, pour mener l'enquête.