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Quelle est la différence entre une sous-unité alpha et une sous-unité non-alpha dans les récepteurs ACh ?


Lors de la lecture sur les récepteurs ACh, il arrive fréquemment qu'une protéine soit décrite comme (alpha) ou (non-alpha). Cependant, je n'ai pas vraiment été en mesure de savoir ce que cela signifie. Quelle est la différence et pourquoi est-ce important qu'une sous-unité soit alpha ou non ?


Le récepteur de l'achetylcholine (ACh) est un pentamère de deux chaînes alpha, et une de chacune des chaînes bêta, delta et gamma (dans le muscle immature) ou epsilon (dans le muscle mature).


Comme d'autres récepteurs transmembranaires, les récepteurs de l'acétylcholine sont classés selon leur "pharmacologie", ou selon leurs affinités et sensibilités relatives aux différentes molécules. Bien que tous les récepteurs de l'acétylcholine, par définition, répondent à l'acétylcholine, ils répondent également à d'autres molécules.

    (nAChR, également connus sous le nom de récepteurs « ionotropes » de l'acétylcholine) sont particulièrement sensibles à la nicotine. Le récepteur nicotinique ACh est également un canal ionique Na + , K + et Ca 2+. (MAChR, également appelés récepteurs « métabotropiques » de l'acétylcholine) sont particulièrement sensibles à la muscarine.

Les récepteurs nicotiniques et muscariniques sont deux principaux types de récepteurs "cholinergiques".

La biologie moléculaire a montré que les récepteurs nicotiniques et muscariniques appartiennent à des superfamilles de protéines distinctes. Les récepteurs nicotiniques sont de deux types : Nm et Nn. Nm [1] est situé dans la jonction neuromusculaire qui provoque la contraction des muscles squelettiques par l'intermédiaire du potentiel de plaque terminale (EPP). Nn provoque une dépolarisation dans les ganglions autonomes entraînant une impulsion post-ganglionnaire. Les récepteurs nicotiniques provoquent la libération de catécholamines par la médullosurrénale, ainsi qu'une excitation ou une inhibition spécifique au site dans le cerveau. Nm et Nn sont tous deux liés aux canaux Na + et Ca 2+, mais Nn est également lié à un canal K + supplémentaire.

NAChR Modifier

Les nAChR sont des canaux ioniques ligand-dépendants et, comme les autres membres de la superfamille des canaux ioniques ligand-dépendants « cys-loop », sont composés de cinq sous-unités protéiques disposées symétriquement comme des bâtons autour d'un tonneau. La composition des sous-unités est très variable selon les différents tissus. Chaque sous-unité contient quatre régions qui s'étendent sur la membrane et se composent d'environ 20 acides aminés. La région II, la plus proche de la lumière des pores, forme la doublure des pores.

La liaison de l'acétylcholine aux extrémités N de chacune des deux sous-unités alpha entraîne la rotation de 15° de toutes les hélices M2. [2] Le côté cytoplasmique du récepteur nAChR a des anneaux de charge négative élevée qui déterminent la spécificité cationique spécifique du récepteur et éliminent la coque d'hydratation souvent formée par les ions en solution aqueuse. Dans la région intermédiaire du récepteur, au sein de la lumière des pores, les résidus valine et leucine (Val 255 et Leu 251) définissent une région hydrophobe à travers laquelle l'ion déshydraté doit passer. [3]

Le nAChR se trouve aux bords des plis jonctionnels à la jonction neuromusculaire du côté postsynaptique, il est activé par la libération d'acétylcholine à travers la synapse. La diffusion de Na + et K + à travers le récepteur provoque une dépolarisation, le potentiel de la plaque terminale, qui ouvre les canaux sodiques voltage-dépendants, ce qui permet le déclenchement du potentiel d'action et potentiellement la contraction musculaire.

MaChR Modifier

En revanche, les mAChR ne sont pas des canaux ioniques, mais appartiennent plutôt à la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G qui activent d'autres canaux ioniques via une deuxième cascade de messagers. Le récepteur cholinergique muscarine active une protéine G lorsqu'il est lié à l'ACh extracellulaire. La sous-unité alpha de la protéine G active la guanylate cyclase (inhibant les effets de l'AMPc intracellulaire) tandis que la sous-unité bêta-gamma active les canaux K et donc hyperpolarise la cellule. Cela provoque une diminution de l'activité cardiaque.

Les modulateurs des récepteurs de l'acétylcholine peuvent être classés en fonction des sous-types de récepteurs sur lesquels ils agissent :

ACh et ses récepteurs
Médicament Nm Nn M1 M2 M3
ACh, Carbachol, Méthacholine, AChEi (Physostigmine, Galantamine, Néostigmine, Pyridostigmine) + + + + +
Nicotine, Varénicline + +
succinylcholine +/-
Atracurium, Vecuronium, Tubocurarine, Pancuronium -
Epibatidine, DMPP +
Triméthaphane, Mécamylamine, Bupropion, Dextrométhophane, Hexaméthonium -
Muscarine, Oxotrémorine, Béthanechol, Pilocarpine + + +
Atropine, Toltérodine, Oxybutynine - - -
Védaclidine, Talsaclidine, Xanoméline, Ipatropium +
Pirenzépine, Télenzépine -
Méthoctramine -
Darifénacine, 4-DAMP, Darifénacine, Solifénacine -

Les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine peuvent être bloqués par le curare, l'hexaméthonium et les toxines présentes dans les venins de serpents et de crustacés, comme la α-bungarotoxine. Des médicaments tels que les agents bloquants neuromusculaires se lient de manière réversible aux récepteurs nicotiniques de la jonction neuromusculaire et sont couramment utilisés en anesthésie.

Les récepteurs nicotiniques sont le principal médiateur des effets de la nicotine. Dans la myasthénie grave, le récepteur de la jonction neuromusculaire est ciblé par des anticorps, ce qui entraîne une faiblesse musculaire. Les récepteurs muscariniques de l'acétylcholine peuvent être bloqués par les médicaments atropine et scopolamine.

Le syndrome myasthénique congénital (SMC) est une maladie neuromusculaire héréditaire causée par des défauts de plusieurs types au niveau de la jonction neuromusculaire. Les défauts post-synaptiques sont la cause la plus fréquente de CMS et entraînent souvent des anomalies des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine. La majorité des mutations causant la CMS se trouvent dans les gènes des sous-unités AChR. [4]

Sur toutes les mutations associées à la CMS, plus de la moitié sont des mutations dans l'un des quatre gènes codant pour les sous-unités adultes du récepteur de l'acétylcholine. Les mutations de l'AChR entraînent souvent une déficience de la plaque axiale. La plupart des mutations de l'AChR sont des mutations du gène CHRNE. Le gène CHRNE code pour la sous-unité epsilon de l'AChR. La plupart des mutations sont des mutations autosomiques récessives avec perte de fonction et, par conséquent, il existe un déficit en AChR de la plaque motrice. CHRNE est associé à la modification des propriétés cinétiques de l'AChR. [5] Un type de mutation de la sous-unité epsilon de l'AChR introduit un Arg dans le site de liaison à l'interface sous-unité α/ε du récepteur. L'ajout d'un Arg cationique dans l'environnement anionique du site de liaison AChR réduit considérablement les propriétés cinétiques du récepteur. Le résultat de l'ARG nouvellement introduit est une réduction de 30 fois de l'affinité agoniste, une réduction de 75 fois de l'efficacité de déclenchement et une probabilité d'ouverture de canal extrêmement affaiblie. Ce type de mutation entraîne une forme extrêmement mortelle de CMS. [6]


Alpha 5, alpha 3 et non alpha 3. Trois gènes aviaires regroupés codant pour les sous-unités liées aux récepteurs neuronaux de l'acétylcholine nicotinique.

Chez les vertébrés, les récepteurs neuronaux de l'acétylcholine nicotinique (nAChR) s'assemblent selon une stoechiométrie inconnue à partir de deux sous-unités homologues, une alpha et une non-alpha. Quelle est la taille du répertoire de ces sous-unités et combien de sous-types de nAChR fonctionnellement différents peuvent-ils constituer ? Nous avons trouvé dans le génome aviaire un groupe de trois gènes étroitement liés couvrant 28 paires de kilobases et codant pour trois protéines, n alpha 3, alpha 3 et alpha 5, qui ont les caractéristiques attendues des sous-unités neuronales nAChR. Le gène n alpha 3 se trouve à 5' de alpha 3 (dont le rôle dans la cholinoception a déjà été établi) et est transcrit à partir du même brin d'ADN, tandis que alpha 5 se trouve à 3' de alpha 3 et est transcrit à partir du brin d'ADN opposé. La structure des gènes n alpha 3 et alpha 5 se compose de six exons avec des sites d'épissage conservés avec précision et est identique à la structure des gènes de sous-unité de récepteur neuronal aviaire précédemment caractérisés alpha 2, alpha 3, alpha 4 et n alpha 1. alpha Les transcrits 3, n alpha 3 et alpha 5 sont rares dans le système nerveux central, mais alpha 3 et n alpha 3 sont facilement détectables dans les ganglions cervicaux et ciliaires supérieurs embryonnaires. Afin de tester la fonction, le gène codant pour n alpha 3 et les ADNc codant pour alpha 3, alpha 4, alpha 5 et n alpha 1 ont été sous-clonés dans un vecteur d'expression, et les constructions ont été injectées dans des noyaux d'ovocyte de Xenopus, soit seuls, soit en combinaisons par paires d'un alpha et d'un non-alpha. Un à cinq jours plus tard, la sensibilité à l'ACh des ovocytes injectés a été examinée en voltage clamp. Le gène n alpha 3 et l'ADNc n alpha 1 ont provoqué l'assemblage de nAChR lorsqu'ils sont co-injectés avec l'ADNc alpha 3 ou alpha 4 et les propriétés électrophysiologiques des quatre combinaisons par paires étaient significativement différentes. alpha 5, cependant, n'a pas dirigé l'assemblage de nAChR fonctionnels lorsqu'il est injecté seul ou en combinaison avec n alpha 1 ou n alpha 3.


