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7.14D : Vecteurs navettes et vecteurs d'expression - Biologie


Un vecteur d'expression est généralement un plasmide qui est utilisé pour introduire un gène spécifique dans une cellule cible.

OBJECTIFS D'APPRENTISSAGE

Expliquer la structure et la fonction des vecteurs navette et d'expression

Points clés

  • Le plasmide est fréquemment conçu pour contenir des séquences régulatrices qui agissent comme des régions amplificatrices et promotrices et conduisent à une transcription efficace du gène porté sur le vecteur d'expression.
  • Les vecteurs d'expression doivent avoir des signaux d'expression tels qu'un promoteur fort, un codon de terminaison fort, un ajustement de la distance entre le promoteur et le gène cloné, et l'insertion d'une séquence de terminaison de transcription et d'une séquence d'initiation de traduction portable.
  • Les vecteurs d'expression sont utilisés pour des techniques de biologie moléculaire telles que la mutagenèse dirigée.

Mots clés

  • plasmide: Un cercle d'ADN double brin séparé des chromosomes, que l'on trouve dans les bactéries et les protozoaires.
  • vecteur d'expression: Un vecteur d'expression, autrement connu sous le nom de construction d'expression, est généralement un plasmide qui est utilisé pour introduire un gène spécifique dans une cellule cible.
  • transcription: La synthèse de l'ARN sous la direction de l'ADN.

Un vecteur d'expression, autrement connu sous le nom de construction d'expression, est généralement un plasmide qui est utilisé pour introduire un gène spécifique dans une cellule cible. Une fois que le vecteur d'expression est à l'intérieur de la cellule, la protéine codée par le gène est produite par les complexes ribosomiques de la machinerie de transcription cellulaire et de traduction. Le plasmide est fréquemment conçu pour contenir des séquences régulatrices qui agissent comme des régions amplificatrices et promotrices et conduisent à une transcription efficace du gène porté sur le vecteur d'expression. L'objectif d'un vecteur d'expression bien conçu est la production de grandes quantités d'ARN messager stable et, par extension, de protéines. Les vecteurs d'expression sont des outils de base pour la biotechnologie et la production de protéines telles que l'insuline, qui est importante pour le traitement du diabète.

Après expression du produit génique, la purification de la protéine est requise ; mais puisque le vecteur est introduit dans une cellule hôte, la protéine d'intérêt doit être purifiée à partir des protéines de la cellule hôte. Par conséquent, pour faciliter le processus de purification, le gène cloné doit avoir une étiquette. Ce marqueur pourrait être un marqueur histidine (His) ou tout autre peptide marqueur.

Les vecteurs d'expression sont utilisés pour des techniques de biologie moléculaire telles que la mutagenèse dirigée. Les vecteurs de clonage, qui sont très similaires aux vecteurs d'expression, impliquent le même processus d'introduction d'un nouveau gène dans un plasmide, mais le plasmide est ensuite ajouté dans des bactéries à des fins de réplication. En général, les vecteurs d'ADN qui sont utilisés dans de nombreuses expériences de clonage de gènes de biologie moléculaire n'ont pas besoin d'entraîner l'expression d'une protéine.

Les vecteurs d'expression doivent avoir des signaux d'expression tels qu'un promoteur fort, un codon de terminaison fort, un ajustement de la distance entre le promoteur et le gène cloné, et l'insertion d'une séquence de terminaison de transcription et d'un PTIS (portable translation initiation sequence).

Un vecteur navette est un vecteur qui peut se propager dans deux espèces hôtes différentes, par conséquent, l'ADN inséré peut être testé ou manipulé dans deux types cellulaires différents. Le principal avantage de ces vecteurs est qu'ils peuvent être manipulés dans E. coli puis utilisés dans un système plus difficile ou plus lent à utiliser.

