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B1. Analyse des acides aminés et séquençage chimique - Biologie


Comme décrit dans l'Introduction aux protéines, nous pouvons comprendre la structure des protéines à différents niveaux de complexité.

Figure : Analyse des protéines de faible à haute résolution.

Dans la dernière section du chapitre, nous avons appris les propriétés de charge et de réactivité chimique des acides aminés isolés et des acides aminés dans les protéines. L'analyse d'une protéine entière est compliquée car chaque acide aminé différent peut être représenté plusieurs fois dans la séquence. Chaque protéine a un acide aminé N-terminal et C-terminal et une structure secondaire. Certaines protéines existent biologiquement sous forme de protéines multi-sous-unités, ce qui ajoute à la complexité des analyses puisque maintenant les protéines auraient plusieurs extrémités N- et C-terminales. De plus, les protéines isolées peuvent avoir des modifications chimiques (post-traductionnelles) qui s'ajoutent aux fonctionnalités des protéines mais ajoutent également à la complexité des analyses. Pour illustrer certains de ces problèmes, consultez la structure du programme RhoA ci-dessous.

Mise à jour RhoA - une protéine cytoplasmique - La complexité de l'analyse des protéines Jmol14 (Java) | JSMol (HTML5)


Composition en acides aminés

À un faible niveau de résolution, nous pouvons déterminer la composition en acides aminés de la protéine en hydrolysant la protéine dans 6 N HCl, 100oC, sous vide pendant divers intervalles de temps. Après élimination du HCl, l'hydrolysat est appliqué sur une colonne échangeuse d'ions ou d'interaction hydrophobe, et les acides aminés sont élués et quantifiés par rapport aux standards connus. Un acide aminé non naturel comme la norleucine est ajouté en quantités connues en tant qu'étalon interne pour surveiller la récupération quantitative au cours des réactions. Les acides aminés séparés sont souvent dérivés avec de la ninhydrine ou du phénylisothiocyanant pour faciliter leur détection. La réaction est généralement autorisée à se dérouler pendant 24, 36 et 48 heures, car les acides aminés avec OH (comme ser) sont détruits. Une évolution temporelle permet d'extrapoler la concentration de Ser au temps t=0. Trp est également détruit pendant le processus. De plus, les liaisons amide dans les chaînes latérales de Gln et Asn sont hydrolysées pour former respectivement Glu et Asp.

  • Analyse AA : Iowa State University Protein Facility

Analyse des acides aminés N- et C-terminaux

La composition en acides aminés ne donne pas la séquence de la protéine. L'extrémité N-terminale de la protéine peut être déterminée en faisant réagir la protéine avec du fluorodinitrobenzène (FDNB) ou du chlorure de dansyle, qui réagit avec n'importe quelle amine libre dans la protéine, y compris le groupe epsilon amino de la lysine. Le groupement amino de la protéine est lié au cycle aromatique du DNB par une amine et au groupement dansyle par un sulfonamide, et sont donc stables à l'hydrolyse. La protéine est hydrolysée dans HCl 6 N, et les acides aminés séparés par CCM ou HPLC. Deux taches devraient se produire si la protéine était une chaîne unique, avec quelques résidus Lys. L'acide aminé marqué autre que Lys est l'acide aminé N-terminal. L'acide aminé C-terminal peut être déterminé par addition de carboxypeptidases, enzymes qui clivent les acides aminés du C-terminal. Une chronologie doit être effectuée pour voir quel acide aminé est libéré en premier. L'analyse N-terminale peut également être effectuée dans le cadre du séquençage de la protéine entière comme discuté ci-dessous (réaction de dégradation d'Edman).

Analyse d'acides aminés spécifiques

Les acides aminés aromatiques peuvent être détectés par leurs profils d'absorbance caractéristiques. Les acides aminés avec des groupes fonctionnels spécifiques peuvent être déterminés par des réactions chimiques avec des groupes modificateurs spécifiques, comme indiqué dans la section 2A.

Figure : profils d'absorbance des acides aminés

Séquence d'acides aminés - Dégradation d'Edman

Deux méthodes existent pour déterminer la séquence entière d'une protéine. Dans l'un, la protéine est séquencée ; dans l'autre, l'ADN codant pour la protéine est séquencé, à partir duquel la séquence d'acides aminés peut être dérivée. La protéine en fait peut être séquencée par dégradation d'Edman séquentielle automatisée.

