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6B : Cinétique des Réactions Simples et Enzymatiques - Biologie


Objectifs d'apprentissage

  • écrire des équations chimiques et différentielles appropriées pour la vitesse de disparition des réactifs ou l'apparition de produits pour les réactions de 1er ordre, pseudo premier ordre, deuxième ordre, réversibles de premier ordre
  • dessiner et interpréter des graphiques pour les équations de vitesse intégrées (montrant les concentrations de réactif ou de produit en fonction du temps) et les équations de vitesse initiale (montrant la vitesse initiale vo en fonction du réactif ;
  • dériver des constantes de vitesse cinétique à partir de données et de graphiques d'équations de vitesse intégrée et de vitesse initiale ;
  • écrire des équations chimiques, différentielles et des équations de vitesse initiale appropriées pour la vitesse de disparition des réactifs ou l'apparition de produits pour une réaction catalysée par une enzyme simple ;
  • faire la différence entre les hypothèses d'état rapide et d'état stable ;
  • simplifier l'équation de vitesse initiale contenant les constantes de vitesse pour une réaction catalysée par une enzyme en remplaçant les constantes de vitesse par kcat et KM, et donner des définitions opérationnelles et mathématiques de ces constantes ;

Enzymes sont des catalyseurs hautement spécifiques pour les réactions biochimiques, chaque enzyme présentant une sélectivité pour un seul réactif, ou substrat. Par exemple, l'enzyme acétylcholinestérase catalyse la décomposition du neurotransmetteur acétylcholine en choline et acide acétique. De nombreuses réactions enzyme&substrat suivent un mécanisme simple qui consiste en la formation initiale d'un complexe enzyme&ndashsubstrat, (ES), qui se décompose ensuite pour former un produit, libérant l'enzyme pour réagir à nouveau.

Figure (PageIndex<1>) : Une enzyme catalyse la réaction de deux substrats et forme un seul produit. de Wikipédia.

Ceci est décrit dans le mécanisme en plusieurs étapes suivant

où (k_1), (k_<&ndash1>), (k_2) et (k_<&ndash2>) sont des constantes de taux. La loi de vitesse de réaction pour générer le produit ([P]) est

Cependant, si nous effectuons la mesure au début de la réaction, la concentration des produits est négligeable, c'est-à-dire

et nous pouvons ignorer la réaction inverse (deuxième terme du membre de droite de l'équation ( ef<13.21A>)). Ensuite, dans ces conditions, la vitesse de réaction est

Pour être analytiquement utile, nous devons écrire l'équation ( ef<13.21>) en termes de réactifs (par exemple, les concentrations d'enzyme et de substrat). Pour ce faire, nous utilisons le approximation en régime permanent, dans laquelle nous supposons que la concentration de (ES) reste essentiellement constante. Après une période initiale, au cours de laquelle le complexe enzyme&ndashsubstrat se forme pour la première fois, la vitesse à laquelle (ES) se forme

est égal à la vitesse à laquelle il disparaît

où ([E]_0) est la concentration d'origine de l'enzyme. La combinaison des équations ( ef<13.22>) et ( ef<13.23>) donne

que nous résolvons pour la concentration du complexe enzyme&ndashsubstrat

où (K_m) est le Constante de Michaelis. Équation de substitution ( ef) dans l'équation ( ef<13.21>) nous laisse avec notre équation de taux finale.

Un tracé de l'équation ( ef), comme le montre la figure (PageIndex<1>), est instructif pour définir les conditions dans lesquelles nous pouvons utiliser la vitesse d'une réaction enzymatique pour l'analyse quantitative d'une enzyme ou d'un substrat.

Figure (PageIndex<1>) : Tracé de l'équation ( ef) montrant les limites de l'analyse de substrats et d'enzymes dans une méthode d'analyse cinétique chimique catalysée par une enzyme. La courbe dans la région surlignée en rouge obéit à l'équation ( ef<13.27>) et la courbe dans la zone surlignée en vert suit l'équation ( ef).

Pour des concentrations élevées de substrat, où ([S] gg K_m), équation ( ef) se simplifie en

où (V_) est la vitesse maximale de la réaction catalysée. Dans ces conditions la réaction est d'ordre zéro en substrat et on peut utiliser (V_) pour calculer la concentration en enzymes, généralement en utilisant une méthode à temps variable. À des concentrations de substrat plus faibles, où ([S] ll K_m), l'équation ( ef) devient

La réaction est maintenant de premier ordre dans le substrat, et nous pouvons utiliser la vitesse de la réaction pour déterminer la concentration du substrat par une méthode à temps fixe.