Les vecteurs navettes peuvent être utilisés à la fois chez les eucaryotes et les procaryotes. Les vecteurs navettes sont fréquemment utilisés pour faire rapidement plusieurs copies du gène dans E. coli (amplification). Ils peuvent également être utilisés pour des expériences et des modifications in vitro telles que la mutagenèse et la PCR. L'un des types les plus courants de vecteurs navettes est le vecteur navette de levure qui contient des composants permettant la réplication et la sélection à la fois dans les cellules d'E. coli et dans les cellules de levure. Le composant E. coli d'un vecteur navette de levure comprend une origine de réplication et un marqueur sélectionnable, tel qu'une résistance aux antibiotiques comme la bêta-lactamase. Le composant levure d'un vecteur navette de levure comprend une séquence à réplication autonome (ARS), un centromère de levure (CEN) et un marqueur sélectionnable de levure.


Vecteur (biologie moléculaire)

Dans le clonage moléculaire, un vecteur est une molécule d'ADN utilisée comme véhicule pour transporter artificiellement du matériel génétique étranger dans une autre cellule, où il peut être répliqué et/ou exprimé (par exemple, plasmide, cosmide, phages Lambda). Un vecteur contenant de l'ADN étranger est appelé ADN recombinant. Les quatre principaux types de vecteurs sont les plasmides, les vecteurs viraux, les cosmides et les chromosomes artificiels. Parmi ceux-ci, les vecteurs les plus couramment utilisés sont les plasmides. [1] Commun à tous les vecteurs modifiés ont une origine de réplication, un site de clonage multiple et un marqueur sélectionnable.

Le vecteur lui-même est généralement une séquence d'ADN qui se compose d'un insert (transgène) et d'une séquence plus grande qui sert de "colonne vertébrale" du vecteur. Le but d'un vecteur qui transfère l'information génétique à une autre cellule est typiquement d'isoler, de multiplier ou d'exprimer l'insert dans la cellule cible. Tous les vecteurs peuvent être utilisés pour le clonage et sont donc des vecteurs de clonage, mais il existe également des vecteurs spécialement conçus pour le clonage, tandis que d'autres peuvent être conçus spécifiquement à d'autres fins, telles que la transcription et l'expression de protéines. Les vecteurs conçus spécifiquement pour l'expression du transgène dans la cellule cible sont appelés vecteurs d'expression et ont généralement une séquence promotrice qui pilote l'expression du transgène. Des vecteurs plus simples appelés vecteurs de transcription ne sont capables que d'être transcrits mais pas traduits : ils peuvent être répliqués dans une cellule cible mais non exprimés, contrairement aux vecteurs d'expression. Des vecteurs de transcription sont utilisés pour amplifier leur insert.

La manipulation de l'ADN est normalement effectuée sur E. coli vecteurs, qui contiennent les éléments nécessaires à leur maintien dans E. coli. Cependant, les vecteurs peuvent également avoir des éléments qui leur permettent d'être maintenus dans un autre organisme tel que des cellules de levure, de plante ou de mammifère, et ces vecteurs sont appelés vecteurs navettes. De tels vecteurs ont des éléments bactériens ou viraux qui peuvent être transférés à l'organisme hôte non bactérien, cependant d'autres vecteurs appelés vecteurs intragéniques ont également été développés pour éviter le transfert de tout matériel génétique d'une espèce étrangère. [2]

L'insertion d'un vecteur dans la cellule cible est généralement appelée transformation pour les cellules bactériennes, [3] transfection pour les cellules eucaryotes, [4] bien que l'insertion d'un vecteur viral soit souvent appelée transduction. [5]


Qu'est-ce qu'un vecteur de clonage

Les vecteurs de clonage servent de molécules d'ADN porteuses. Tous les vecteurs de clonage possèdent quatre caractéristiques spéciales :

  • Ils sont auto-réplicatifs avec le segment d'ADN étranger qu'ils portent
  • Ils contiennent plusieurs sites de restriction, qui ne sont présents qu'une seule fois dans le vecteur
  • Ils portent un marqueur sélectionnable, généralement sous la forme de gènes de résistance aux antibiotiques, qui sont absents du génome de l'hôte
  • Ils sont relativement faciles à récupérer à partir de la cellule hôte.