Quelle est la différence entre une sous-unité alpha et une sous-unité non-alpha dans les récepteurs ACh ? - La biologie

Neurobiologie I (W3004) Questions et réponses sur la transmission synaptique

1. (4 PTS) Quels sont les 4 critères pour identifier une substance comme neurotransmetteur ?

SYNTHÉTISÉ DANS LE NEURONE

PRÉSENT DANS LE TERMINAL PRÉSYNAPTIQUE ET LIBÉRÉ EN QUANTITÉS SUFFISANTES POUR OBTENIR UNE RÉPONSE PRÉDITE

L'APPLICATION EXOGÈNE IMME L'ACTION DE MÉCANISMES D'APPORT OU DE SUPPRESSION SPÉCIFIQUES À L'ÉMETTEUR LIBÉRÉ DE MANIÈRE ENDOGÈNE

2. (2 PTS) Les protéines qui interviennent dans la transmission synaptique à travers les jonctions communicantes au niveau des synapses électriques sont appelées CONNEXINES . Six de ces sous-unités protéiques forment un CONNEXION . Lorsque deux de ces protéines, l'une sur la membrane pré- et l'autre sur la membrane post-synaptique correspondent, le canal résultant est appelé un JONCTIONS LACUNAIRES .

3. (10 PTS) Quelques nombres d'échelle :

une. Amplitude du potentiel de plaque d'extrémité miniature (MEPP) en mV.

b. Densité des récepteurs ACh (par um2 aux crêtes du NMJ)

c. Nombre de molécules d'ACh dans une vésicule synaptique

ré. Concentration intracellulaire (M) d'ions Ca++ libres

e. Largeur de la fente synaptique au NMJ, en nm

F. Conductance monocanal du récepteur ACh, lorsqu'il est ouvert, en pS.

g. Potentiel d'inversion du courant de fond, en mV.

h. Nombre de sous-unités qui composent un canal activé ACh.

je. Nombre de sites de liaison ACh sur le canal récepteur ACh

j. Nombre de types de sous-unités contribuant au canal récepteur ACh

k. Nombre de régions couvrant la membrane dans chaque sous-unité du

4. (5 PTS) À l'aide d'une pipette d'iontophorèse, l'ACh est directement appliqué à une jonction neuromusculaire.

a) À quelle réponse vous attendriez-vous dans la cellule post-synaptique ? (Dessinez le courant post-synaptique)

UN SIMPLE DESSIN EPSP A ÉTÉ NÉCESSAIRE. NE PEUT PAS PULSER QU'IL Y A ASSEZ DE ACH POUR PROVOQUER UN POTENTIEL D'ACTION, MAIS SI LES DEUX ONT ÉTÉ DESSINÉS, C'ÉTAIT CORRECT. SOIT LES TRACES DE TENSION ET DE COURANT SONT ACCEPTÉES.

b) Quel effet sur cette réponse les médicaments suivants auraient-ils (Dessiner et expliquer).

(TTX BLOQUE LES CANAUX DE SODIUM DÉPENDANT DE LA TENSION, VOUS N'OUBLIEZ PAS ?) AUCUN POTENTIEL D'ACTION NE SERA GÉNÉRÉ MAIS SIMPLEMENT UN EPP.

CURARE SE LIE DE MANIÈRE ANTAGONISTE AUX RÉCEPTEURS ACH AVEC UNE AFFINITÉ EXTRÊMEMENT ÉLEVÉE. PAR CONSÉQUENT, IL N'Y AURA PAS DE RÉPONSE POSTSYNAPTIQUE. LE DESSIN DE LA PSP SERAIT UNE LIGNE PLATE--RIEN NE SE PASSE.

LA PROSTIGIMINE BLOQUE L'ACETYLCHOLINE ESTERASE, AUGMENTANT DONC LA CONCENTRATION D'ACH DANS LA SYNAPSE PENDANT UNE PÉRIODE PLUS LONGUE. L'EFFET SERAIT D'ALLONGER ET D'AUGMENTER L'AMPLITUDE DE LA PSP, DONC LE DESSIN AURAIT DU ÊTRE UNE RÉPONSE PLUS LONGUE ET PLUS GRANDE. ACH SERAIT SUPPRIMÉ UNIQUEMENT PAR DIFFUSION.

(LE THÉ BLOQUE LES CANAUX DE POTASSIUM.) EN SUPPOSANT QUE SUFFISAMMENT D'ACh EST APPLIQUÉ POUR OBTENIR UN AP, L'AP SUIVRA LE COURS D'UN COURANT Na. SI L'ACh NE SUFFIT PAS POUR OBTENIR UN AP, IL N'Y AURA AUCUN EFFET SUR LA RÉPONSE.

5. (4 PTS) La transmission au niveau d'une autre synapse est médiée par la voie du deuxième messager de l'AMPc et implique une protéine G. Lors de la stimulation avec le

transmetteur, une EPSP lente est produite dans la cellule post-synaptique. Quel serait l'effet de l'ajout des substances suivantes à la cellule postsynaptique :

a.IBMX , un médicament qui inhibe la PDE.

b. La toxine cholérique, une substance qui peut ribosyler l'ADP Gs et inhiber son activité GTPase.

G-ALPHA RESTE LIE AU GTP.

c.GTP g s, une forme de GTP qui ne peut pas être hydrolysée.

DANS LES 3 CAS, IL Y AURA UNE AUGMENTATION DE LA RÉPONSE (RÉPONSE PLUS LONGUE AVEC UNE PLUS GRANDE AMPLITUDE).

d.Ajout des quantités excédentaires de la sous-unité régulatrice de la PKA.

LA PKA-R EXOGÈNE INHIBERERA LA PKA-C, DONC MOINS DE PHOSPHORYLATION SE PRODUIRA, DONC UNE PLUS PETITE AMPLITUDE DE RÉPONSE.

7. (12 pts) a) La stimulation d'un neurone présynaptique GABAergique produit un IPSP, qui a un retard de

20 ms, n'est pas affecté par les barbituriques et peut être bloqué par le TEA. Décrire la voie probable de transduction du signal (du récepteur au canal).

Réponse : Cette réponse est médiée par les récepteurs métabotropiques GABA. GABAB récepteurs ® activation des protéines G ® avec ou sans 2e messagers (via la liaison directe de la sous-unité G bêta-gamma) ® ouverture des canaux K+ ® IPSP.

b) Dans une autre expérience, la stimulation d'un neurone présynaptique cholinergique produit un EPSP, qui a un retard de

50 ms, n'est pas bloqué par le curare mais est bloqué par TEA. Décrivez la voie probable de transduction du signal (à nouveau du récepteur au canal) et expliquez comment l'EPSP est produit.

Réponse : Cette réponse est médiée par les récepteurs métabotropiques de l'ACh. récepteurs maCh ® activation des protéines G ® activation de PLC ® dégradation de PIP2 ® inhibition des canaux K + constitutivement actifs.

L'ouverture continue des canaux K + maintient le potentiel membranaire proche de EK. Mais en plus des canaux K+, il existe également des canaux de fuite qui sont ouverts en permanence, qui ont un potentiel d'inversion proche de 0 mV. Lorsque les canaux K + sont inhibés, un courant entrant net circule dans les canaux de fuite, ce qui entraîne une dépolarisation de la membrane et produit un EPSP.

8.( 5 PTS) Identifiez l'émetteur probable

une. à la synapse d'une cellule adrénergique.

b. au niveau de la synapse d'une cellule positive à la tyrosine hydroxylase

c. à une synapse qui contient de la cholinestérase

ré . à une synapse où l'action peut être imitée par kainate

e. à une synapse qui répond avec un IPSP en raison d'une augmentation de la conductance Cl post-synaptique

9.( 2 PTS) La diversité fonctionnelle parmi les protéines G provient principalement des différences dans la sous-unité alpha, bêta ou gamma ?

10 .( 4 PTS) Identifiez deux étapes de la voie AMPc et deux étapes de la voie IP3 dans lesquelles il y a amplification du signal.

AMPc : un seul récepteur lié peut activer de nombreuses protéines G, l'adényl cyclase peut catalyser la production de nombreuses molécules d'AMPc, un seul AMPc peut activer de nombreuses molécules PKA, une seule molécule PKA peut phosphoryler de nombreuses protéines cibles.