La constante de Michaelis (K_m) est la concentration du substrat à laquelle la vitesse de réaction est à moitié maximale, et est une mesure inverse de l'affinité du substrat pour l'enzyme&mdashas un petit (K_m) indique une affinité élevée, ce qui signifie que la vitesse approchera (V_) plus vite. La valeur de (K_m) dépend à la fois de l'enzyme et du substrat, ainsi que de conditions telles que la température et le pH.

La constante de Michaelis (K_m) est la concentration de substrat à laquelle la vitesse de réaction est à mi-hauteur.

A partir des deux derniers termes de l'équation ( ef<13.27>), on peut exprimer (V_) en termes de chiffre d'affaires ((k_)):

où ([E]_0) est la concentration enzymatique et (k_) est le chiffre d'affaires, défini comme le nombre maximum de molécules de substrat converties en produit par molécule d'enzyme par seconde. Par conséquent, le chiffre d'affaires est défini comme le nombre maximal de conversions chimiques de molécules de substrat par seconde qu'un seul site catalytique exécutera pour une concentration enzymatique donnée ([E]_o).

Exemple (PageIndex<1>) : Chiffre d'affaires de l'acétylcholinestérase

L'acétylcholinestérase (AChE) peut être l'une des enzymes les plus rapides. Il hydrolyse l'acétylcholine en choline et un groupe acétate. L'une des premières valeurs du chiffre d'affaires était (3 imes 10^7) (molécules d'acétylcholine) par minute et par molécule d'enzyme. Une valeur plus récente à 25°C, pH = 7.0, concentration d'acétylcholine de (2.5 imes 10^<&minus3> M), s'est avérée être (7.4 imes 10^5 min^<&minus1>) ( J Biol Chem. 236 (8) : 2292&ndash5. ).

Il peut y avoir une trentaine de centres actifs par molécule. L'AChE est une sérine hydrolase qui réagit avec l'acétylcholine à près de le taux de diffusion contrôlé. Une réaction contrôlée par la diffusion se produit si rapidement que la vitesse de réaction est la vitesse de transport des réactifs à travers la solution une  s rapidement lorsque les réactifs se rencontrent, ils réagissent.


Régulation enzymatique

Inhibition compétitive et non compétitive

Les enzymes peuvent être inhibées ou activées par l'interférence d'autres composés. Ceux-ci influenceront la réaction en changeant le (K_m) ou (V_) de la réaction. La plupart des inhibiteurs enzymatiques agissent de manière réversible et ne provoquent pas de modifications permanentes de l'enzyme. Cependant, il existe également des inhibiteurs irréversibles qui modifient l'enzyme cible de manière covalente et permanente. Ceux-ci sont appelés inhibiteurs suicidaires.

Les inhibiteurs peuvent être classés comme compétitif ou non compétitif et ceci peut être déterminé en comparant la cinétique des réactions normales par rapport aux réactions inhibées.

Figure 1.6 : Inhibition compétitive vs. non compétitive.

Inhibiteurs compétitifs lier l'enzyme au site actif et entrer en compétition avec le substrat pour la liaison. Beaucoup fonctionnent comme des analogues de substrat. En présence de l'inhibiteur, une concentration de substrat plus élevée est donc nécessaire pour atteindre une vitesse semi-maximale à laquelle la constante de Michaelis (K_m) augmente. Lorsque les concentrations de substrat sont élevées, cela finira par déplacer l'inhibiteur et (V_) sera atteint. Le taux maximum, (V_), n'est donc pas influencée par les inhibiteurs compétitifs. Dans ce cas, il n'y a pas changer le (V_) car la concurrence peut être surmontée par une augmentation de la concentration de substrat mais il y a un augmentation de l'apparente (K_m) de 5 Figure 1.5 Diagramme de Lineweaver-Burk pour illustrer (K_m) et (V_). (Adapté de Marks&rsquo Medical Biochemistry) Figure 1.6 Inhibition compétitive vs. non compétitive. (Adapté de Marks Medical Biochemistry) la réaction étant donné qu'une plus grande concentration de substrat est nécessaire pour atteindre (V_) (Figure 1.6A).