Il existe de nombreux choix de vecteurs de clonage classiques tels que des plasmides, des phages et des cosmides en fonction de l'objectif. Le choix d'un vecteur de clonage dépend de la taille de l'insert et de l'application.

Plasmides

Les plasmides sont des molécules d'ADN double brin extrachromosomiques naturelles, capables de se répliquer de manière autonome à l'intérieur des cellules bactériennes. La limite de taille de l'insert dans les plasmides est de 10 kb. Les plasmides sont utilisés comme vecteurs de clonage dans le sous-clonage et la manipulation en aval, le clonage d'ADNc et les tests d'expression. Le pBR322 est l'un des premiers plasmides génétiquement modifiés à être utilisé dans les technologies de l'ADN recombinant. Le plasmide pBR322 est montré dans Figure 1.

Figure 1 : pBR322

Phage

Les phages sont dérivés du bactériophage lambda dans lequel le car Le site du bactériophage lambda lui permet d'être conditionné dans une tête de phage. La réplication de l'ADN vecteur à l'intérieur de la cellule hôte provoquera finalement la lyse cellulaire. La taille de l'insert qui peut être inséré dans un vecteur phagique est de 5 à 12 kb. Les vecteurs phagiques sont utilisés dans le clonage d'ADN génomique, le clonage d'ADNc et les bibliothèques d'expression.

Cosmides

Les cosmides sont une sorte de plasmides contenant car site du bactériophage lambda. Les car Le site du bactériophage lambda lui permet d'être conditionné dans une tête de phage. Bien qu'il s'agisse d'un plasmide, la réplication des cosmides à l'intérieur de la cellule hôte peut ne pas lyser la cellule comme dans les vecteurs phagiques. La taille de l'insert qui peut être cloné dans un vecteur cosmidique est de 35-45 kb. Les vecteurs cosmidiques sont utilisés dans les constructions de bibliothèques génomiques.

Étant donné que les gènes de mammifères ont souvent une taille supérieure à 100 kb, la séquence complète du gène ne peut pas être clonée avec des vecteurs de clonage classiques. Ce problème est contourné en imitant les propriétés des chromosomes de la cellule hôte dans des vecteurs. Ce type de vecteurs est appelé vecteurs chromosomiques artificiels. Les BAC (vecteurs chromosomiques artificiels bactériens), les YAC (vecteurs chromosomiques artificiels de levure) et les MAC (vecteurs chromosomiques artificiels de mammifères) sont des types de vecteurs chromosomiques artificiels.

Les vecteurs de chromosomes artificiels bactériens sont basés sur Escherichia coli Plasmide du facteur F. La taille de l'insert qui peut être cloné dans un vecteur BAC est de 75-300 kb. Les vecteurs BAC sont utilisés dans l'analyse de grands génomes.

Les vecteurs chromosomiques artificiels de levure sont basés sur Saccharomyces cerevisiae centromère, télomère et autres séquences à réplication autonome. La taille de l'insert qui peut être cloné dans un vecteur YAC est de 100-1 Mb. Les vecteurs YAC sont utilisés dans l'analyse de grands génomes.

Les vecteurs chromosomiques artificiels de mammifères sont basés sur le centromère, le télomère et l'origine de réplication des mammifères. La taille d'insertion dans les MAC est de 100 Ko à 1 Mo. Les MAC sont utilisés en biotechnologie animale et en thérapie génique humaine.


Vecteurs d'expression : Types & Caractéristiques

Les vecteurs d'expression sont des vecteurs qui agissent comme des véhicules pour l'insert d'ADN et permettent également à l'insert d'ADN d'être exprimé efficacement. Il peut s'agir de plasmides ou de virus. Les vecteurs d'expression sont également connus sous le nom de constructions d'expression.