IP3 : un seul récepteur lié peut activer de nombreuses protéines G, le PLC peut générer de nombreuses molécules IP3, la PKC peut phosphoryler de nombreuses protéines cibles, IP3 peut libérer de nombreux ions Ca++, Ca++/DAG peut activer la PKC.

(REMARQUE : LA DESCRIPTION DE L'ENSEMBLE DU CHEMINEMENT N'EST PAS LA BONNE RÉPONSE.)

11 .( 4 PTS) Tracer la courbe I-V pour le canal NMDA en présence et en l'absence de Mg++. Étiquetez clairement chaque courbe et identifiez la zone de dépendance de la tension sur les graphiques.

CE QUE VOUS DEVEZ FAIRE ATTENTION, C'EST QUE LE CANAL EST BLOQUE PAR Mg++ A DES TENSIONS INFERIEURES A » -40mV. LE POTENTIEL D'INVERSION EST DE 0. LA ZONE DE DEPENDANCE DE LA TENSION EST A DES POTENTIELS NEGATIFS EN PRESENCE DE Mg++. EN L'ABSENCE DE Mg++ IL N'Y A AUCUNE DEPENDANCE DE TENSION.

12.( 4 PTS) Concevoir une expérience pour obtenir la valeur du courant dû au récepteur NMDA dans une cellule stimulée par le glutamate qui contient à la fois AMPA et

MESURER LE COURANT (SOUS PINCE DE TENSION) AVEC UNE SOLUTION DE BAIN NORMALE PUIS BLOQUER SÉLECTIVEMENT CHAQUE TYPE DE RÉCEPTEUR. SI VOUS BLOQUEZ LES RÉCEPTEURS AMPA AVEC CNQX, LE COURANT QUE VOUS MESUREZ EST UNIQUEMENT D AUX R NMDA. SI LES R NMDA SONT BLOQUÉS AVEC APV, ALORS "N MDA CURRENT" = "CONTROL CURRENT" - "AMPA CURRENT".

13 .( 4 PTS) Décrivez la différence entre les récepteurs ionotropes et métabotropes et donnez un exemple de chacun.

LES RÉCEPTEURS IONOTROPES FORMENT DES CANAUX IONIQUES EUX-MÊMES (D'où le terme alternatif "canaux ioniques LIGAND-GATED"), alors que les récepteurs métabotropes AFFECTENT LES CANAUX IONIQUES INDIRECTEMENT, VIA L'ACTIVATION DES PROTÉINES G.

EXEMPLES DE RECEPTEURS IONOTROPES : ACh-R NICOTINIQUE, Glu-R (NMDA, AMPA/KAINATE), GABA-R, GLYCINE-R.

EXEMPLES DE Rs MÉTABOTROPES : ACh-R MUSCARINIQUES, Rs BETA-ADRÉNERGIQUES, HISTAMINE-Rs, DOPAMINE-Rs.

14 .( 4 PTS) Quelles autres déficiences (non liées à la mémoire) pourraient entraîner de mauvaises performances au test du labyrinthe aquatique de Morris ? Nommez-en au moins deux et quels tests vous pourriez

utiliser pour éliminer ces possibilités.

DÉFICIENCE(S) MOTRICES, PROBLÈMES DE VISION.

15. (3 PTS) Dans une cellule au repos, la concentration de Ca2+ libre est d'environ 0,1 uM, quelle est la concentration de Ca2+ près des canaux Ca2+ ouverts pendant l'émission

Plusieurs centaines de micromolaires, 200-300uM.

16 .( 4 PTS) Sur la base des figures 1a et 1b de Nowak et al. (Nature, 1984, 307 : 462-465) :

Pourquoi ne voient-ils un effet qu'aux potentiels négatifs ?

(VOIR AUSSI Q. #11) AUX POTENTIELS NEGATIFS, LE CANAL EST BLOQUE PAR Mg++.

Que vous dit la forme de la courbe I/V 500um Mg++ sur l'activation de ce canal ?

À DES POTENTIELS RELATIVEMENT DÉPOLARISÉS, SPÉCIFIQUEMENT > » -40mV, LE Mg++ EST EXPULSÉ. LE CANAL EST DÉPENDANT DE LA TENSION DANS CETTE RÉGION.

Quelles preuves suggèrent qu'il s'agit d'un canal cationique non sélectif ?

POTENTIEL D'INVERSION = 0, LA COURBE I-V TRAVERSE (0, 0).

Que regardent-ils dans leur analyse de bruit ? Qu'est-ce que cela leur dit?

CE QU'ILS REGARDENT EN EFFET DANS L'ANALYSE DU BRUIT, C'EST L'OUVERTURE ET LA FERMETURE DES CANAUX. CELA LEUR DONNE LE TEMPS OUVERT MOYEN DU CANAL.

17 .( 5 PTS) Suggérez, en une ou deux phrases, UN mécanisme moléculaire pour transformer la mémoire à court terme en mémoire à long terme.

KINASES CONSTITUTIVEMENT ACTIVES

ACTIVATION DU RÉCEPTEUR NMDA ET LTP

18 .( 2 PTS) En une phrase, qu'est-ce que le conditionnement classique (CC) ?

UN APPRENTISSAGE ASSOCIATIF ENTRE UN US ET UN CS.

19 .( 3 PTS) Décrivez la différence entre l'apprentissage associatif et non associatif et donnez un exemple de chacun.

DIFFÉRENCE : MÉMOIRE EXPLICITE (PAR EX. SOUVENIR DE FAITS) VS MÉMOIRE IMPLICITE (EX. CONDUIRE À VELO).

APPRENTISSAGE ASSOCIATIF : EXP DE CHIEN DE PAVLOV, CONDITIONNEMENT CLASSIQUE

APPRENTISSAGE NON ASSOCIATIF : SENSIBILISATION, HABITUATION

20 .( 3 PTS) Dans l'étude Sandou et al. papier sur les comportements médiés par le 5-HT1B

récepteur , les auteurs décrivent le rôle du récepteur 5-HT1B dans la locomotion et l'agressivité. Quel est le modèle/système expérimental qu'ils ont utilisé pour leur étude ?

SOURIS SANS LE RÉCEPTEUR 5-HT1B (5-HT1B KNOCKOUTS).

21. (2 PTS) La transmission synaptique électrique est

22 .( 4 PTS) Décrire la structure de la protéine kinase A et comment cette structure peut contribuer à la sensibilisation à long terme.

PKA EST COMPOSÉ DE 2 SOUS-UNITÉS RÉGLEMENTAIRES IDENTIQUES QUI SONT INTERCONNECTÉES PAR UNE LIAISON DISULFURE ET DE 2 SOUS-UNITÉS CATALYTIQUES. CHACUNE DES SOUS-UNITÉS RÉGLEMENTAIRES CONTIENT 2 SITES DE FIXATION POUR CAMP. LA PKA EST CONSIDÉRÉE COMME L'ÉTAPE D'INITIATION DANS LE MÉCANISME DE SENSIBILISATION À LONG TERME : LORSQUE LE cAMP SE LIE AUX SOUS-UNITÉS RÉGLEMENTAIRES, LES SOUS-UNITÉS CATALYTIQUES SONT LIBÉRÉES ET TRANSLOCÉES DANS LE NOYAU O ILS PHOSPHORYLENT LES FACTEURS DE TRANSCRIPTION CREB. AINSI LA SYNTHÈSE DES PROTÉINES, QUI EST IMPLIQUÉE DANS LA SENSIBILISATION À LONG TERME, EST INDUITE.

23 .( 3 PTS) Qu'est-ce que l'aeqorine ? Décrivez brièvement une expérience dans laquelle vous pourriez utiliser l'aeqorine pour montrer que l'ion spécifique auquel il se lie est associé à la libération de neurotransmetteurs dans la synapse du calmar géant ?

AEQORIN EST UNE PHOTOPROTÉINE CALCIUM-DÉPENDANTE DE FAIBLE SENSIBILITÉ, CE QUI (EN ANGLAIS) SIGNIFIE QUE C'EST UNE PROTÉINE QUI

EMET DE LA LUMIERE (FLUORESCES) EN PRESENCE DE Ca++ LIBRE. IL PEUT DONC ETRE UTILISE COMME " DETECTEUR" DIRECT DE Ca++.

L'UTILISATION D'AEQORIN POUR LA DETECTION DE DOMAINES DE CONCENTRATION ÉLEVÉE EN CALCIUM DANS LA SYNAPSE DE CALMAR GÉANT EST DÉCRIT DANS LLINAS ET AL. PAPIER. AEQORIN EST INJECTÉ INITIALEMENT DANS LA TERMINALE PRÉSYNAPTIQUE DE LA SYNAPSE DE CALAMAR GÉANT. PAR EPIFLUORESCENCE MI CROSCOPIE VOUS POUVEZ IMAGER LE TERMINAL. SI VOUS STIMULEZ LA FIBRE PRÉSYNAPTIQUE, VOUS VERREZ DES POINTS BLANCS QUI CORRESPONDENT AUX DOMAINES D'ÉMISSION QUANTIQUES. SI VOUS SUPERPOSEZ LES DEUX IMAGES FLUORESCENTES (C'EST-À-DIRE AVANT ET APRÈS LA STIMULATION), VOUS VERREZ QUE LES QED COINCIDENT AVEC LE TERMINAL PRÉSYNAPTIQUE, CE QUI SIGNIFIE QUE LES CANAUX Ca++ s'ouvrent et que Ca++ EST LIBÉRÉ À CETTE PARTIE DE LA SYNAPSE. MOYENS DE STIMULATION

LIBÉRATION DE NEUROTRANSMETTEUR, DONC ELLE DOIT ÊTRE ASSOCIÉE À L'AUGMENTATION OBSERVÉE DES NIVEAUX DE CALCIUM.