En revanche, inhibiteurs non compétitifs lier l'enzyme sur un site alternatif au site de liaison au substrat et, par conséquent, ses effets ne peuvent pas être surmontés en augmentant le substrat. Dans ce cas, (K_m) reste inchangé, mais (k_) (le taux de formation du produit) et donc (V_), diminue. Les inhibiteurs irréversibles entraînent généralement un type d'inhibition non compétitif car la concentration de l'enzyme active [E] diminue (figure 1.6B).

L'action des inhibiteurs peut être clairement illustrée dans le graphique de Lineweaver & 8210Burk. Dans ce type de tracé, l'intersection des droites d'approximation avec l'axe des y correspond à 1/(V_) tandis que l'interception de l'axe des x donne la valeur de -1/(K_m). C'est pourquoi les droites obtenues en l'absence (bleu) et en présence d'inhibiteur compétitif (A, rouge) se coupent en ordonnée (1/ (V_), inchangé), tandis que les inhibiteurs non compétitifs (B, rouge) donnent une ligne droite avec une ordonnée à l'origine plus élevée mais une ordonnée à l'origine inchangée (1/(V_) augmenté, (K_m) inchangé) (Figure 1.6).


Cinétique enzymatique

Équations de vitesse pour certains mécanismes biréactifs

Dans certains cas, différents mécanismes cinétiques sont décrits par différentes équations de vitesse. (Voir les textes de cinétique enzymatique standard pour les procédures utilisées pour dériver ces équations.) Par conséquent, il est parfois possible de distinguer les mécanismes des caractéristiques des graphiques à double réciprocité. Par exemple, l'équation de vitesse pour un mécanisme biréactif ordonné dans des conditions d'équilibre en l'absence de produits est

KmA et KMo sont les constantes de Michaelis des deux substrats et Kc'est-à-dire est la constante de dissociation simple du complexe EA. (Les équations de vitesse pour les mécanismes multiréactifs contiennent souvent les deux types de constantes.) Lorsque [UNE] varie à différentes concentrations fixes de B, la dépendance de la vitesse peut être écrite sous la forme de l'équation de Michaelis-Menten :

Soit, sous forme double réciproque :

Lorsque [B] varie à différentes concentrations fixes de A, les équations sont

À une concentration fixe d'un substrat, par exemple A, la dépendance de la vitesse à la concentration du substrat B peut également être décrite par une forme simplifiée de l'équation. (25) :

où le constantes apparentes sont liés aux constantes vraies ou limites, comme indiqué ci-dessous.

En d'autres termes, le "Km" et "Vmax” dépend de la concentration du co-substrat et n'égalera les valeurs limites que si cette concentration est infiniment élevée (« saturante »). En pratique, les constantes cinétiques limites sont obtenues à partir de tracés appropriés des pentes et 1/v-axes interceptés des graphiques à double réciprocité. (Le premier est une réécriture de Km, application/Vmax, application ce dernier est un reploiement de 1/Vmax, application.) Par exemple, les replots pour la famille de 1/v contre 1/[B] parcelles à différents fixes [UNE] sont décrits par les équations linéaires suivantes :

Les équations du mécanisme biréactif de l'enzyme substituée (ping-pong) en l'absence de produits sont

Lorsque [UNE] est varié à différents [B], les équations de Michaelis-Menten et doubles réciproques sont

Les équations pour varié [B] à différents [UNE] sont symétriques à ceux indiqués pour divers [UNE]. La figure 3 montre les familles de 1/v contre 1/[UNE] tracés pour un mécanisme ordonné et un mécanisme de ping-pong. Dans les deux mécanismes différents fixes [B] affectent les interceptions de l'axe vertical. Dans le mécanisme ordonné, changer [B] affecte également les pentes du 1/v contre 1/[UNE] parcelles. Mais dans le mécanisme de ping-pong, changer le fixe [B] n'a aucun effet sur les pentes. (Notez que les équations (24) et (33) prédisent ces effets.) L'absence d'effet de pente est souvent suffisante pour identifier le mécanisme de ping-pong. Mais la présence à la fois d'effets de pente et d'interception (comme le montre la figure 3A) n'est pas suffisante pour diagnostiquer le mécanisme tel qu'il est ordonné car en l'absence de produits, un mécanisme aléatoire ordonné à l'état stationnaire, un Théorell-Chance et un mécanisme aléatoire à équilibre rapide ont tous la même équation de vitesse. Par conséquent, les schémas de tracé à double réciprocité des trois mécanismes différents sont les mêmes. Des mesures supplémentaires sont nécessaires pour distinguer ces mécanismes. Les études d'inhibition du produit peuvent être instructives. Par exemple, dans un mécanisme ordonné à l'état d'équilibre, l'un des produits (P, le premier à se dissocier de l'enzyme) est non compétitif vis-à-vis des deux substrats, mais dans un mécanisme Theorell-Chance et aléatoire, chaque produit est compétitif avec au moins au moins un substrat. Des études d'inhibition sans issue peuvent également être utiles. Par exemple, un analogue non réactif qui est compétitif avec B sera non compétitif avec A dans les mécanismes ordonnés et Theorell-Chance, mais non compétitif avec A dans le mécanisme aléatoire. (Cela suppose que l'inhibiteur forme un complexe EAI dans le mécanisme Theorell-Chance et imite complètement le substrat B dans le mécanisme aléatoire en se liant à la fois à E et à EA.)