Figure : Dégradation d'Edman

Dans cette technique, une protéine adsorbée sur une phase solide réagit avec l'isothiocyanate de phényle. Il en résulte une cyclisation intramoléculaire et un clivage des acides aminés N-terminaux, qui peuvent être lavés de la protéine adsorbée et détectés par analyse HPLC. Les rendements de cette technique sont proches de 100 %. Cependant, avec le temps, davantage de chaînes s'accumulent dans lesquelles un acide aminé N-terminal n'a pas été éliminé. S'il est retiré à l'étape suivante, deux acides aminés seront élués, créant un "bruit" croissant dans l'étape d'élution - c'est-à-dire que plus d'un dérivé d'acide aminé sera détecté. Ainsi, la longueur maximale du peptide pouvant être séquencé est d'environ 50 acides aminés. La plupart des protéines sont plus grosses que cela. Par conséquent, avant que la protéine puisse être séquencée, elle doit être clivée avec des enzymes spécifiques appelées endoprotéases qui clivent les protéines après des chaînes latérales spécifiques. Par exemple, la trypsine clive les protéines dans une chaîne après Lys et Arg, tandis que la chymotrypsine clive après les acides aminés aromatiques, comme Trp, Tyr et Phe. Le clivage chimique par de petites molécules peut également être utilisé. Le bromure de cyanogène, CNBr, clive les protéines après les chaînes latérales de la méthionine. Les protéines individuelles doivent être clivées en utilisant deux méthodes différentes, et chaque fragment peptidique doit être isolé et séquencé. Ensuite, l'ordre des peptides clivés avec une séquence connue peut être reconstitué en comparant les séquences peptidiques obtenues en utilisant différentes méthodes de clivage. De nombreuses protéines ont également des liaisons disulfure reliant les chaînes latérales Cys distales les unes aux autres dans la chaîne polypeptidique. Le clivage protéolytique ou chimique de la protéine conduirait à la formation d'un fragment contenant deux peptides liés par des disulfures. La dégradation d'Edman libérerait deux acides aminés de ces fragments. Pour éviter ce problème, la protéine est oxydée avec de l'acide performique, qui oxyde de manière irréversible la Cys libre, ou les disulfures Cys-Cys en résidus d'acide cystéique. Un résumé des étapes impliquées dans le séquençage des protéines est présenté ci-dessous :

STRATÉGIE DE SÉQUENÇAGE DES PROTÉINES - 8 ÉTAPES

  1. Si la protéine contient plus d'une chaîne polypeptidique, les chaînes sont séparées et purifiées. Si des liaisons disulfure relient deux chaînes différentes, la liaison S-S doit être clivée (comme décrit à l'étape 2) et chaque peptide purifié indépendamment.
  2. Les liaisons intrachaînes S-S entre les chaînes latérales Cys sont clivées avec de l'acide performique. (Voir ci-dessus pour les liaisons interchaînes S-S).
  3. La composition en acides aminés de chaque chaîne est déterminée
  4. Les résidus N-terminaux et C-terminaux sont identifiés.
  5. Chaque chaîne polypeptidique est clivée en fragments plus petits, et la composition en acides aminés et la séquence de chaque fragment sont déterminées.
  6. L'étape 5 est répétée, en utilisant une procédure de clivage différente pour générer un ensemble différent et chevauchant de fragments peptidiques.
  7. La séquence globale d'acides aminés de la protéine est reconstruite à partir des séquences en fragments chevauchants.
  8. La position du S-S est localisée. (Voir l'ensemble de problèmes en ligne - Protéines)

Identification de nouveaux déterminants de date d'épiaison dans le chromosome 5B du blé

La variabilité de la date d'épiaison peut aider à l'adaptation du blé aux environnements locaux. Par la suite, la découverte de nouveaux déterminants de la date d'épiaison est importante pour l'amélioration des céréales. Dans cette étude, nous avons utilisé le cultivar de blé commun Chinese Spring (CS) et la lignée de substitution de CS avec le chromosome 5B de T. dicoccoides (CS-5Bdic), différents dans leur date d'épiaison de deux semaines, pour détecter les déterminants de la date d'épiaison sur le chromosome 5B.

Résultats

L'influence possible de la VRN-B1 gène, le plus puissant régulateur de la floraison, situé sur le chromosome 5B, aux différences de temps d'épiaison entre CS et CS-5Bdic a été étudié. Le séquençage de ce gène à partir de CS-5Bdic a montré qu'une insertion d'un triplet de nucléotides produisait un acide aminé supplémentaire dans la protéine correspondante. Aucun changement dans les niveaux de transcription de chaque homéologue VRN-1 loci ont été trouvés dans CS-5Bdic par comparaison avec CS. Pour déterminer les loci déterminant la différence de date d'épiaison, un ensemble de 116 lignées chromosomiques 5' consanguines recombinantes résultant de l'hybridation de CS avec CS-5Bdic a été développé et leurs dates d'épiaison ont été estimées. À l'aide de la plate-forme Illumina Infinium 15 k Wheat, 379 marqueurs polymorphes spécifiques à 5B ont été détectés et une carte génétique avec 82 marqueurs squelettiques a été construite. Phénotype (date d'épiaison) - l'analyse d'association de génotypes a révélé soixante-dix-huit marqueurs dans la région péricentromérique du chromosome 5B significativement associés à la variation de la date d'épiaison. Sur la base de cette estimation et de la synténie avec les génomes des cultures modèles, nous avons identifié les trois meilleurs gènes candidats : WRKY, FER/AP2 et FHY3/FAR1.

Conclusion

Nous avons supposé que la différence d'activité de WRKY, FER/AP2 et/ou FHY3/FAR1 facteurs de transcription entre CS et CS-5Bdic comme étant une raison probable de la différence observée dans les dates d'épiaison. Les données obtenues dans cette étude fournissent une bonne base pour l'étude ultérieure des chemins d'épiaison chez le blé.