Les vecteurs d'expression sont génétiquement modifiés pour l'introduction de gènes dans les cellules cibles. En plus du gène d'intérêt, ces constructions d'expression contiennent également des éléments régulateurs tels que des amplificateurs et des promoteurs de sorte qu'une transcription efficace du gène d'intérêt se produise.

Les constructions d'expression les plus simples sont également appelées vecteurs de transcription uniquement parce qu'elles permettent la transcription du gène étranger cloné et non sa traduction. Les vecteurs qui facilitent à la fois la transcription et la traduction du gène étranger cloné sont appelés vecteurs d'expression de protéine. Ces constructions d'expression de protéine conduisent également à la production de protéine recombinante.

Désormais, pour la transcription et la traduction, un promoteur et une séquence de terminaison sont indispensables. La transcription commence au niveau du promoteur et se termine au site de terminaison. Les promoteurs des vecteurs d'expression doivent avoir des commutateurs marche/arrêt. Ces commutateurs aident à réguler la production du produit génique. Des quantités excessives de produit du gène d'intérêt peuvent être toxiques pour la cellule. Un promoteur commun utilisé dans les constructions d'expression est la version mutante du promoteur lac, lacUV. Le promoteur lacUV initie un niveau élevé de transcription dans des conditions induites. De plus, dans certains vecteurs d'expression, un site de liaison ribosomique est présent en amont du codon d'initiation. Le site de liaison ribosomique facilite la traduction efficace du gène étranger cloné.

Les vecteurs d'expression sont largement utilisés en biologie moléculaire dans des techniques telles que la mutagenèse dirigée.

Comment fonctionnent les vecteurs d'expression ?

  • Une fois que la construction d'expression est à l'intérieur de la cellule hôte, la protéine codée par le gène d'intérêt est produite par la transcription. Par la suite, il utilise la machinerie de traduction et les complexes ribosomiques de l'organisme hôte.
  • Fréquemment, le plasmide est génétiquement modifié pour abriter des éléments régulateurs tels que des amplificateurs et des promoteurs. Ces séquences régulatrices contribuent à une transcription efficace du gène d'intérêt.
  • Les vecteurs d'expression sont largement utilisés comme outils qui aident à la production d'ARNm et, à leur tour, de protéines stables. Ils présentent un grand intérêt en biotechnologie et en biologie moléculaire pour la production de protéines comme l'insuline. L'insuline est l'ingrédient principal dans le traitement de la maladie complexe, le diabète.
  • Lorsque le produit protéique est exprimé, il doit être ensuite purifié. La purification d'une protéine pose un défi puisque la protéine d'intérêt, dont le gène est porté sur le vecteur d'expression, doit être purifiée indépendamment des protéines de l'organisme hôte. Pour simplifier le processus de purification, le gène d'intérêt porté sur le vecteur d'expression doit toujours avoir un « tag ». Cette étiquette peut être n'importe quel peptide marqueur ou histidine (étiquette His).
  • Les vecteurs d'expression sont considérablement exploités dans des techniques telles que la mutagenèse dirigée. Les vecteurs de clonage introduisent le gène d'intérêt dans un plasmide qui à son tour se réplique dans les bactéries. Ces vecteurs de clonage ne doivent pas nécessairement conduire à l'expression d'une protéine.

Par conséquent, les vecteurs d'expression doivent avoir les signaux d'expression suivants :

  • Promoteur fort,
  • Codon de terminaison fort,
  • Ajustement de la distance entre le promoteur et le gène cloné,
  • Séquence de terminaison de transcription insérée, et
  • Séquence d'initiation de la traduction portable.

Promoteur

  • Un promoteur assure une transcription fiable du gène d'intérêt. De plus, des promoteurs puissants sont également nécessaires pour une synthèse d'ARNm efficace avec l'ARN polymérase.
  • La régulation du promoteur est un autre aspect critique qui doit toujours être gardé à l'esprit lors de la construction d'un vecteur d'expression.
  • Les promoteurs les plus puissants sont ceux trouvés dans les bactériophages T5 et T7.