Α-conotoxines neuronales ciblées par nAChR

Les -conotoxines ciblant les nAChR neuronaux sont nombreuses et ont une sélectivité de sous-type encore plus exquise, probablement en raison de la grande diversité d'isoformes dans cette sous-famille de récepteurs. Les membres de cette famille de toxines qui ont été découverts jusqu'à présent sont énumérés ci-dessous, sans ordre particulier (voir également les tableaux 2 et 3).

Α-conotoxines ImI et ImII

La première α-conotoxine ciblant les nAChR neuronaux était α-CTx ImI. C'était aussi la première α-conotoxine isolée du venin d'une espèce de ver de chasse, Conus impérial 38 . Cette α-conotoxine a l'espacement inhabituel des boucles inter-cystéine de 4/3 (figure 1A). Ce peptide s'est avéré inactif lorsqu'il était injecté par voie interpéritonéale, alors que l'injection intracérébrale provoquait des convulsions et la mort 38 . De plus, cette toxine bloque les réponses nicotiniques des cellules B sur les ganglions sympathiques de la grenouille mais pas les nAChRs neuromusculaires des mammifères 38, 39 . La caractérisation pharmacologique ultérieure des nAChR exprimés de manière hétérologue a montré une CI50 de 220 nmol/L sur les nAChR 7 homomères et de 1,8 μmol/L sur les nAChR 9 homomères 16 . Ellison et al, (2004) ont signalé un CI50 de 595 nmol/L sur le nAChR 7 homomère, mais ils ont également montré une inhibition puissante du nAChR α3β2 hétéromère (IC50 41 nmol/L). Les effets induisant des crises de cette toxine sont probablement dus à son blocage des 7 nAChR sensibles à la -bungarotoxine sur les neurones de l'hippocampe 40 . Des études de structure-activité ont suggéré un rôle pour les résidus dans la première boucle de la toxine, Asp5, Pro6 et Arg7, ainsi que Trp10 dans la deuxième boucle, dans l'interaction avec la sous-unité α7 41 . Modélisation d'homologie à l'aide de Aplysie AChBP, un homologue structurel de la région de liaison N-terminale des nAChR, confirme un rôle clé pour Arg7 et Trp10 dans l'interaction avec les résidus au site de liaison du ligand 42, 43. Co-cristallisation de α-CTx ImI avec Aplysie AChBP révèle une boucle C plus ouverte pour accueillir la -conotoxine 44 . Les résidus de la sous-unité α7 qui interagissent avec la toxine ont également été déterminés 45, 46 .

Ces dernières années, des tentatives ont été faites pour améliorer la stabilité biologique des -conotoxines en protégeant les liaisons disulfure contre la réduction ou le brouillage dus à l'exposition à des environnements intra- ou extracellulaires, tels que le sang. L'une de ces études a utilisé des sélénocystéines à la place des cystéines pour produire plusieurs analogues de sélénoconotoxines de -CTx ImI 47 . Bien que similaires à l'-CTx ImI de type sauvage à la fois dans la structure et l'activité contre les nAChR 7, les analogues de la sélénoconotoxine étaient plus stables que l'-CTx ImI de type sauvage dans diverses conditions chimiques et biologiques réductrices 47 . Une deuxième méthode pour améliorer la stabilité conformationnelle consiste à remplacer les ponts cystine par des liaisons dicarba non réductibles. L'analogue dicarba de -CTx ImI avait une structure similaire à celle de α-CTx ImI de type sauvage, avec une légère différence dans la géométrie du disulfure vs ponts de dicarba. L'activité de l'analogue contre α7 nAChR était similaire à -CTx ImI 48 de type sauvage.

Une autre conotoxine α4/3 du venin de Conus impérial, -CTx ImII, a été identifié à l'aide d'une stratégie de découverte basée sur la PCR 49 . Bien que hautement homologue à α-CTx ImI dans la séquence (9 résidus sur 12 sont partagés), α-CTx ImII, contrairement à α-CTx ImI, n'entre pas en compétition avec la -bungarotoxine pour se lier aux 7 nAChR exprimés de manière hétérologue, suggérant un peut-être un nouveau site de liaison sur le 7 nAChR pour α-CTx ImII 50 . La différence de liaison des deux toxines est due à la présence d'une Pro en position 6 de -CTx ImI, qui s'est avérée importante pour l'interaction de cette toxine avec les 7 nAChR 41 . -CTx ImII a un Arg à cette position, la mutation de cet Arg en un Pro crée un analogue qui entre en compétition avec la liaison à la -bungarotoxine 49 .

Α-Conotoxines MII, PIA, OmIA

Une seconde α-conotoxine isolée de Conus mage était α-CTx MII. Il appartient à la sous-famille α4/7 (Figure 1). -CTx MII bloque le sous-type α3β2 nAChR avec une puissance de 2 à 4 ordres de grandeur plus élevée que la plupart des autres récepteurs nicotiniques, y compris le sous-type musculaire 51 . Cependant, des études de liaison chez des animaux knock-out 52 ainsi que des études fonctionnelles 53 ont montré que α-CTx MII agit également puissamment sur les nAChR contenant α6. Par la suite, une série d'analogues α-CTx MII ont été fabriqués qui ciblent sélectivement le chimérique α6/α3β2β3 54 vs 3β2 nAChR 53 . Ces analogues de toxines sont les antagonistes α6 * nAChR les plus sélectifs rapportés à ce jour. Le type sauvage α-CTx MII, ainsi qu'un certain nombre d'analogues -CTx MII sélectifs α6 * (l'astérisque indique la présence de sous-unités supplémentaires), ont été utilisés pour caractériser les sous-types de nAChR qui modulent la libération de dopamine chez le rat 55, 56, 57 , 58, 59, 60, 61 , souris 62, 63, 64, 65 et singe striatum 66, 67 . Ces études indiquent un rôle des nAChR 6β2* et α6α4β2* dans la modulation de la libération de dopamine dans le striatum et le noyau accumbens. La contribution des sous-unités 4 et 3 aux sites de liaison α-CTx MII dans les neurones dopaminergiques a été confirmée dans des études utilisant des souris knock-out 64, 68, 69 . Certaines études suggèrent également une régulation négative sélective de α6 * nAChR lors d'une exposition chronique à la nicotine 70, 71 . α-CTx MII a également été utilisé pour caractériser des nAChR distincts qui modulent la libération de [ 3 H]NE chez le rat 72 vs hippocampe de souris 73 . Le tableau 4 résume certaines des fonctions physiologiques médiées par nAChR caractérisées à l'aide des -conotoxines.

Des études structure-activité ont identifié les résidus d'acides aminés sur les sous-unités α3 et β2 nAChR qui interagissent avec α-CTx MII. Ceux-ci incluent Lys185 et Ile188 sur la sous-unité α3 et Thr59, Val109, Phe117 et Leu119 sur la sous-unité β2 74, 75. De plus, α-CTx MII[S4A E11A L15A] a été utilisé pour identifier les résidus d'acides aminés de la sous-unité nAChR qui interagissent avec, et confèrent une sélectivité, pour le 6 vs la sous-unité α3 76 . Notamment, ces résidus de sous-unité nAChR sont distincts de ceux qui interagissent avec α-CTx MII 74 de type sauvage.

Le radiomarquage de la -CTx MII a permis de mesurer directement les sites de liaison de cette -conotoxine dans le cerveau 77 . Des analogues marqués par fluorescence de α-CTx MII ont également été récemment synthétisés 78 . En utilisant le -CTx MII radiomarqué, Quik et ses collaborateurs ont trouvé une régulation négative sélective des sites de liaison α-CTx MII dans le striatum des rongeurs et des singes après des dommages nigorstriataux 79, 80, 81, 82 ainsi que chez les humains atteints de la maladie de Parkinson 82 . La mesure directe des sites α-CTx MII montre également une récupération préférentielle de ces sites chez les singes autorisés à récupérer des dommages nigrostriataux 66 . Des études de liaison utilisant un analogue de -CTx MII, α-CTx MII[E11A], ont montré une perte sélective d'un sous-type spécifique de nAChR (α6α4β2 * ) dans des modèles rongeurs et singes de la maladie de Parkinson. Ces études ont été répliquées dans des tissus post-mortem d'humains atteints de la maladie de Parkinson 83 . Ainsi, cet analogue α-CTx MII a une sélectivité de sous-type nAChR qui a un potentiel dans le diagnostic précoce de la maladie de Parkinson.