Résumé

Nous décrivons une nouvelle protéine pénétrant les cellules, B1, capable de délivrer des protéines conjuguées et des acides nucléiques dans les cellules de mammifères. B1 est un produit de 244 acides aminés d'un décalage du cadre de lecture d'une seule base dans le gène codant pour la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP). La molécule a une charge positive nette de 43 et un rapport charge/masse très élevé de 1,5. B1 fusionné avec l'eGFP pénètre puissamment dans les cellules adhérentes et en suspension avec >80% des cellules absorbant la protéine lorsqu'elles sont exposées à des concentrations aussi faibles que 1 M. La protéine s'est avérée se regrouper dans la région paranucléaire des cellules TZM-bl. Plus important encore, nous montrons que B1 facilite non seulement l'absorption cellulaire, mais permet également à la cargaison biomoléculaire d'atteindre des sites d'importance biologique. Par exemple, des cellules rénales de bébé hamster ont subi une recombinaison d'ADN lorsqu'elles ont été exposées à la recombinase Cre marquée par B1 à des concentrations de protéines aussi faibles que 2,5 M, ce qui indique une puissante délivrance nucléaire de cargaisons de protéines fonctionnelles. De plus, B1 délivre de l'ARN et de l'ADN conjugués de manière non covalente à travers la membrane cellulaire vers des sites cytosoliques et nucléaires accessibles à la machinerie de traduction et de transcription cellulaire, comme mesuré par la détection des fonctions de rapporteur codées, avec une efficacité comparable aux réactifs lipidiques cationiques disponibles dans le commerce. B1 semble utiliser les glycanes de la surface cellulaire et de multiples voies endocytaires concurrentes pour entrer et circuler à travers les cellules. Ces études fournissent à la fois un nouvel outil pour l'administration intracellulaire de biomolécules et des informations qui pourraient aider à la conception de protéines de pénétration cellulaire plus efficaces.


L'approche classique commence par la mutagenèse aléatoire

Avant l'avènement de la technologie de clonage de gènes, la plupart des gènes étaient identifiés par les processus interrompus lors de la mutation du gène. Cette approche génétique classique pour identifier les gènes responsables des phénotypes mutants est plus facilement réalisée dans des organismes qui se reproduisent rapidement et se prêtent à la manipulation génétique, tels que les bactéries, les levures, les vers nématodes et les mouches des fruits. Bien que des mutants spontanés puissent parfois être trouvés en examinant des populations extrêmement importantes, des milliers ou des dizaines de milliers d'organismes individuels, le processus d'isolement des mutants peut être rendu beaucoup plus efficace en générant des mutations avec des agents qui endommagent l'ADN. En traitant des organismes avec des mutagènes, de très grands nombres de mutants peuvent être créés rapidement et ensuite criblés pour un défaut particulier d'intérêt, comme nous le verrons bientôt.

Une approche alternative à la mutagenèse chimique ou radiologique est appelée mutagenèse insertionnelle. Cette méthode repose sur le fait qu'un ADN exogène inséré au hasard dans le génome peut produire des mutations si le fragment inséré interrompt un gène ou ses séquences régulatrices. L'ADN inséré, dont la séquence est connue, sert alors de marqueur moléculaire qui facilite l'identification et le clonage ultérieurs du gène perturbé (Figure 8-55). Dans Drosophile, l'utilisation de l'élément P transposable pour inactiver les gènes a révolutionné l'étude de la fonction des gènes chez la mouche des fruits. Des éléments transposables (voir Tableau 5-3, p. 287) ont également été utilisés pour générer des mutants dans des bactéries, des levures et dans la plante à fleurs Arabidopsis. Des rétrovirus, qui se copient dans le génome de l'hôte (voir la figure 5-73), ont été utilisés pour perturber des gènes chez le poisson zèbre et la souris.

8-55

Mutant d'insertion du muflier, Muflier. Une mutation dans un seul gène codant pour une protéine régulatrice provoque le développement de pousses feuillues à la place des fleurs. La mutation permet aux cellules d'adopter un caractère qui conviendrait à un autre (suite. )

De telles études sont bien adaptées pour disséquer les processus biologiques chez les vers et les mouches, mais comment pouvons-nous étudier la fonction des gènes chez l'homme ? Contrairement aux organismes dont nous avons parlé, les humains ne se reproduisent pas rapidement et ils ne sont pas intentionnellement traités avec des mutagènes. De plus, tout humain présentant un défaut grave dans un processus essentiel, tel que la réplication de l'ADN, mourrait bien avant la naissance.

Il y a deux réponses à la question de savoir comment nous étudions les gènes humains. Premièrement, parce que les gènes et les fonctions des gènes ont été si hautement conservés tout au long de l'évolution, l'étude d'organismes modèles moins complexes révèle des informations essentielles sur des gènes et des processus similaires chez l'homme. Les gènes humains correspondants peuvent ensuite être étudiés plus avant dans des cellules humaines en culture. Deuxièmement, de nombreuses mutations qui ne sont pas des défauts mortels spécifiques aux tissus dans les lysosomes ou dans les récepteurs de la surface cellulaire, par exemple, sont apparues spontanément dans la population humaine. Les analyses des phénotypes des individus affectés, ainsi que les études de leurs cellules cultivées, ont fourni de nombreuses informations uniques sur les fonctions cellulaires humaines importantes. Bien que de telles mutations soient rares, elles sont découvertes très efficacement en raison d'une propriété humaine unique : les individus mutants attirent l'attention sur eux-mêmes en recherchant des soins médicaux spéciaux.