Dans E. coli, le promoteur est régulé de deux manières :

Induction : ajout de commutateurs chimiques sur la transcription du gène.

Répression : l'ajout de produit chimique arrête la transcription du gène.

Les promoteurs les plus couramment utilisés dans E. coli système d'expression sont :

  • Il régule la transcription du gène lac Z. Le gène lac Z est responsable de la production de -galactosidase.
  • Le gène lac Z peut être induit par l'IPTG, l'isopropylthiogalactosidase.
  • Les séquences du promoteur lac peuvent être fusionnées au gène cible. Il en résultera alors une expression lactose-dépendante du gène cible.
  • Néanmoins, le promoteur lac a ses inconvénients. Il est assez faible et ne peut pas être utilisé pour les niveaux élevés de production de la protéine souhaitée. De plus, les gènes lac assurent le niveau basal de la transcription même en l'absence d'induction (molécule inductrice).
  • Il est responsable de la régulation d'un groupe de gènes impliqués dans la biosynthèse du tryptophane.
  • Le tryptophane agit comme sa molécule répresseur et il est induit par l'acide 3-β-indoleacrylique.
  • Il est formé par hybridation des promoteurs lac et trp. Cependant, il est plus fort que l'un d'eux.
  • Le promoteur tac est induit par l'IPTG, l'isopropylthiogalactosidase.
  • C'est un puissant promoteur et est responsable de la transcription de l'ADN dans E. coli
  • Le produit du gène λcI agit comme son répresseur. On l'appelle répresseur.
  • L'expression construite avec le PL le promoteur est utilisé en combinaison avec le E. coli hôte mutant. Il est responsable de la production d'une forme sensible à la température de répresseur λ.
  • A basse température, la protéine répresseur réprime la transcription alors que la transcription du gène cloné se produit à haute température car le répresseur est inactivé à haute température.
  • Pour l'expression des protéines dans les cellules de mammifères, le promoteur doit être situé en amont de l'ADNc cloné pour sa transcription efficace.
  • Dans la plupart des cas, les promoteurs viraux ne sont employés que parce qu'ils sont fiables pour une expression constitutive forte.
  • Les promoteurs largement utilisés sont le promoteur CMV (dérivé du cytomégalovirus) et le promoteur SV40 (dérivé du virus simien 40).

Les promoteurs dans les vecteurs d'expression de levure disponibles dans le commerce peuvent être actifs de manière constitutive ou inductibles.

Un promoteur constitutif est une sorte de promoteur qui n'est pas régulé et permet une transcription continue de son gène associé.

Exemple de promoteur constitutif : promoteur GAP du gène codant pour la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase.

Un promoteur inductible est celui qui fonctionne de manière régulée et l'expression des gènes qui lui sont associés peut être activée ou désactivée à un stade particulier de développement ou à un certain moment.

Exemples de promoteurs inductibles : AOX1, GAL1, GAL10, nmt1, nmt42 et nmt81.

Les Promoteur AOX1 du gène codant pour l'alcool oxydase. Elle est induite par le méthanol et est la mieux adaptée à l'expression de la protéine dans Pichia pastoris.

Les GAL1 et GAL10 les promoteurs sont d'autres exemples. Ils sont induits par le galactose et conviennent à l'expression de protéines dans Saccharomyces cerevisiae.

Les nmt1, nmt42, et nmt81 promoteurs induits par la thiamine pour l'expression des protéines dans Schizosaccharomyces pombe.

Reporter Gene

  • Le gène rapporteur est responsable de la production de la protéine qui peut être détectée et quantifiée à l'aide d'un test simple.
  • Ils servent d'outil pour mesurer l'efficacité de l'expression du gène et également pour détecter la localisation intracellulaire de la protéine.
  • Le taux d'expression du gène de structure dépend des séquences régulatrices qui lui sont situées en amont.
  • Le taux d'expression du gène peut être mesuré par remplacement de sa partie codant pour la protéine. En outre, il peut être fusionné à un autre gène qui exprime une autre protéine. La présence de cette autre protéine peut être facilement identifiée.
  • Les gènes rapporteurs sont utiles dans l'identification de promoteurs, d'amplificateurs et d'autres protéines ou éléments régulateurs qui s'y lient.