Figure 3 . Parcelles double-réciproque de 1/v contre 1/[UNE] à différentes concentrations fixes de B. A est appelé le substrat varié B est appelé le substrat fixe changeant. (A) Un mécanisme séquentiel. Les tracés pourraient être pour un mécanisme ordonné à l'état stationnaire, Theorell-Chance, ou un mécanisme aléatoire à équilibre rapide. (B) Mécanisme de ping-pong. Pour les mécanismes ci-dessus, les tracés de 1/v contre 1/[B] à différents fixes [UNE] ont le même aspect que pour varié 1/[UNE]. Les constantes cinétiques limites, KmA, KMo, Kc'est-à-dire, Vmax, etc., sont obtenus en retraçant les pentes et/ou 1/v-axes d'interception des tracés à double réciprocité par rapport à l'inverse de la concentration de substrat fixe changeante.


Contenu

En 1901, le physico-chimiste français Victor Henri a découvert que les réactions enzymatiques étaient initiées par une liaison (plus généralement, une interaction de liaison) entre l'enzyme et le substrat. [4] Son travail a été repris par le biochimiste allemand Leonor Michaelis et le médecin canadien Maud Menten, qui ont étudié la cinétique d'un mécanisme de réaction enzymatique, l'invertase, qui catalyse l'hydrolyse du saccharose en glucose et fructose. [5] En 1913, ils ont proposé un modèle mathématique de la réaction. [6] Il implique une enzyme, E, se liant à un substrat, S, pour former un complexe, ES, qui à son tour libère un produit, P, régénérant l'enzyme d'origine. Cela peut être représenté schématiquement par

où k f > (vitesse constante), k r > (constante de vitesse inverse), et k c a t >> (constante de vitesse catalytique) désignent les constantes de vitesse, [7] les doubles flèches entre S (substrat) et ES (complexe enzyme-substrat) représentent le fait que la liaison enzyme-substrat est un processus réversible, et la seule flèche vers l'avant représente la formation de P (produit).

Sous certaines hypothèses - telles que la concentration en enzyme étant bien inférieure à la concentration en substrat - le taux de formation du produit est donné par

Le modèle est utilisé dans une variété de situations biochimiques autres que l'interaction enzyme-substrat, y compris la liaison antigène-anticorps, l'hybridation ADN-ADN et l'interaction protéine-protéine. [9] [12] Elle peut être utilisée pour caractériser une réaction biochimique générique, de la même manière que l'équation de Langmuir peut être utilisée pour modéliser l'adsorption générique d'espèces biomoléculaires. [12] Lorsqu'une équation empirique de cette forme est appliquée à la croissance microbienne, elle est parfois appelée équation de Monod.

Les valeurs des paramètres varient considérablement entre les enzymes : [13]

Enzyme K M >> (M) k chat >> (s −1 ) k cat / K M >/K_ >> (M −1 s −1 )
Chymotrypsine 1.5 × 10 −2 0.14 9.3
Pepsine 3.0 × 10 −4 0.50 1.7 × 10 3
T-ARN synthétase 9.0 × 10 −4 7.6 8.4 × 10 3
Ribonucléase 7.9 × 10 −3 7.9 × 10 2 1.0 × 10 5
Anhydrase carbonique 2.6 × 10 −2 4.0 × 10 5 1.5 × 10 7
Fumarase 5.0 × 10 −6 8.0 × 10 2 1.6 × 10 8

La constante k cat / K M >/K_ >> (efficacité catalytique) est une mesure de l'efficacité avec laquelle une enzyme convertit un substrat en produit. Les enzymes à diffusion limitée, telles que la fumarase, fonctionnent à la limite supérieure théorique de 10 8 – 10 10 M −1 s −1 , limitée par la diffusion du substrat dans le site actif. [14]