Un certain nombre de tentatives ont été faites pour améliorer la stabilité de l'a-CTx MII contre la protéolyse ainsi que pour améliorer sa lipophilie, dans le but d'augmenter la biodisponibilité orale de cette toxine. La cyclisation du squelette par l'utilisation de la mise en place d'un linker et de la jonction des terminaisons N et C a donné lieu à plusieurs analogues cycliques de -CTx MII. Deux de ces analogues avaient des structures similaires à l'a-CTx MII natif, bien qu'un seul de ces analogues - celui avec la plus longue activité de liaison conservée similaire à l'a-CTx MII natif. L'analogue cyclique était beaucoup plus stable que la toxine native dans le plasma humain 84 . Pour améliorer la lipophilie du -CTx MII, la toxine a été conjuguée avec du 2-amino-,L-acide dodécanoïque (Laa) à l'extrémité N-terminale. Cet analogue terminal -CTx MII avait une structure et une activité similaires à celles du peptide parent 85, mais présentait une perméabilité significativement améliorée à travers les monocouches de cellules Caco-2 85 . Bien que l'analogue conjugué à Laa n'ait pas traversé la barrière hémato-encéphalique dans une large mesure, son absorption par le tractus gastro-intestinal après administration orale était supérieure à celle du parent α-CTx MII 86 .

Un certain nombre d'autres α-conotoxines ont une sélectivité envers les nAChR 3β2 ou α6β2β3. -CTx PIA, découvert grâce au clonage par PCR de l'ADNc du conduit de venin de Conus purpurascens, a un IC environ 70 fois inférieur50 pour chimérique α6/α3β2β3 vs 3β2 nAChR 87 . En revanche, α-CTx OmIA, purifié à partir de venin de Conus omaria, a une sélectivité préférentielle (20 fois) pour α3β2 vs 6/α3b2b3 nAChR 88, 89 . C'est également un puissant inhibiteur du 7 nAChR 89 .

Α-Conotoxines GIC et GID

Deux α-conotoxines spécifiques des nAChR neuronaux ont été purifiées à partir du venin de Conus geographus. α-CTx GIC, une conotoxine 4/7 identifiée à partir de l'ADN génomique de Conus geographus, a une faible puissance nanomolaire pour les nAChR 3β2 et α6β2 vs muscle, nAChR 3β4 et α4β2 90, 91 . Le -CTx GID, bien que similaire au -CTx GIC dans son espacement des boucles inter-cystéine (α4/7), est structurellement différent du -CTx GIC et d'autres α-conotoxines neuronales ciblées par nAChR de plusieurs manières. Premièrement, il a des résidus N-terminaux supplémentaires par rapport au -CTx GIC et à la plupart des autres α-conotoxines précédemment identifiées. Deuxièmement, il a deux modifications post-traductionnelles : un résidu d'acide -carboxyglutamique juste avant le premier résidu Cys et une hydroxyproline en position 16. Troisièmement, il y a un résidu chargé positivement, Arg, en position 12, alors que α-CTx GIC et la plupart des autres Les α-conotoxines ont un résidu hydrophobe (Ala ou Phe) ou non chargé (Asn). Fait intéressant, une charge positive à cette position semble être responsable de l'affinité relativement élevée de -CTx GID pour les nAChR 4β2 par rapport à d'autres α-conotoxines dépourvues de ce résidu positif 92, 93. Il convient de noter ici que les deux -conotoxines spécifiques du muscle-SrIA et SrIB-qui ont des effets potentialisateurs sur le 4β2 nAChR ont également un Arg à la position homologue (tableau 1). Une « marche Ala » de -CTx GID indique également des rôles importants pour la plupart des résidus de la toxine, à l'exception de Val13, en interaction avec α4β2 nAChR 93 . Semblable au -CTx GIC, le -CTx GID bloque également puissamment α3β2 nAChR 92, 93 . Contrairement à -CTx GIC, cependant, -CTX GID bloque également α7 nAChR 92, 93 . Les études structure-activité indiquent que le résidu le plus important pour l'interaction avec les nAChR 7 et α3β2 est Pro9, avec une contribution plus faible de Asp3 et Arg12. Asn14 semble être important pour l'interaction avec α7 nAChR seulement 93 . Les résidus de sous-unité β2 conférant la puissance élevée de -CTx GID sur α3β2 nAChR sont les mêmes résidus qui confèrent également une puissance élevée de -CTx MII et -CTx PnIA pour ce sous-type de récepteur 75 .

Α-conotoxine EpI

α-CTx EpI, une α4/7-conotoxine purifiée à partir du venin de Conus épiscopatus, est un autre exemple d'une conotoxine modifiée post-traductionnellement. Cette conotoxine est différente des α-conotoxines précédemment caractérisées en ce qu'elle possède un Tyr sulfaté en position 15 94 . Cependant, le peptide natif sulfaté et le peptide non sulfaté synthétique ont une activité similaire et inhibent les réponses nAChR résistantes à la -bungarotoxine dans les cellules chromaffines surrénales et les neurones parasympathiques des ganglions intracardiaques de rat, mais n'inhibent pas les réponses musculaires nAChR 94 . Par conséquent, cette toxine a été désignée comme un bloqueur spécifique des nAChR 3β2 et 3β4, mais pas 7. Cependant, des études avec des nAChR exprimés de manière hétérologue dans des ovocytes ont montré la sélectivité inverse, une puissante inhibition des nAChR 7 avec peu d'effet sur les nAChR 3β4 ou α3β2 95 . L'inhibition de 7 nAChRs par α-CTx EpI n'est pas surprenante étant donné que α-CTx EpI est identique à α-CTx ImI dans sa première boucle, la région contenant des résidus s'est avérée importante pour l'interaction de -CTx ImI avec α7 nAChRs 41 .

Α-conotoxines AnIA, AnIB et AnIC

Trois peptides isolés du venin de Anémone du cône ajouter à la liste des α-conotoxines sulfatées 96 . -CTx AnIA, -CTx AnIB et -CTx AnIC ont tous une sulfotyrosine en position 16. L'-CTx AnIB synthétique avait une puissance subnanomolaire à α3β2 nAChRs, avec une puissance environ 200 fois inférieure à α7 nAChR, et peu ou aucune activité sur le muscle et d'autres nAChR hétéromères testés. Le peptide non sulfaté a conservé son activité sur les nAChR 3β2 alors qu'il était 10 fois moins puissant sur les nAChR 7. L'élimination des deux glycines N-terminales (pour produire la même toxine que -CTx AnIA) a affecté négativement la cinétique de liaison et, par conséquent, la puissance de la toxine sur les nAChR 3β2 96 .

Α-Conotoxines AuIA, AuIB et AuIC

Trois α-conotoxines isolées du venin de Conus aulicus sont α-CTx AuIA, AuIB et AuIC. Semblable à la plupart des autres -conotoxines neuronales bloquant le nAChR, -CTx AuIA et AuIC appartiennent à la famille α4/7, tandis que α-CTx AuIB a l'espacement inhabituel des boucles inter-cystéine de 4/6 72 . Tous les trois sont des bloqueurs sélectifs du sous-type neuronal, 3β4, α-CTx AuIB étant le plus puissant 72 . Cette α-conotoxine a été utilisée pour montrer l'implication de sous-types distincts de nAChR dans la modulation de la libération de [ 3 H]NE, [ 3 H]ACh et [ 3 H]DA par l'hippocampe, le noyau interpédonculaire et les synaptosomes striataux, respectivement 72, 97 .

Α-Conotoxines PnIA et PnIB

α-CTx PnIA et PnIB ont été purifiés à partir du venin de Conus pennacé 98 . Les deux toxines ont une modification post-traductionnelle, la sulfotyrosine en position 15 99 cependant, les caractérisations fonctionnelles ont toutes été réalisées avec des toxines synthétiques non sulfatées. Bien qu'ils ne diffèrent que par deux acides aminés, -CTx PnIA est un puissant bloqueur de 3β2 nAChR, tandis que α-CTx PnIB bloque α7 nAChR plus puissamment 100 .

La substitution de Ala10 dans -CTx PnIA par Leu, trouvé en position homologue dans α-CTx PnIB, déplace la sélectivité de α-CTx PnIA[A10L] vers α7, avec une puissance encore supérieure à α-CTx PnIB 100, 101 . La troncature systématique de la deuxième boucle affecte la puissance de -CTx PnIA[A10L] à la fois pour le 7 nAChR et AChBP en raison de la perte de plusieurs liaisons hydrogène entre la toxine et le récepteur lors de la troncature de la toxine 102 . Le remplacement d'Asn11 par Ser dans -CTx PnIA, l'autre résidu différent entre -CTx PnIA et -CTx PnIB, a entraîné une perte de puissance pour les nAChR 100 3β2 et α7.

Des études de structure-activité ont localisé des résidus dans la sous-unité α3 qui confèrent une affinité pour α-CTx PnIA. Ceux-ci incluent Pro182, Ile188 (également trouvé pour interagir avec -CTx MII) et Gln198 103 . Les trois résidus se sont avérés être situés dans la boucle C de la sous-unité. Les résidus de sous-unité β2 qui interagissent avec -CTx PnIA sont les mêmes résidus qui interagissent également avec -CTx MII et -CTx GID75. L'ajout d'une charge positive supplémentaire à l'extrémité C-terminale de -CTx PnIA[A10L] pour produire l'analogue α-CTX PnIA[A10L, D14K] a amélioré l'affinité de la toxine pour Lymnée et Aplysie AChBP 33, 104 . Une étude récente a présenté la structure cristalline du -CTx PnIA[A10LD14K] lié à Aplysie AChBP et indiqué des interactions principalement hydrophobes et hydrophobes/aromatiques entre l'analogue et la poche de liaison de l'AChBP 104 . L'analyse des mutants à double cycle a également indiqué des interactions hydrophobes et aromatiques par paires entre α-CTx PnIB et 7 nAChR 105 .