Les gènes rapporteurs les plus couramment utilisés sont :

  • Il agit comme rapporteur en présence de X-gal.
  • Ses niveaux sont facilement détectés par l'intensité de la couleur qui est produite. L'intensité de la couleur bleue produite est quantifiée.

2. Gène codant pour la CAT (chloramphénicol acétyltransférase) de E. coli

  • Le gène CAT code pour la chloramphénicol acétyltransférase.
  • L'enzyme transférase est responsable du transfert des groupes acétyle de l'acétyl CoA à l'antibiotique receveur, le chloramphénicol

3. Gène codant pour la luciférase de la luciole, Photinus pyralis

  • La luciférase est responsable de l'oxydation de la luciférine.
  • L'oxydation de la luciférine entraîne l'émission de lumière jaune-verte. L'émission de lumière est facilement détectée indépendamment des faibles niveaux.

4. Gène codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) des méduses, Aequorea victoria

  • La GFP a été découverte par Shimomura.
  • C'est une protéine autofluorescente avec 238 résidus d'acides aminés produits par la méduse bioluminescente Aequorea victoria.
  • Dans la GFP, le tonneau est formé de onze brins . Une hélice traverse le centre. Le chromophore est situé au milieu du canon. Les résidus d'acides aminés de 65 à 67 de séquence Ser-Tyr-Gly forment le chromophore, p-hydroxybenzylidèneimidazolinone, qui est fluorescent. Le chromophore émet une fluorescence à une longueur d'onde maximale de 508 nm (lumière verte) lorsqu'il est irradié avec des UV ou de la lumière bleue (400 nm).
  • La GFP sert d'outil pour déterminer la localisation des protéines.
  • Il sert de marqueur par lequel il est fusionné avec une protéine dont l'expression doit être surveillée. Fondamentalement, la localisation subcellulaire de la protéine est étudiée.
  • Les techniques de génie génétique aident à la production de vecteurs qui contiennent la séquence codante de la protéine non identifiée, X, clonée dans la séquence codante de la GFP.
  • Ce produit de fusion de GFP-X peut maintenant être transfecté dans des cellules cibles et l'expression, ainsi que la localisation subcellulaire de la protéine X, peuvent être facilement surveillées et détectées.

Site de liaison du ribosome et site d'initiation à la traduction

  • Le site de liaison ribosomique (RBS) suit le promoteur. Il est responsable de la traduction efficace du gène cloné.
  • Le site d'initiation de la traduction dans le cas des procaryotes est connu sous le nom de séquence Shine Dalgarno. Cette séquence est incluse dans le RBS uniquement.
  • La séquence consensus du site d'initiation de la traduction comprend un ensemble de 8 paires de bases présentes en amont du codon d'initiation AUG.
  • La traduction chez les eucaryotes est initiée à une séquence particulière appelée séquence Kozak.
  • La machinerie ribosomique pour la traduction de l'ARNm est assemblée sur ce site.

Polylinkers

  • Chaque vecteur contient des sites de reconnaissance particuliers pour les enzymes de restriction. C'est au site de restriction que le vecteur est excisé pour cloner le gène étranger d'intérêt.
  • Ces sites sont souvent proches les uns des autres et, par conséquent, sont appelés polylinkers ou sites de clonage multiples (MCS).
  • Ces régions ont une longueur de 50 à 100 paires de bases et peuvent avoir un groupe de jusqu'à 25 sites de restriction.

Queue poly-A (polyadénylation)

  • La queue poly-A présente, à l'extrémité de l'ARNm formé, protège l'ARNm de la dégradation par les exonucléases ou endonucléases.
  • Il est extrêmement critique pour la stabilité de l'ARNm.
  • Il est également responsable de la terminaison de la transcription et de la traduction et stabilise la production d'ARNm.
  • Un complexe enzymatique nucléolytique et une poly-A-polymérase sont des conditions préalables à l'ajout de la queue poly-A à l'extrémité de l'ARNm.