La cinétique de Michaelis-Menten a également été appliquée à une variété de sphères en dehors des réactions biochimiques, [7] y compris la clairance alvéolaire des poussières, [15] la richesse des pools d'espèces, [16] la clairance de l'alcool dans le sang, [17] la photosynthèse- relation d'irradiance et infection bactérienne du phage. [18]

L'équation peut également être utilisée pour décrire la relation entre la conductivité du canal ionique et la concentration de ligand. [19]

L'application de la loi d'action de masse, qui stipule que la vitesse d'une réaction est proportionnelle au produit des concentrations des réactifs (c'est-à-dire [ E ] [ S ] ), donne un système de quatre équations différentielles ordinaires non linéaires qui définissent le taux de changement des réactifs avec le temps t [20]

Approximation d'équilibre Modifier

Dans leur analyse originale, Michaelis et Menten ont supposé que le substrat est en équilibre chimique instantané avec le complexe, ce qui implique [6] [21]

A partir de la loi de conservation enzymatique, on obtient [21]

La combinaison des deux expressions ci-dessus, nous donne

En simplifiant, on obtient

Approximation quasi-stationnaire Modifier

Une analyse alternative du système a été entreprise par le botaniste britannique GE Briggs et le généticien britannique JBS Haldane en 1925. l'hypothèse d'état quasi-stationnaire ou l'hypothèse d'état pseudo-stationnaire. Mathématiquement, cette hypothèse signifie k f [ E ] [ S ] = k r [ ES ] + k c a t [ ES ] = ( k r + k c a t ) [ ES ] [>>>>]=k_[>]+k_ >[>]=(k_+k_ >)[>]> . C'est mathématiquement la même que l'équation précédente, avec k r > remplacé par k r + k c a t +k_ >> . Par conséquent, en suivant les mêmes étapes que ci-dessus, la vitesse v de la réaction est [21] [23]

est connue sous le nom de constante de Michaelis.

Hypothèses et limitations Modifier

La première étape de la dérivation applique la loi d'action de masse, qui repose sur la libre diffusion. Cependant, dans l'environnement d'une cellule vivante où il y a une forte concentration de protéines, le cytoplasme se comporte souvent plus comme un gel visqueux qu'un liquide à écoulement libre, limitant les mouvements moléculaires par diffusion et modifiant les vitesses de réaction. [24] Bien que la loi d'action de masse puisse être valable dans des environnements hétérogènes, [25] il est plus approprié de modéliser le cytoplasme comme une fractale, afin de capturer sa cinétique de mobilité limitée. [26]

En revanche, l'analyse quasi-stationnaire de Briggs-Haldane est valide si [20] [27]

Ainsi, il est valable si la concentration en enzyme est bien inférieure à la concentration en substrat ou K M >> ou les deux.

Il est également important de se rappeler que, bien que l'irréversibilité soit une simplification nécessaire afin de produire une solution analytique traitable, dans le cas général la formation de produit n'est en fait pas irréversible. La réaction enzymatique est plus correctement décrite comme

En général, l'hypothèse d'irréversibilité est bonne dans les situations où l'un des énoncés ci-dessous est vrai :

1. La concentration de substrat(s) est très supérieure à la concentration de produits : [ S ] ≫ [ P ] ⋅ >>

C'est vrai en standard in vitro conditions de dosage, et c'est vrai pour de nombreux in vivo réactions biologiques, en particulier lorsque le produit est continuellement éliminé par une réaction ultérieure.

2. L'énergie libérée dans la réaction est très grande, c'est-à-dire Δ G ≪ 0. ll 0.>

Dans les situations où aucune de ces deux conditions n'est vérifiée (c'est-à-dire que la réaction est de faible énergie et qu'un pool substantiel de produit(s) existe), l'équation de Michaelis-Menten s'effondre et des approches de modélisation plus complexes prennent explicitement les réactions directes et inverses. doit être pris en compte pour comprendre la biologie enzymatique.