B1. Analyse des acides aminés et séquençage chimique - Biologie

Les sémaphorines et leurs récepteurs, les plexines, sont largement exprimés dans les tissus embryonnaires et adultes. En général, leurs fonctions sont mal caractérisées, mais dans les neurones, ils fournissent des signaux attractifs et répulsifs essentiels qui sont nécessaires au guidage axonal 1, 2, 3. Les GTPases de la famille Rho Rho, Rac et Cdc42 contrôlent les voies de transduction du signal qui relient les récepteurs de la membrane plasmique. au cytosquelette d'actine et ainsi réguler de nombreux processus induits par l'actine, y compris la migration cellulaire et le guidage axonal 4, 5, 6, 7. En utilisant le criblage à deux hybrides de levure et des tests d'interaction in vitro, nous montrons que Rac dans son état actif lié au GTP interagit directement avec le domaine cytoplasmique des mammifères et Drosophile plexines B. Le regroupement de la plexine-B1 dans les fibroblastes ne provoque pas la formation de lamellipodes, ce qui suggère que Rac n'est pas activé. Au lieu de cela, il en résulte l'assemblage de filaments d'actine:myosine et la contraction cellulaire, ce qui indique l'activation de Rho. Étonnamment, ces modifications du cytosquelette dépendent à la fois de Rac et de Rho. Le regroupement d'une plexine mutante, dépourvue de la région de liaison Rac, a induit des changements cytosquelettiques similaires, et cette découverte indique que l'interaction physique de la plexine-B1 avec Rac n'est pas requise pour l'activation de Rho. Nos découvertes selon lesquelles la signalisation de la plexine-B au cytosquelette dépend à la fois de Rac et de Rho constituent un point de départ pour démêler le mécanisme par lequel les sémaphorines et les plexines contrôlent le guidage axonal et la migration cellulaire.

Adresse actuelle : §Division of Cell Biology, The Netherlands Cancer Institute, Amsterdam 1066 CX, Pays-Bas.


Discussion

Dans cette étude, nous avons élucidé la région auto-inhibitrice exacte (brin β B1 et hélice H2) dans l'extrémité N-terminale d'EcoRII qui fonctionne apparemment comme un frein moléculaire et régule l'activité enzymatique par autoinhibition. La perte de B1 et H2 par mutagenèse par délétion a soulagé l'autoinhibition et conduit à des variants enzymatiques EcoRII hautement activés qui ont clivé des sites uniques très éloignés dans l'ADN du phage T3. Ce comportement s'est avéré être en contraste avec l'EcoRII pleine longueur, qui nécessite au moins deux copies de la séquence de reconnaissance pour le clivage de l'ADN ( Mucke et al., 2002a Tamulaitis et al., 2006 ). Notre étude confirme le modèle proposé déduit d'une forme tronquée et donc activée d'EcoRII ( Mucke et al., 2002a ) et la structure cristalline ( Zhou et al., 2004 ). De plus, nos résultats utilisant la répression d'EcoRII-C par le domaine inhibiteur EcoRII-N ou de petits peptides synthétiques en trans et la mutagenèse spécifique au site définissent la région régulatrice minimale essentielle pour l'autoinhibition.

L'autoinhibition est un phénomène répandu dans la régulation biologique et a été vérifiée pour diverses protéines, par ex. facteurs de transcription, protéines kinases, hélicases de réparation, proto-oncogènes et dicer humain ( Pufall et Graves, 2002 Smith et al., 2007 Li et al., 2008 Ma et al., 2008 Richard et al., 2008 ). EcoRII a été la première endonucléase de restriction pour laquelle l'autoinhibition a été proposée ( Zhou et al., 2004 ). Pendant ce temps, un mécanisme similaire a été revendiqué pour l'endonucléase de restriction tétramère Bse634I ( Zaremba et al., 2005 ) et pour l'enzyme de restriction métal-indépendante BfiI. Dans le cas de Bse634I, l'autoinhibition a été supprimée par la séparation de l'enzyme tétramère en dimères par mutation spécifique au site ( Zaremba et al., 2005 ). Bien que BfiI contienne un domaine de liaison à l'ADN C-terminal très similaire à EcoRII-N, la structure cristalline suggère que le lieur interdomaine peut agir comme un élément auto-inhibiteur contrôlant l'activité catalytique de BfiI en l'absence d'ADN spécifique ( Grazulis et al., 2005 ).

La plupart des modèles mécanistes d'autoinhibition prédisent l'existence d'interactions intramoléculaires entre les éléments inhibiteurs et le domaine fonctionnel. Ce modèle d'interaction intramoléculaire en général peut être testé expérimentalement en utilisant les domaines séparés ou les mutations qui perturbent ces interactions ( Pufall et Graves, 2002 ). Le fait que le domaine N a ajouté en trans provoque une diminution de l'activité d'EcoRII-C et n'affecte pas l'isochizomère MvaI, suggère une interaction protéine-protéine spécifique entre les domaines N et C, ce qui conduit à l'inactivation d'EcoRII-C. Pour réprimer complètement EcoRII-C, un excès molaire du domaine inhibiteur EcoRII-N est nécessaire qui imite probablement l'attache des deux domaines dans EcoRIIwt. La diminution marginale de l'activité de clivage dans l'expérience MvaI avec la concentration la plus élevée d'EcoRII-N peut être due à la liaison d'EcoRII-N au site de reconnaissance et donc en compétition avec MvaI, ou à des interactions protéine-protéine non spécifiques. Contrairement à MvaI, la diminution du clivage par EcoRII-C par des quantités stoechiométriques d'EcoRII-N soutient une relation protéine-protéine spécifique entre les deux domaines.