Système d'expression

La production d'une protéine nécessite un système d'expression. Il existe deux types de systèmes d'expression, le système d'expression procaryote et eucaryote. Chacun d'eux a ses propres avantages et inconvénients qui peuvent être pris en considération lors de la construction d'un système d'expression. Cependant, il n'existe pas un tel système d'expression qui puisse être considéré comme universel pour la production de protéines hétérologues.

Système d'expression procaryote

  • La spécificité du promoteur d'une ARN polymérase, dans le cas des procaryotes, est médiée par le facteur sigma.
  • E. coli est le système d'expression procaryote largement utilisé.
  • Il exprime des niveaux élevés de la protéine.
  • Les E. coli les souches sont manipulées génétiquement pour la production de protéines recombinantes afin qu'elles soient rendues sûres pour les expériences à grande échelle et la fermentation.
  • La purification de la protéine est devenue plus facile puisque les protéines de fusion recombinantes peuvent être purifiées par chromatographie d'affinité, disons par exemple les protéines de fusion glutathion-S-transférase et maltose.

Indépendamment des progrès et des améliorations qui se produisent, dans le système d'expression procaryote, il existe encore de nombreuses difficultés associées et défis posés par la production de protéines à partir des gènes étrangers clonés. Ces types de défis peuvent être regroupés en 2 catégories :


  • ADN pAUR101 (6 687 pb)&mdash intégration chromosomique pour S. cerevisiae
  • ADN pAUR112 (7 104 pb)
  • ADN pAUR123 (6 982 pb)
  • ADN pAUR224 (7 638 pb)
  • pAUR135 DNA (6 074 pb&mdashvector pour l'élimination des marqueurs dans S. cerevisiae
  • pAUR316 DNA (11 663 pb)&mdashvecteur à réplication autonome pour Aspergillis nidulans

Applications

Clonage et transformation en levure ou Aspergillus nidulans systèmes utilisant l'auréobasidine A comme antibiotique sélectif

10 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM d'EDTA

Concentration

1 µg/µl (la concentration pour l'ADN pAUR316 est de 0,5 µg/µl)

Informations supplémentaires sur le produit

Veuillez consulter le certificat d'analyse du produit pour obtenir des informations sur les conditions de stockage, les composants du produit et les spécifications techniques. Veuillez consulter la liste des composants du kit pour déterminer les composants du kit. Les certificats d'analyse et les listes de composants du kit se trouvent sous l'onglet Documents.

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Matériaux et méthodes

Souches bactériennes, milieux, réactifs et conditions de croissance

E. coli la souche XL1-Blue (Stratagene) a été utilisée pour toutes les expériences de clonage, et a été cultivée dans du bouillon LB (Difco) à 37°C en présence de 50 g/ml de kanamycine (Sigma-Aldrich) avec une agitation constante à 200 rpm ou sur LB plaques de gélose. M. smegmatis mc 2 155 a été utilisé pour les études d'expression mycobactérienne. Les plasmides générés dans cette étude (tableau 1) ont été électroporés dans M. smegmatis, et les bactéries ont été sélectionnées sur l'antibiotique requis. Les bactéries ont été cultivées dans un bouillon liquide Middlebrook 7H9 (Difco) additionné de 2 % de glucose et 0,05 % de Tween 80, à 37 °C avec agitation constante à 200 tr/min ou sur un milieu solide Middlebrook 7H9 additionné de 2 % de glucose avec incubation à 37 °C. 25 µg/ml de kanamycine ont été utilisés pour la culture mycobactérienne. Les enzymes de modification de l'ADN (telles que la phosphatase antarctique, la polynucléotide kinase T4 et les enzymes de restriction, etc.) ont été achetées auprès de New England Biolabs. Toutes les enzymes ont été utilisées conformément aux instructions du fabricant.