Avant que des outils informatiques permettant d'effectuer une régression non linéaire ne soient disponibles, des méthodes graphiques impliquant la linéarisation de l'équation ont été utilisées. Un certain nombre d'entre eux ont été proposés, y compris le diagramme d'Eadie-Hofstee, le diagramme de Hanes-Woolf et le diagramme de Lineweaver-Burk, le diagramme de Hanes-Woolf est le plus précis. [28] Cependant, bien qu'utiles pour la visualisation, les trois méthodes déforment la structure d'erreur des données et sont inférieures à la régression non linéaire. [29] En supposant une erreur similaire dv 0 > sur v 0 > , une représentation inverse conduit à une erreur de dv 0 / v 0 2 /v_<0>^<2>> sur 1 / v 0 > (Propagation de l'incertitude). Sans une estimation correcte des valeurs d v 0 >, la linéarisation doit être évitée. De plus, l'analyse de régression utilisant les moindres carrés suppose que les erreurs sont normalement distribuées, ce qui n'est pas valide après une transformation des valeurs v 0 >. Néanmoins, leur utilisation peut encore être trouvée dans la littérature moderne. [30]

En 1997, Santiago Schnell et Claudio Mendoza ont suggéré une solution sous forme fermée pour l'analyse de la cinétique temporelle de la cinétique de Michaelis-Menten basée sur la solution de la fonction Lambert W. [31] À savoir,

W est la fonction de Lambert W et

L'équation de Michaelis-Menten a été utilisée pour prédire le taux de formation de produits dans les réactions enzymatiques pendant plus d'un siècle. Plus précisément, il indique que la vitesse d'une réaction enzymatique augmentera à mesure que la concentration du substrat augmente, et qu'une déconnexion accrue des complexes enzyme-substrat diminuera la vitesse de réaction. Alors que la première prédiction est bien établie, la seconde est plus insaisissable. L'analyse mathématique de l'effet de la déliaison enzyme-substrat sur les réactions enzymatiques au niveau d'une molécule unique a montré que la déliaison d'une enzyme d'un substrat peut réduire la vitesse de formation du produit dans certaines conditions, mais peut également avoir l'effet inverse. Au fur et à mesure que les concentrations de substrat augmentent, un point de basculement peut être atteint où une augmentation de la vitesse de déliaison entraîne une augmentation, plutôt qu'une diminution, de la vitesse de réaction. Les résultats indiquent que les réactions enzymatiques peuvent se comporter d'une manière qui viole l'équation classique de Michaelis-Menten, et que le rôle de la déliaison dans la catalyse enzymatique reste encore à déterminer expérimentalement. [34]


E2. Principes de base de l'analyse du contrôle métabolique (ACM)

  • Contribution de Henry Jakubowski
  • Professeur (Chimie) au Collège de St. Benedict/St. John's University

Une variété d'entrées est requise pour de telles analyses informatiques :

une. Chemins définis. Ceux-ci sont disponibles dans de nombreuses bases de données. Un exemple de voies KEGG pour la glycolyse de levure est présenté ci-dessous

b. Un programme de modélisation informatique pour saisir tous les paramètres, équations, modèles et calculer les concentrations pour toutes les espèces en fonction du temps. Les programmes gratuits et téléchargeables qui le font incluent COPASI, Virtual Cell et Cell Designer. Un exemple de modèle cartographié de Cell Designer pour la glycolyse de levure avec plusieurs réactions supplémentaires dérivées de la voie glycolytique classique est présenté ci-dessous.

Les résultats des calculs des analyses de la glycolyse de la levure n'ont pu s'adapter aux données expérimentales que s'ils étaient corrigés par l'ajout de plusieurs réactions de branchement (illustrées dans les figures ci-dessus et ci-dessous) :

c. Une liste de toutes les espèces impliquées dans la voie (montrée dans la figure ci-dessous pour les réactions de glycolyse et de ramification).

ré. Une liste de toutes les réactions (ci-dessous pour les réactions de glycolyse et de ramification, tirée de COPASI)

e. Paramètres de toutes les espèces. Un exemple est présenté ci-dessous pour l'hexokinase (tiré de COPASI).

F. Équations qui peuvent être utilisées pour calculer l'évolution des concentrations de toutes les espèces avec le temps. Ce sont généralement des équations différentielles ordinaires (EDO) comme décrit dans le chapitre 6B - Cinétique des réactions simples et catalysées par des enzymes, sections B1 : Réactions à une seule étape.) Les EDO sont faciles à écrire mais nécessitent un ordinateur pour les résoudre à mesure que le nombre d'espèces en interaction augmente. .

Un exemple de réaction chimique et un ensemble d'EDO pour chaque espèce sont présentés ci-dessous.