Les substitutions d'acides aminés simples E145A, S173A et E351A montrent clairement qu'une rupture des liaisons hydrogène inter-domaines simples réduit l'effet de répression. La dérépression partielle est apparemment due à une interruption incomplète de l'interaction protéine-protéine entre les domaines N- et C-terminal d'EcoRII. Pour l'enzyme mutante E351A, l'effet fonctionnel observé ne peut pas être expliqué par une perte de liaisons hydrogène entre les chaînes principales de Glu351 et Ala27 car elles seront conservées même lorsque l'acide glutamique est muté en alanine. Cependant, le soulagement partiel de l'autoinhibition peut être causé par la perte du réseau étendu de liaisons hydrogène entre la chaîne latérale de Glu351, Arg24 et Gly158 médiée par les molécules d'eau ( McDonald et Thornton, 1994 Wallace et al., 1995 ). La création des doubles mutants EcoRII E145A/S173A, E145A/E351A, E145A/S354A, S173A/E351A et S173A/S354A n'a montré aucun effet additif. Cette découverte a également été rapportée par Reichmann et al. (2005) qui ont étudié les interactions protéine-protéine entre la TEM1-β-lactamase et la protéine inhibitrice de la β-lactamase par des analyses en grappes. Ils ont signalé que des mutations uniques à l'intérieur du même groupe d'interactions ne sont pas nécessairement additives.

Les expériences peptidiques ont été réalisées pour déterminer si ces molécules synthétiques plutôt petites peuvent imiter des parties de l'interface inter-domaine d'EcoRII et, par conséquent, peuvent inhiber EcoRII-C. Les peptides 30-mères solubles utilisés représentaient les positions d'acides aminés dérivées d'EcoRII 4 à 33 (peptide 1) et 144 à 173 (peptide 2) respectivement. Le peptide 1 contient Ser26 et Ala27, qui devraient interagir avec Glu351. Le peptide 2 contient Glu145 et Ser173, qui devraient interagir avec Arg330 et Arg262 (Fig. 2). Nous avons constaté que le peptide 1 inhibe complètement l'activité d'EcoRII-C et, en revanche, n'a aucun effet sur l'isochizomère MvaI. L'expérience avec le peptide de contrôle 3 confirme nos résultats selon lesquels l'inhibition provoquée par le peptide 1 est spécifique et pas seulement un effet artificiel des peptides en général. Bien que les deux peptides dérivés d'EcoRII représentent des régions du domaine N qui interagissent avec le domaine actif catalytique ( Zhou et al., 2004), seul le peptide 1 montre un effet inhibiteur sur EcoRII-C. Par conséquent, nous avons conclu que le peptide 1 doit jouer un rôle crucial dans le processus d'autoinhibition.

Par délétion consécutive des trois éléments structuraux secondaires constituant le peptide 1 (hélice α H1, brin B1 et hélice H2), nous avons pour la première fois élucidé l'élément auto-inhibiteur exact d'EcoRII. Le court brin β B1 (acides aminés 18-24) et l'hélice H2 (acides aminés 26-30) séparés uniquement par un seul acide aminé sont des éléments de contrôle essentiels pour maintenir l'activité enzymatique d'EcoRII étroitement réprimée en l'absence d'ADN spécifique. Les deux enzymes mutantes de délétion ont montré une abolition complète de l'autoinhibition et leur schéma de clivage de l'ADN T3 était comparable à celui d'EcoRII-C. La structure cristalline d'EcoRII a montré que les résidus d'acides aminés Ser26 et Ala27 dans l'hélice H2 forment des liaisons hydrogène avec Glu351 dans l'extrémité C-terminale d'EcoRII et peuvent contribuer au blocage du site catalytique par le domaine N-terminal ( Zhou et al., 2004 ). Cependant, lors du remplacement de Glu351 par l'alanine, nous avons obtenu une enzyme mutante EcoRII avec une autoinhibition seulement partiellement soulagée. Selon la structure 3D d'EcoRII, plusieurs contacts sont formés entre B1 et H2 avec Tyr41 dont nous avons précédemment montré qu'ils étaient impliqués dans la liaison d'ADN spécifique à la séquence dans la fente effectrice d'EcoRII ( Mucke et al., 2002b ) Tyr21 et Lys23 dans B1 et Asp29 dans H2 interagissent par des liaisons hydrogène avec Tyr41. Apparemment, en formant des liaisons hydrogène entre H2 et B2 avec Tyr41, un pli d'inhibition est formé. Si une séquence de reconnaissance d'ADN EcoRII est liée par le domaine N-terminal, Tyr41 forme des interactions stabilisantes avec l'ADN. En raison de l'ADN lié, la distribution des charges à l'intérieur du pli d'inhibition change très probablement et entraîne une altération de la conformation, ce qui provoque une perte des liaisons hydrogène entre B1 et H2 avec Tyr41. Ce changement de conformation conduirait également à une destruction de l'interaction entre Ala27 et Glu351. Ainsi, le domaine N-terminal peut s'éloigner et révéler le site actif catalytique.

Contrairement à EcoRII-ΔB1 et EcoRII-ΔH2, l'enzyme mutante EcoRII-ΔH1 n'a pas conduit à un soulagement complet de l'autoinhibition. Cette découverte n'était pas surprenante car l'hélice H1 n'est pas fortement impliquée dans l'interaction ni avec le domaine C-terminal d'EcoRII ni avec le résidu putatif du site de liaison à l'ADN Tyr41 ( Mucke et al., 2002b Zhou et al., 2004 ). La cartographie des éléments structurels B1 et H2 en tant que déterminants répressifs entre les domaines inhibiteur et catalytique fournit une preuve d'autoinhibition pour EcoRII et nous permet de définir comment le processus d'inhibition et d'activation de l'activité enzymatique EcoRII peut être régulé.