Α-Conotoxine BuIA

α-CTx BuIA a été cloné à partir d'ARN extrait du venin de Cône bullatus 106 . Semblable au nAChR musculaire bloquant le PIB α-CTx, il possède un espacement de boucle de cystéine de 4/4. Contrairement à d'autres α-conotoxines, -CTx BuIA n'est pas spécifique d'un sous-type particulier de nAChR, bloquant presque tous les sous-types neuronaux avec une puissance nanomolaire, à l'exception de α4β2 106 . Cependant, sa cinétique différentielle permet de distinguer les nAChR qui contiennent soit une sous-unité 2 soit une sous-unité β4 : le bloc de β2 * nAChR est rapidement inversé alors que le bloc de β4 * nAChR n'est que lentement inversé lors de l'élimination de la toxine 106 . Les résidus de sous-unité qui sont essentiels à ces différences hors taux ont été déterminés et, fait intéressant, sont les mêmes résidus qui interagissent avec un certain nombre d'autres α-conotoxines 75, 107. Deux études ont résolu la structure de α-CTx BuIA 108, 109 . Cette dernière étude a montré que la structure globulaire native de la -CTx BuIA est très flexible et conserve de multiples conformations en solution, contrairement à d'autres α-conotoxines qui ont une structure globulaire rigide 109 . Cette caractéristique structurelle à conformations multiples peut sous-tendre le profil de sélectivité promiscuité de la toxine.

La cinétique différentielle de -CTx BuIA a été utilisée pour déterminer l'étendue de la participation des sous-unités 2 et 4 dans les nAChR sur les terminaux noradrénergiques hippocampiques de rat et de souris. Ces études ont indiqué la présence de la sous-unité β4 dans tous les nAChR des terminaux de rat, mais sa présence dans seulement 60 % des nAChR de souris 73 .

Α-Conotoxines PeIA, RgIA et Vc1.1

Il a été démontré que trois α-conotoxines récemment découvertes ciblent le nAChR 9α10, un sous-type avec une pharmacologie très inhabituelle par rapport aux autres nAChR 110, 111 . α-CTx PeIA, cloné à partir du venin de Conus pergrandis, bloque les nAChR 9α10 exprimés de manière hétérologue, ainsi que les nAChR 9α10 natifs dans les cellules ciliées cochléaires avec IC50s d'environ 7 et 4 nmol/L, respectivement 112 . Cependant, cette toxine est également un puissant bloqueur des nAChR 3β2 et chimériques α6/α3β2β3 avec IC50s d'environ 23 et 30 nmol/L, respectivement 112 .

α-CTx RgIA, cloné à partir du venin d'espèces marines chassant les vers Conus regius, est une autre conotoxine α4/3 similaire à -CTx ImI (Figure 1) cependant, contrairement à α-CTx ImI, c'est un bloqueur beaucoup plus puissant de α9α10 que α7 nAChRs 113 et l'antagoniste α9α10 le plus sélectif rapporté à ce jour. α-CTx Vc1.1, cloné à partir du venin de Conus victoriae, est une conotoxine 4/7 dont il a été démontré à l'origine qu'elle bloque les nAChR trouvés dans les cellules chromaffines surrénales 114, 115 . De plus, ce peptide bloque les réponses inflammatoires vasculaires évoquées par la stimulation électrique des nerfs sensoriels non myélinisés 114 . Une caractérisation pharmacologique plus poussée de cette -conotoxine a indiqué qu'il s'agit d'un puissant inhibiteur du 9α10 nAChR 116, 117 . Contrairement à α-CTx RgIA, cependant, natif α-CTx Vc1.1 (appelé Vc1a) contient trois modifications post-traductionnelles : une hydroxyproline en position 6, un γ-carboxyglutamate en position 14 et une extrémité C-terminale 117 amidée. -CTx RgIA et -CTx Vc1.1 se sont avérés être des agents analgésiques efficaces dans un modèle de rat de lésion nerveuse 116, 117, 118 et α-CTx Vc1.1 (nom du médicament ACV1) sont entrés dans les essais cliniques de phase II chez traitement de la douleur neuropathique 119 . Cependant, le rôle des nAChR 9α10 dans la médiation de cet effet analgésique a été contesté 117, 120.

Les données structure-activité avec α-CTx RgIA ont indiqué que cette toxine se lie au site de liaison ACh sur le récepteur et que les résidus de toxine Asp5, Pro6, Arg7 et Arg9 sont importants pour l'interaction avec α9α10 nAChRs121 . La structure tridimensionnelle récemment publiée de -CTx RgIA confirme également un rôle important pour Arg9 dans l'interaction avec les résidus chargés négativement dans le 9α10 nAChR 122 . Différence de transfert de saturation Études RMN examinant la liaison de α-CTx Vc1.1 à Lymnaea stagnalis AChBP, un homologue structurel proche du site de liaison 7 nAChR, indique un rôle pour Tyr10 dans la liaison à l'AChBP 123 . Fait intéressant, ce résidu dans -CTx RgIA ne semble pas être important pour l'interaction avec α9α10 nAChRs 121 .

-Conotoxine TxIA

α-CTx TxIA, du venin de Conus textile, a été récemment découvert en utilisant une nouvelle approche pour l'identification de nouvelles α-conotoxines à partir de venin brut 124 . Dans cette approche, le venin de Conus textile a été projeté contre le Lymnée AChBP dans un essai de liaison par compétition avec 125 I-α-bungarotoxine. La caractérisation biochimique a indiqué que l'-CTx TxIA appartient à la famille des conotoxines α4/7 et a la même disposition de la cystéine et la même connectivité disulfure que les autres -conotoxines de cette famille. Des tests de liaison et fonctionnels ont indiqué que l'affinité de cette toxine pour Lymnée L'AChBP (1,7 nmol/L) était plus élevée que les autres α-conotoxines précédemment identifiées, et que la -CTx TxIA avait une puissance élevée pour les 3β2 nAChR. Etudes structure-activité, avec co-cristallisation d'un analogue de α-CTxIA, α-CTx TxIA[A10L], avec Aplysie L'AChBP a indiqué un rôle important pour un résidu hydrophobe à longue chaîne en position 9 ou 10 et l'Arg en position 5 pour l'affinité de la toxine pour AChBP et α7, mais pas α3β2, nAChRs 124

Α-Conotoxine Lp1.1

α-CTx Lp1.1 a été cloné à partir de l'ADN génomique et de l'ADNc de Conus léopard 125 . Bien qu'elle appartienne à la famille des conotoxines α4/7, sa séquence primaire est unique en ce qu'elle manque des Ser et Pro conservés qui se trouvent dans la première boucle de toutes les α-conotoxines neuronalement actives connues (tableau 2). Cette toxine provoquait une nage non coordonnée lorsqu'elle était injectée par voie intramusculaire à des poissons. À des concentrations plus élevées, il provoque des convulsions et une paralysie 126 . Fait intéressant, une autre conotoxine α4/7 (LeD2) isolée d'un autre Cône espèce, Conus litteratus, a la séquence identique à Lp1.1 127 .

Α-Conotoxines ArIA et ArIB

Nous avons récemment identifié deux nouvelles α-conotoxines du venin de Conus arenatus, -CTx ArIA et -CTx ArIB 128 . Les deux appartiennent à la famille des conotoxines α4/7 et sont de puissants bloqueurs du nAChR 7. Cependant, les deux toxines bloquent également le 3β2 nAChR avec une puissance nanomolaire 128 . Une analyse structure-fonction a été utilisée pour créer deux analogues de -CTx ArIB, -CTx ArIB[V11L V16A] et α-CTx ArIB[V11L V16D], qui ont une affinité élevée pour α7 nAChR mais ont une activité comparativement faible sur α3β2 nAChR 128 . Par rapport à la -bungarotoxine, cependant, la cinétique hors vitesse plus rapide des analogues de -CTx ArIB en fait des ligands utiles dans les expériences de liaison à l'équilibre. -CTx ArIB[V11L V16D] bloque les nAChR 128, 129 de rat, de souris et d'humain. Une version radiomarquée, 125 I-α-CTx ArIB[V11L V16A], a également été développée 130 .


Coeur

Une introduction aux récepteurs

UNE récepteur est une molécule de protéine qui se lie à une molécule de signalisation chimique - appelée ligand – et subit un changement de conformation qui active une voie de signalisation pour finalement provoquer une réponse cellulaire. L'activation d'un récepteur est souvent suivie d'une deuxième messager production, qui peut activer les cascades de signalisation intracellulaires - ce processus est connu sous le nom transduction du signal.

Il existe plusieurs classes de récepteurs :

  • Récepteurs couplés aux protéines G
  • Récepteurs tyrosine kinase
  • Canaux ioniques ligand-dépendants
  • Récepteurs intracellulaires

Cet article se concentrera sur Récepteurs couplés aux protéines G et leurs voies de signalisation respectives.