Si une réaction supprime l'espèce X, le côté droit de l'ODE pour la disparition de cette espèce a un signe &ndash pour ce terme. De même, si une réaction augmente l'espèce X, le membre de droite a un signe +. Les exemples ci-dessus montrent des réactions unimoléculaires (C à D, C à A + B) et bimoléculaires (A+B à C).

Un exemple d'ODE tiré de COPASI est montré ci-dessous pour le changement de concentration de glucose-6-phosphate.

Des bases de données contenant des modèles organisés avec toutes les informations ci-dessus ont été développées pour de nombreuses voies. Le modèle de glycolyse de levure décrit ci-dessus se trouve dans la base de données Biomodels. Le modèle, BIOMD0000000064, peut être téléchargé en tant que fichier de langage de balisage de biologie des systèmes (SBML) et importé dans l'un des programmes décrits ci-dessus.
Les graphiques ci-dessous montrent les concentrations pour certaines espèces et toutes les espèces en fonction du temps pour la glycolyse de levure en utilisant COPASI.


1 Analyse cinétique à l'état transitoire des voies de réaction enzymatique

Ce chapitre fournit une justification pour la conception et l'interprétation d'expériences cinétiques transitoires pour établir des voies enzymatiques par analyse directe des étapes de réaction individuelles. À bien des égards, la cinétique transitoire est simple et les résultats expérimentaux peuvent être compris en termes de principes simples dérivés de la cinétique de premier ordre. L'application de ces méthodes à la cinétique enzymatique est illustrée par un certain nombre d'exemples. Ceci est particulièrement utile pour les cas dans lesquels les données cinétiques pourraient être adaptées à un seul modèle complet, le plus notable étant la 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase, ADN polymérase et tryptophane synthase. L'application de méthodes cinétiques transitoires à la solution des mécanismes enzymatiques s'est accrue en raison des progrès récents de l'instrumentation et de la surexpression et de la purification de nouvelles enzymes. La cinétique transitoire devient la méthode de choix pour l'évaluation des mutants enzymatiques dirigés vers le site et pour les questions détaillées concernant les relations entre la structure des protéines et la fonction observable. En conjonction avec les progrès des méthodes d'analyses structurelles et génétiques, l'analyse cinétique des états transitoires constitue la base de ce que l'on pourrait appeler la « nouvelle enzymologie ». Le danger dans l'interprétation des données cinétiques provient de la tendance à inclure une étape de réaction supplémentaire pour expliquer un résultat cinétique inhabituel, alors que souvent le nouveau résultat aurait pu être expliqué par un modèle plus simple basé sur une compréhension plus approfondie des subtilités de la cinétique. .


Discussion

L'activité enzymatique indirectement mesurée par l'augmentation de la température a suivi un modèle de cinétique enzymatique standard comme prévu. Nous pensons que les procédures de laboratoire présentées ici résolvent plusieurs défis pour l'enseignement de la cinétique enzymatique dans le laboratoire d'introduction à la biologie. Premièrement, les procédures sont simples et peu coûteuses. L'équipement et les fournitures nécessaires peuvent être facilement obtenus et aucune formation spéciale n'est requise pour leur utilisation. Par conséquent, ces exercices peuvent être utilisés avec des apprenants à de nombreux niveaux différents et dans divers types d'institutions. Deuxièmement, aucune matière dangereuse n'est utilisée dans ces procédures, ce qui élimine les risques pour les étudiants et la nécessité de pratiques d'élimination spécialisées. Enfin, ces procédures fournissent des données quantitatives robustes et hautement reproductibles que les étudiants peuvent utiliser pour une analyse graphique.

Les graphiques peuvent être initiés en classe avec les conseils d'un instructeur ou donnés comme devoirs, selon le niveau académique des étudiants. Nous concluons que ces procédures s'alignent sur l'accent mis actuellement sur le développement des compétences quantitatives dans l'enseignement de la biologie (Comité AAMC-HHMI, 2009 Labov et al., 2010 Woodin et al., 2010).

Les activités proposées ici peuvent être suivies d'un exercice d'enquête guidée dans lequel les étudiants reçoivent la procédure de base, puis ils conçoivent une enquête pour mesurer l'altération de l'activité enzymatique par des variations sur les facteurs examinés au cours de la première semaine. La compréhension de l'étudiant de la procédure de base peut être évaluée avec un bref questionnaire ou une discussion en classe, permettant à l'instructeur de clarifier tout point de confusion. Des équipes d'étudiants peuvent alors être chargées de concevoir des procédures pour examiner les effets de diverses manipulations sur l'activité de cette enzyme. Par exemple, les élèves peuvent choisir d'évaluer l'effet de 10 × substrat ou 0,25 × concentration d'enzyme ou pH 9. Dans cette situation, la procédure de base sert de point de départ, et les élèves doivent appliquer leur compréhension de la cinétique enzymatique et des pratiques scientifiques dans afin de résoudre le problème.