Fréquemment, le domaine auto-inhibiteur acquiert une nouvelle fonction dans la molécule activée ( Pufall et Graves, 2002 ). Dans le cas de l'endonucléase de restriction EcoRII, il s'agit de la capacité à se lier à un second site de reconnaissance d'ADN. Ce mécanisme augmente d'une part la précision de la reconnaissance de l'ADN et protège ainsi la fonction appropriée de la protéine, mais d'autre part limite le pouvoir d'EcoRII en tant qu'endonucléase de restriction. Une conséquence bénéfique de l'exigence de deux sites de reconnaissance non méthylés pour le clivage de l'ADN est la prévention du clivage accidentel de sites non méthylés uniques dans le génome cellulaire (qui peut se produire en raison d'une méthylation ou d'une réparation incomplète de l'ADN) qui conduirait à la mort cellulaire ( Bickle et Kruger, 1993). L'interaction avec deux sites d'ADN est également connue pour les protéines impliquées dans la recombinaison et la transposition de l'ADN. En fait, des rapports antérieurs ont montré la conservation des motifs fonctionnels entre EcoRII et la famille des intégrases ( Topal et Conrad, 1993 Nunes-Duby et al., 1998 ). Par conséquent, l'acquisition d'un domaine de liaison à l'ADN supplémentaire pourrait être une étape évolutive dans l'évolution de l'endonucléase de restriction EcoRII vers une nouvelle fonction. Outre le clivage de la liaison phosphodiester, EcoRII pourrait alors réaliser la dissémination de sa séquence codante dans d'autres populations bactériennes apparentées à un élément transposable.

Fait intéressant, le pli EcoRII-N a également été trouvé dans le domaine de liaison à l'ADN B3 des facteurs de transcription spécifiques aux plantes ( Yamasaki et al., 2004 2008 ). Expériences RMN du facteur de transcription sensible au froid RAV1 de Arabidopsis thaliana a révélé, outre la similarité de séquence entre son domaine B3 et son domaine N EcoRII, également une structure tertiaire hautement conservée. Remarquablement, le domaine de liaison à l'ADN B3 de RAV1 reconnaît la séquence d'ADN double brin 5'-CA CCTG qui chevauche (en gras et souligné) avec la séquence de reconnaissance EcoRII 5'- ACC/TG G. L'emplacement des résidus en contact avec l'ADN s'est en effet avéré similaire à celui d'EcoRII-N ( Yamasaki et al., 2004 ). Comme les deux structures sont structurellement et fonctionnellement liées, cela pourrait signifier que cette famille de facteurs de transcription est également régulée par autoinhibition. Les facteurs de transcription spécifiques aux plantes sont classés selon des domaines de liaison à l'ADN que l'on croyait distincts de ceux des procaryotes ou d'autres lignées d'eucaryotes. Entre-temps, des protéines contenant des régions similaires à EcoRII-N ont été identifiées dans les génomes de plusieurs bactéries symbiotiques ou pathogènes pour les plantes supérieures. Transfert horizontal de gènes de ces bactéries à une plante à graines ancestrale, ou vice versa, pourrait être une voie putative de transfert de gènes ( Yamasaki et al., 2008 ).


Discussion

L'immunofluorescence a localisé h-tekB1 dans 2 régions primaires. Le morceau principal de sperme humain était positif sur toute sa longueur, bien que la coloration soit pratiquement absente de l'embout et de la pièce intermédiaire. La section transversale du flagelle du sperme humain varie de manière proximale à distale. La pièce intermédiaire contient une gaine mitochondriale qui entoure l'axonème avec son agencement 9+2 de microtubules. Les mitochondries cèdent la place dans la pièce principale à une gaine fibreuse autour de la structure axonémale standard. L'embout ne contient que des microtubules axonémaux entourés par le plasmalemme. En ce qui concerne la disposition des microtubules 9+2, les 2 microtubules centraux sont absents dans l'embout et les 9 microtubules externes sont présents sous forme de microtubules non appariés uniques. C'est précisément la région du flagelle du sperme humain où il y a une absence de réactivité positive à l'antisérum h-tekB1. Nojima et al. [ 19] ont émis l'hypothèse à partir d'études immunomicroscopiques de flagelles de sperme d'oursin fractionnés que la tektine pourrait être présente comme le seul constituant d'un protofilament dans la fibre A à l'interface entre les composants A et B du doublet. Leur hypothèse est étayée par notre observation de l'absence de réactivité de la tektine dans l'embout du sperme humain, soutenant la suggestion que la tektine est nécessaire à la création du doublet A-B [33]. Nos données démontrent également une absence de coloration h-tekB1 dans la pièce intermédiaire, dont la structure des microtubules axonémales est similaire à celle de la pièce principale à coloration positive. Il n'est pas clair si la tektine est présente dans les microtubules de l'axonème dans cette section car il est possible que la coloration ait été empêchée par les mitochondries des spermatozoïdes environnantes.

Une région ponctuée à la base de la tête du sperme était également positive pour h-tekB1. Cette région du sperme humain correspond au corps basal, contenant un anneau de 9 microtubules triplés accolés. Le corps basal est considéré comme un centriole et sert de point de départ à la croissance des microtubules doublet externes au cours de la morphogenèse flagellaire. En tant que tel, il est contigu au reste de l'axonème. Cette observation est en accord avec les précédentes études d'immunofluorescence montrant la réactivité des anticorps tektine avec les corps basaux dans le sperme d'oursin [34], des immunoblots de Chlamydomonas corps basaux [ 10], et préparations de corps basaux dans les cellules épithéliales trachéales des branchies de pétoncles et de lapin [ 35].