Structure des GPCR et des protéines G

Les récepteurs couplés aux protéines G, également connus sous le nom de récepteurs 7-TM, sont récepteurs de surface cellulaire (c'est-à-dire qu'ils sont présents sur la membrane plasmique). Un GPCR consiste en un un seul polypeptide chaîne avec une extrémité N-terminale extracellulaire, une extrémité C-terminale intracellulaire et 7 domaines transmembranaires. Le site de liaison au ligand peut être formé soit par l'extrémité N-terminale, soit par les 2ème et 3ème domaines transmembranaires.

Image - Structure d'un récepteur couplé à une protéine G dans une membrane, montrant les 7 domaines transmembranaires

SimpleMed original par Thomas Burnell

Les protéines G, également connues sous le nom de protéines de liaison aux nucléotides de la guanine, sont protéines membranaires périphériques. Ils se composent de 3 sous-unités : une alpha sous-unité et un bêta-gamma sous-unité (les sous-unités bêta et gamma sont fusionnées en permanence).

Transduction du signal

Lorsqu'un ligand (un agoniste dans ce cas) se lie à son GPCR, le GPCR subit une changement conformationnel et on dit qu'il s'active. Ceci peut être résumé par l'équation R => R*. Le GPCR activé interagit alors avec sa protéine G associée en provoquant GTP à échanger contre du PIB sur la protéine G alpha sous-unité. Cet échange GTP-GDP se traduit par séparation des sous-unités alpha et bêta-gamma. Ces sous-unités peuvent ensuite activer divers effecteur protéines – celles-ci incluent les enzymes seconds messagers et les canaux ioniques.

Schéma - Activation et désactivation d'un GPCR

SimpleMed original par Josh Bray

Différents types de protéines G activent différentes voies de signalisation. En général, la sous-unité G-alpha aura un effet stimulateur ou inhibiteur sur une enzyme qui génère une seconde molécule messagère qui va ensuite activer différentes cascades de signalisation. La sous-unité bêta-gamma peut également être impliquée dans la signalisation, mais dans cet article nous nous concentrerons sur le alpha sous-unité.

Il y a 3 sous-types principaux de la protéine G-alpha :

gs: Le G-alphas protéine active l'enzyme adénylylcyclase, qui génère le second messager, AMP cyclique (camp), de l'ATP. L'AMPc active protéine kinase A (PKA) en le liant et en le délestant de ses sous-unités réglementaires. La PKA est une enzyme kinase qui phosphorylates diverses protéines, entraînant l'activation ou l'inhibition de la protéine cible. Cette réaction peut faire partie d'une cascade de signalisation plus large.

gje: Le G-alphaje protéine jeinhibe l'adénylyl cyclase, résultant en AMPc réduit génération et donc activité PKA réduite.

gq: Le G-alphaq protéine active l'enzyme phospholipase C, qui convertit PIP2 (un phospholipide) à IP3 et DAG (seconds messagers). Une hausse de la propriété intellectuelle3 est généralement suivi d'un augmenter en calcium intracellulaire car il stimule la libération de calcium du réticulum endoplasmique lisse (voir article sur le transport membranaire et la signalisation calcique).

Diagramme - Voies d'activation communes en aval des récepteurs couplés aux protéines G. Dans ce diagramme, les lignes se terminant par des flèches (comme agir sur l'adénylyl cyclase dans Gs) indiquent une augmentation de l'action, et les lignes se terminant par une forme « T » (comme agir sur l'adényly cyclase dans Gi) indiquent une diminution de l'action.

SimpleMed original par Thomas Burnell

Afin de terminer la signalisation, la sous-unité G-alpha a un domaine GTPase intrinsèque, qui hydrolyse lentement le GTP lié au PIB. Une fois l'hydrolyse terminée, les sous-unités alpha et bêta-gamma se réassemblent et redeviennent inactives, ce qui entraîne l'arrêt de la signalisation.

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Amplification du signal

Le phénomène d'amplification du signal signifie que seules quelques molécules de ligand sont nécessaires pour provoquer une réponse cellulaire relativement importante.

L'amplification du signal est réalisée via cascades de signalisation, où une enzyme active une autre enzyme, qui à son tour active une autre enzyme, et ainsi de suite. Le signal est amplifié à chaque niveau de la cascade car une seule molécule d'enzyme est capable d'activer plusieurs autres molécules de protéines.

Exemples cliniquement pertinents

Les GPCR sont importants dans la réponse tissulaire à la système nerveux autonome. Les tissus peuvent exprimer adrénorécepteurs - qui répondent aux libérés sympathiques (ni)adrénaline - et/ou récepteurs muscariniques, qui répondent à la libération parasympathique acétylcholine (Ach). Le couplage de ces récepteurs à leurs protéines G respectives peut être rappelé en utilisant « QISS QIQ’.

  • Alpha-1 => Gq
  • Alpha-2 => Gje
  • Bêta-1 => Gs
  • Bêta-2 => Gs
  • M1 => Gq
  • M2 => Gje
  • M3 => Gq

Tableau - Un résumé des GPCR

SimpleMed original par Joshua Bray

Adrénorécepteurs alpha-1 sont exprimés en muscle lisse artériolaire périphérique – la stimulation de ces récepteurs entraîne une contraction des muscles lisses et, par conséquent, vasoconstriction.

Adrénorécepteurs bêta-1 peut être trouvé dans le cœur – la stimulation de ces récepteurs provoquera une augmentation de la fréquence cardiaque et de la contractilité.

Adrénorécepteurs bêta-2 peuvent être trouvés dans muscle lisse bronchiolaire et aussi muscle lisse vasculaire dans les artérioles alimentant le les muscles squelettiques et myocarde (c'est-à-dire les artères coronaires) - la stimulation de ces récepteurs entraîne une relaxation des muscles lisses et donc bronchodilatation et vasodilatation respectivement.

Rappelles toi: 'Un coeur, deux poumons' (Bêta-1, Bêta-2).

Les cœur exprime aussi récepteurs M2 – la stimulation de ces récepteurs provoquera la fréquence cardiaque à diminuer.


Récepteur muscarinique M3

Le récepteur muscarinique M3 (AChM3R), similaire à l'AChM1R, est majoritairement couplé aux protéines Gq (tableau 1). Ce couplage lie AChM3R à l'enzyme membranaire phosphoinositidase C (PIC-β), après quoi l'activation d'AChM3R améliore l'activité de PIC-β, provoquant éventuellement la formation d'IP3 et de DAG. Comme indiqué précédemment, ces deux molécules agissent comme des seconds messagers pour mobiliser les réserves intracellulaires de Ca 2+ et activer la voie PKC (81, 96). AChM3R est largement exprimé dans de nombreux tissus centraux et périphériques et est ainsi impliqué dans une variété de fonctions cellulaires et organiques (62). Cependant, comme pour l'AChM1R, il existe des preuves suggérant que le couplage de l'AChM3R aux protéines G est promiscuité et que la puissance agoniste est influencée par la quantité et le type de protéines G disponibles. Par conséquent, non seulement le couplage de la protéine G joue un rôle important dans les réponses physiologiques, mais les variations de la constitution des tissus le font également (81). En raison des complexités de signalisation et des localisations nouvellement découvertes de l'AChM3R, son rôle physiologique dans le corps et son implication potentielle dans diverses pathologies restent fortement étudiés (88).

Le rôle de l'AChM3R dans le cœur a été un sujet d'intérêt pour les scientifiques depuis son identification initiale. La distribution de l'AChM3R dans le cœur est assez distincte. L'ARNm de l'AChM3R a été trouvé dans l'oreillette et les ventricules du cœur humain, bien que l'ARNm de l'AChM2R soit apparu en plus grande abondance (105, 111). Les résultats montrent que l'expression des récepteurs de l'AChM3R n'est pas uniformément répartie dans le cœur, mais est exprimée 10 fois plus dans les ventricules que dans l'oreillette. De plus, des expériences d'immunocoloration sur des myocytes ventriculaires humains rapportent que l'AChM3R se concentre sur les disques intercalés par rapport à d'autres zones de la membrane cellulaire (110). L'intérêt des chercheurs a conduit à la découverte de plusieurs fonctions des récepteurs cardiaques AChM3R. L'AChM3R active non seulement la voie PKC, mais aussi le courant potassique à redressement retardé, aidant à réguler la fréquence cardiaque et la repolarisation (8, 11, 111). L'activation de l'AChM3R a également été rapportée chez le rat comme ayant des effets cytoprotecteurs contre les lésions myocardiques, en particulier celles associées à l'ischémie. Ces résultats ont été inversés avec un traitement antagoniste de l'AChM3R (120). Des études montrent que l'activation de l'AChM3R cardiaque peut activer plusieurs molécules de survie telles que BCL-2 et ERK augmenter les antioxydants réduire les médiateurs apoptotiques, Fas et p38 MAPK et réduire la surcharge en Ca 2+ (111, 120). La distribution au niveau du disque intercalé suggère que l'AChM3R a également un rôle dans la communication cellule-cellule à la jonction lacunaire. Dans cette région, des études de co-immunoprécipitation indiquent une association entre AChM3R et Connexin 43, un canal de jonction lacunaire. Il est proposé que cette interaction puisse être utile pour coordonner les taux de repolarisation des cardiomyocytes (124). Certaines études suggèrent que les récepteurs couplés aux protéines Gq liés à PIC-β subissent une désensibilisation rapide, potentiellement causée par une accumulation biphasique d'IP3. Par conséquent, la fonction d'AChM3R dans le cœur semble diversifiée, mais des études supplémentaires sont encore nécessaires pour comprendre comment la désensibilisation et d'autres facteurs tels que les changements d'expression et la séquestration influencent la transduction du signal d'AChM3R en ce qui concerne ses rôles physiologiques normaux (Fig. 1) (81 , 82, 88).