Pour les étudiants plus jeunes ou ceux qui ont une expérience limitée de la conception expérimentale, il peut être nécessaire pour l'instructeur de suggérer ou d'attribuer directement la conception de certaines procédures aux groupes. Par exemple, un groupe pourrait être chargé d'étudier l'effet du changement de pH et un autre d'étudier l'effet du changement de concentration du substrat. Les étudiants plus matures peuvent se voir offrir plus de liberté pour concevoir des procédures en fonction de leurs propres connaissances et intérêts. De plus, les étudiants plus avancés peuvent également choisir d'étudier de nouveaux facteurs, tels que les inhibiteurs compétitifs ou non compétitifs. L'instructeur sera disponible pour des conseils pendant la période de classe, mais les étudiants eux-mêmes sont responsables de la sélection des paramètres expérimentaux appropriés, y compris le temps, la température, le pH, le nombre d'échantillons et les contrôles. Une fois que leur conception expérimentale est approuvée par l'instructeur, les étudiants peuvent réellement effectuer leurs procédures et partager leur conception expérimentale et les données obtenues avec d'autres groupes de la classe. Cela présente une opportunité d'enseignement par les pairs, et donc un outil d'engagement des étudiants. Parce que les résultats sont quantitatifs, ils peuvent entreprendre une analyse graphique de leurs conclusions. En guise d'évaluation finale, les étudiants peuvent effectuer un travail écrit tel qu'un rapport de laboratoire. Rissing et Cogan (2009) ont signalé des gains d'apprentissage significatifs chez les étudiants qui ont participé à un module de laboratoire d'enquête guidée similaire, par rapport aux étudiants qui ont participé à un exercice de laboratoire de style « livre de cuisine » standard.

En conclusion, un processus économique et non dangereux peut être utilisé pour étudier quantitativement la cinétique enzymatique. De plus, ce processus peut être augmenté pour augmenter l'investissement des étudiants si les étudiants ont la possibilité de concevoir leurs propres expériences et d'évaluer des paramètres au-delà de ceux dictés par un manuel de laboratoire. L'activité sert d'activité d'apprentissage expérientiel puisque les élèves apprennent en éditant la conception expérimentale, en effectuant leurs propres expériences et en présentant les résultats sous forme graphique. Pour que cette activité en équipe soit réalisée avec succès, les étudiants doivent penser de manière critique, résoudre les problèmes liés à l'expérience et être ouverts et utiliser les commentaires de l'instructeur directeur.


Principe:


L'enzyme &alpha Amylase peut catalyser l'hydrolyse de la liaison interne &alpha -1,4-glycosidique présente dans l'amidon avec la production de sucres réducteurs. Dans l'étude de la concentration du substrat sur la cinétique enzymatique, l'enzyme est maintenue constante alors que la concentration d'amidon est prise dans l'ordre croissant. Au fur et à mesure que la concentration du substrat augmente, la quantité de produits produits dans chaque tube successif augmente également. This was explained by Michealis and others that an enzyme catalyzed reaction at varying substrate concentrations is diphasic i.e. at low substrate concentration the active sites on molecules (enzyme) are not occupied by substrate and the enzyme rate varies with substrate molecules concentration (phase1). As the number of substrate molecules increases, the enzyme attains the saturation level, since there is no more reaction sites remaining for binding. So the enzyme can work with full capacity and its reaction rate is independent of substrate concentration. (Phase II).


This Enzyme &ndash substrate reaction can be determined by measuring the increase in reducing sugars using the 3, 5 Dinitro salycilic acid reagent. In an alkaline condition, the pale yellow colored the 3, 5- dinitro salicylic acid undergo reduction to yield orange colored 3- amino -5-nitrosalicylic acid. The absorbance of resultant solutions is read at 540nm. The intensity of color depends on the concentration of reducing sugars produced.


&alpha Amylase
Starch Maltose + glucose


Voir la vidéo: ENZYMOLOGIE: Cinétique enzymatique, ce quil faut maîtriser! (Janvier 2022).