Nous avons utilisé une carte 2D complète des protéines du sperme humain [ 22] pour identifier et cloner une protéine flagellaire du sperme humain. Le protéome du sperme 2D a été construit pour comprendre et résoudre la complexité des protéines du sperme et pour sélectionner des candidats à inclure dans un vaccin immunocontraceptif. À cette fin, nous avons marqué le sperme humain avec du 125 I ou de la biotine avant la solubilisation et l'électrophorèse des extraits de sperme. La comparaison de la matrice de protéines marquées avec la carte 2D originale a été proposée pour permettre la sélection de ces composants de protéines de sperme localisés à la surface cellulaire. La tache de protéine tektine a été à l'origine creusée à partir d'une zone de taches de protéine étroitement compactées montrant au moins 6 protéines marquées au 125I. L'absence de localisation de surface du h-tekB1 que nous avons observée dans nos études d'immunolocalisation suggère que la tache creusée peut avoir été marquée au 125 I en raison de dommages à la membrane du sperme ou d'une erreur de notation d'une tache non étiquetée dans le cluster. Bien que le h-tekB1 cloné et examiné dans le présent travail ne soit pas une molécule de surface, le travail sert à définir les isoformes h-tekB1 dans le protéome du sperme humain. Nous utilisons actuellement le marquage à la biotine et la partition de phase pour enrichir les protéines de surface du sperme marquées vectoriellement [23, 36].

Les données de transfert Western 2D présentées dans cette étude indiquent qu'il existe 3 isoformes distinctes de h-tekB1 dans le sperme humain. Ces formes immunoréactives de la protéine ne diffèrent pas par la masse moléculaire (elles migrent toutes à 54 kDa) mais par la charge, indiquant qu'une certaine modification post-traductionnelle s'est produite. La masse observée du h-tekB1 est presque identique à la masse prédite à partir de la séquence d'ADNc, en accord avec une protéine cytosquelettique non glycosylée. On peut supposer que les 3 isoformes sont toutes de la tektine B humaine, car les tektines A, B et C d'autres espèces ont toujours des masses moléculaires différentes. Ces résultats corroborent les observations antérieures de microhétérogénéité dans les motifs des tektines [37]. Les changements de charge tels que ceux observés dans cette étude sont généralement dus à des changements dans les niveaux de phosphorylation. Bien que les fragments peptidiques microséquencés utilisés pour la conception d'amorces oligonucléotidiques n'aient démontré de phosphorylation sur aucun des résidus sérine ou thréonine, la tache que nous avons prélevée pour l'examen initial peut avoir été une forme non phosphorylée de la tektine B1. Cependant, la phosphorylation peut être impliquée dans cette hétérogénéité de la charge protéique car les kinases sont connues pour être importantes dans la modification post-traductionnelle d'autres protéines du sperme [38-40].

Examination of the protein sequence of h-tekB1 indicates that the highest degree of homology with a species in which all 3 tektins have been cloned is with sea urchin tektin B1. A BLOCKS search revealed a match to all 4 of the Tektin signature domains (BLOCKS PR00511A-D), providing further proof of the identity of the translated human cDNA clone. The differences in amino acid sequence between human and sea urchin tektin B1 are distributed evenly throughout the protein however, both the N- and C-termini of the human protein revealed no homology with any of the sea urchin tektins. Les S. purpuratus tektin A1 contained an extra 54 amino acids at the N-terminus and was shorter by 22 amino acids at the C-terminus, whereas sea urchin tektin C1 demonstrated only 15% homology over the first 40 amino acids with human tektin B1. In addition to sequence homology, a structural similarity to other tektins consisting of 5 helical segments [ 14] was found by analysis with secondary structure prediction programs. This secondary structure has been hypothesized to reflect the evolutionary relatedness of tektins to the intermediate filament family of proteins [ 12, 14]. A match to a chaperonin signature was discovered during database searching [ 32]. Over amino acids 253–304 in h-tekB1, there is 47% homology (20% identity) with the bacterial Clp chaperonin (BLOCKS IBP001270) subfamily, which is known to present and activate proteins for repair during stress conditions. Interesting functional correlations arise because mammalian chaperones are associated with the centrosome [ 41].

Although h-tekB1 was cloned and sequenced from testis mRNA, Northern blots revealed the presence of the transcript in pools of mRNA from trachea, lung, ovary, pituitary, brain, and kidney. Trachea, lung, and brain tissues are known from histological examination to contain many cilia. Expression of tektin B1 in tracheal tissue, lung, and neural tissue was noted previously in the mouse [ 21]. Because of the wide transcriptional distribution of this gene product and the lack of surface localization, h-tekB1 would not appear to be useful as a contraceptive immunogen. The broad tissue distribution also diminishes the likelihood that an antagonist might be found that selectively affected sperm motility by targeting tektin B1.

The single closest match in the databases was a murine tektin B1 [ 15] (accession AB027138) that showed 83% identity with the translated human clone. This murine tektin-t (testis) has been termed haploid germ cell specific based on Northern blot analysis, which demonstrated only testis transcription, and the cloning of the transcript from a subtracted murine testis cDNA library [ 15]. Our results for h-tekB1 differ with respect to tissue specificity because our cDNA, also cloned from a testicular source, is found in multiple tissues, and therefore the designation of h-tekB1 as testicular or germ cell specific is inappropriate. Differences in expression of tektin B1 in murine and human tissues may account for the discrepancies in our results and in those of Iguchi et al. [ 15]. In addition, on Western blots we observed a molecular mass of 54 kDa for h-tekB1 whereas Iguchi et al. [ 15] noted a mass of 85 kDa for murine tektin-t.


B1. Amino Acid Analysis and Chemical Sequencing - Biology

Several studies have demonstrated protein-protein interactions between microsomal triglyceride transfer protein (MTP) and apolipoprotein B (apoB). However, the binding sites involved in these interactions have not been elucidated. To identify an MTP binding site in apoB, we have expressed several apoB sequences as fusion proteins with the eight-amino acid FLAG peptide. The chimeras were transiently expressed in COS cells, and conditioned media were used to study the binding of these sequences to either immobilized or soluble MTP. A polypeptide containing amino acids 270–570 (B:270–570), but not 1–300, bound to MTP. AGI-S17, an antagonist of apoB-MTP binding, inhibited the binding of B:270–570 to MTP but not to M2, a monoclonal antibody that recognizes the FLAG peptide. These data indicated that B:270–570 contains an MTP binding site. Next, sequences within 270–570 were subjected to C-terminal truncations at natural proline residues. B:270–509 bound less efficiently than B:270–570, whereas, B:270–430 and other shorter chimeras did not bind to MTP. Furthermore, truncations at amino acids 502 and 509 decreased MTP binding by 73 and 42%, respectively. These data indicate that B:430–570 in the α1-globular domain of apoB plays a crucial role in MTP binding and presumably in the initiation and maturation of apoB-containing lipoproteins.

This work was supported in part by the National Institutes of Health Grants DK-46900, HL-22633 (to M. M. H.), and HL-49373 (to G. S. S.) and the American Heart Association, National Center (to M. M. H.).The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. The article must therefore be hereby marked “advertisement” in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

Visiting scientist from Université Chouaib Doukkali, Faculté des Sciences, Laboratoire de Biochimie Appliquée, El Jadida, Morocco.


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Tektin B1 Demonstrates Flagellar Localization in Human Sperm

Michael J. Wolkowicz, 1 Soren Naaby-Hansen, 2 Angela R. Gamble, 3 P. Prabhakara Reddi, 1 Charles J. Flickinger, 1 John C. Herr 1,*

1 aDepartment of Cell Biology and the Center for Recombinant Gamete Contraceptive Vaccinogens, Univers
2 bLudwig Institute for Cancer Research, London W1W 7BS, United Kingdom
3 cBioQual, Inc., Rockville, Maryland 20850

* Correspondence: John C. Herr, Department of Cell Biology, Box 439 Jordan Hall, University of Virginia, Charlottesville, VA 22908. FAX: 804 982 3912 [email protected]

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The human flagellar protein tektin B1 (h-tekB1) in human sperm was cloned, and its sequence and subcellular location were determined. Human sperm proteins were separated by 2-dimensional electrophoresis, and a resolved protein spot of 54 kDa with an isoelectric point (pI) of 5.3 was removed from the gel, trypsinized, and microsequenced by tandem mass spectrometry. The resulting peptides did not match any protein in the (then current) protein databases. Degenerate oligonucleotides based on the microsequences were used with a polymerase chain reaction to amplify a partial cDNA clone from human testis poly(A) mRNA, and subsequently a full-length 1.5-kilobase (kb) clone (GenBank AF054910) was obtained from a testis cDNA library. The open reading frame encoded a 430-amino acid protein with 47% homology to the sea urchin tektin B1. Hybridization of labeled h-tekB1 cDNA to a multiple-tissue Northern blot demonstrated a transcript of 1.7 kb in human testis, and a multiple tissue dot-blot demonstrated high levels of expression in testis, trachea, and lung, intermediate levels in fetal brain and appendix, and low levels in ovary, pituitary, and fetal kidney. Rat polyclonal serum generated against a recombinant h-tekB1 demonstrated 3 h-tekB1 isoforms of pI 5.25, 5.5, and 5.35 at 53.5 kDa on a 2-dimensional Western blot of human sperm proteins. Immunofluorescent studies localized h-tekB1 to the principal piece of human sperm, but the endpiece was unstained.

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B1. Amino Acid Analysis and Chemical Sequencing - Biology

cDNA clones encoding GalNAc alpha 2,6-sialyltransferase (EC 2.4.99.3) have been isolated from chick embryo cDNA libraries using sequence information obtained from the conserved amino acid sequence of the previously cloned enzymes. The cDNA sequence included an open reading frame coding for 566 amino acids, and the deduced amino acid sequence showed 12% identity with that of Gal beta 1,4GlcNAc alpha 2,6-sialyltransferase from chick embryo. The primary structure of this enzyme suggested a putative domain structure, like that in other glycosyltransferases, consisting of a short NH2-terminal cytoplasmic domain, a signal-membrane anchor domain, a proteolytically sensitive stem region, and a large COOH-terminal active domain. The identity of this enzyme was confirmed by the construction of a recombinant sialyltransferase in which the NH2-terminal part (232 amino acid residues) was replaced with the immunoglobulin signal sequence. The expression of this recombinant in COS-7 cells resulted in secretion of a catalytically active and soluble form of the enzyme into the medium. The expressed enzyme exhibited activity toward only asialomucin and (asialo)fetuin, no significant activity being detected toward the other glycoprotein and glycolipid substrates tested. 14C-Sialylated glycols obtained from asialomucin re-sialylated with this enzyme were identical to NeuAc alpha 2,6-GalNAc-ol and GlcNAc beta 1,3(NeuAc alpha 2,6) GalNAc-ol. Synthetic GalNAc-SerNAc also served as an acceptor for alpha 2,6-sialylation. These results clearly showed that the expressed enzyme is GalNAc alpha 2,6-sialyltransferase.


Voir la vidéo: Protéines - Acides aminés et liaison peptidique (Janvier 2022).