Fig. 1.Le récepteur muscarinique de l'acétylcholine M3 (AChM3R) fonctionne dans le système cardiaque. L'activation de l'AChM3R peut activer plusieurs molécules de survie telles que BCL-2 et ERK, réduire les médiateurs apoptotiques, Fas et p38 MAPK et réduire la surcharge en Ca 2+, conduisant à une cytoprotection et à une amélioration de la fonction cardiaque. De plus, l'association entre AChM3R et Connexin-43, un canal de jonction lacunaire, peut être utile pour coordonner les taux de repolarisation des cardiomyocytes. D'autre part, l'activation de l'AChM3R active le courant potassique de redressement retardé, aidant à réguler la fréquence cardiaque et la repolarisation.

AChM3R peut également être trouvé dans le système vasculaire, en particulier, à la fois dans la couche de cellules endothéliales et dans les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC). Fait intéressant, cette distribution produit une réponse qui dépend principalement de l'endothélium chez les félins, l'activation de l'AChM3R avec un endothélium intact conduit à une vasodilatation, tandis que l'activation du muscle lisse en l'absence d'endothélium induit une vasoconstriction (24, 48). Bien qu'il soit possible qu'une relaxation dépendante de l'endothélium se produise à travers plusieurs vasodilatateurs, le NO, le facteur hyperpolarisant dérivé de l'endothélium et la prostacycline, une étude utilisant des souris muscariniques knock-out (KO) a rapporté AChM3R médiant la vasodilatation dans les artères fémorales et aortiques par le NO seul (6 ). Il est largement admis que l'AChM3R dans les cellules musculaires lisses entraîne une augmentation du Ca 2+ , induisant ainsi une constriction, mais le système vasculaire constitue un cas unique car le NO diffuse des cellules endothéliales vers les CMLV, permettant à la dilatation de se produire (Fig. 2) (38 ). Des tests de perméabilité in vitro ont impliqué AChM3R dans la fonction de barrière endothéliale, en particulier l'adhésion cellule-cellule médiée par la E-cadhérine. Une exposition prolongée à l'iodure de 1,1-diméthyl-4-diphénylacétoxypipéridinium (4-DAMP), avec une activité antagoniste AChM3R, a montré une diminution de la perméabilité endothéliale (16, 57). Ainsi, dans les pathologies où la couche endothéliale est endommagée ou enlevée, l'activation d'AChM3R sur les CMLV provoque une vasoconstriction (38). Comme l'AChM2R, l'AChM3R préjonctionnelle est également impliquée dans la relaxation de l'artère cérébrale (2). Fait intéressant, des expériences dans les artères cérébrales bovines ont rapporté que l'AChM3R inhibe la libération d'acétylcholine et de noradrénaline, suggérant que l'AChM3R a une fonction régulatrice médiant à la fois la constriction et la dilatation des artères cérébrales (33).

Figure 2.Voie de biosynthèse du NO stimulée par les récepteurs dans les cellules endothéliales et ses effets sur le muscle lisse vasculaire. La cellule endothéliale convertit une réponse Gq (augmentation du Ca 2+ ) en une réponse Gs (augmentation de l'AMP cyclique), un effet indirect de la stimulation AChMR sur le muscle lisse vasculaire pour produire une vasodilatation vasculaire. ACh, acétylcholine Ca 2+ , calcium L-Arg, L-arginine eNOS, monoxyde d'azote synthase endothélial NO, monoxyde d'azote cGMP, guanidine monophosphate cyclique cAMP, adénosine monophosphate cyclique.


Résultats

Sous-unités α7 de surface cellulaire qui ne se lient pas à Bgt

L'expression hétérologue des sous-unités 7 dans de nombreuses lignées cellulaires différentes entraîne peu ou pas d'expression des sites de liaison à Bgt (Cooper et Millar 1997 Rangwala et al. 1997). En revanche, l'expression d'une sous-unité chimérique, composée du NH extracellulaire2-la moitié terminale de la sous-unité α7 et la moitié COOH-terminale de la 5HT3 sous-unité, produit des niveaux élevés de sites de liaison au Bgt (Corringer et al. 1995 Rangwala et al. 1997). Pour déterminer si les sous-unités 7 dépourvues de sites de liaison Bgt arrivent à la surface des cellules, nous avons généré une protéine de fusion de la sous-unité 7 avec une étiquette d'épitope HA sur l'extrémité COOH (α7-HA). La même étiquette d'épitope HA a également été fusionnée à l'extrémité COOH du 7/5HT3 sous-unité chimérique. Comme illustré sur la figure 1A, l'épitope HA devait avoir une localisation extracellulaire, étant donné la topologie membranaire prédite. Cellules intactes exprimant α7/5HT3Les sous-unités -HA ont été intensément colorées par l'Acm anti-HA (Fig. 1 B), et nous concluons que l'épitope HA et l'extrémité COOH du 7/5HT3Les sous-unités -HA sont situées dans le domaine extracellulaire du récepteur. Transfection transitoire de α7/5HT3Les sous-unités -HA dans les cellules tsA201 entraînent une expression dans environ 50 % des cellules, comme déterminé en comparant la coloration des noyaux DAPI (Fig. 1 B, panneaux de gauche) avec la coloration mAb anti-HA. Conformément à la liaison de Bgt à ces récepteurs, toutes les cellules colorées par le mAb anti-HA étaient également fortement colorées par TMR-Bgt (Fig. 1 B, panneaux du milieu).

À la lumière des découvertes antérieures selon lesquelles l'expression des sous-unités 7 ne produit pas de sites de liaison à Bgt, il était surprenant qu'un grand nombre de cellules transfectées avec la sous-unité α7-HA soient colorées positivement avec l'Acm anti-HA (Fig. 1 B). Comme prévu, aucune cellule ne s'est colorée positivement avec TMR-Bgt. Ainsi, les sous-unités 7-HA à la surface de ces cellules manquent de sites de liaison Bgt. Les quantités relatives de surface cellulaire α7-HA et α7/5HT3Les sous-unités -HA ont été déterminées en utilisant le mAb anti-HA et la 125 I-protéine A. La figure 1 C illustre que α7/5HT3L'expression de la sous-unité -HA était six fois plus élevée que l'expression de la sous-unité α7-HA. La raison de la différence dans les niveaux d'expression de surface n'est pas claire, mais elle n'est pas causée par des différences de taux de α7-HA et α7/5HT3-Synthèse de la sous-unité HA (voir Fig. 3 et Fig. 4).

Les complexes de sous-unités de surface α7 ne sont pas fonctionnels

Étant donné qu'un nombre important de sous-unités 7 sont transportées à la surface des cellules transfectées, nous avons examiné si ces sous-unités forment des récepteurs fonctionnels. Nous avons testé la sensibilité à la nicotine de cellules tsA201 transfectées avec le 7/5HT3-HA construit et coloré avec l'anticorps anti-HA. Dans les enregistrements de tension de cellule entière, 15 des 15 cellules ont répondu à la nicotine avec des courants entrants robustes qui se sont désensibilisés en présence continue de l'agoniste, comme prévu pour une réponse médiée par l'AChR (Fig. 2 A). Dans les mêmes cultures, les cellules qui ne se sont pas colorées positivement avec l'anticorps anti-HA n'ont pas répondu à l'application de nicotine (

Différences entre α7 et α7/5HT3 État redox de la sous-unité

Identifier la base des différences entre α7-HA et α7/5HT3-HA sous-unités, nous avons effectué une série d'expériences qui ont comparé le traitement des deux sous-unités. Pour l'AChR de type musculaire, la formation du site de liaison Bgt nécessite une liaison disulfure de deux résidus cystéine dans le NH extracellulaire2-terminal de la sous-unité α1 (Mishina et al. 1985 Sumikawa et Gehle 1992 Green et Wanamaker 1997). Parce qu'un ensemble homologue de résidus de cystéine se trouve sur l'extracellulaire, NH2-domaine terminal de α7 et α7/5HT3 sous-unités, nous avons testé si les sous-unités diffèrent dans leur état redox. Si l'agent d'alkylation, N-éthylmaléimide (NEM), n'est pas présent lors de la solubilisation des sous-unités marquées, la migration des sous-unités α7 sur des gels non réducteurs était distincte de α7/5HT3 sous-unités (Fig. 3A, pistes 1 et 2). Dans ces conditions, aucune des sous-unités α7 marquées métaboliquement n'a migré à la position attendue de ∼60 kD (Couturier et al. 1990 Schoepfer et al. 1990). Au lieu de cela, les sous-unités 7 ont migré sous forme d'agrégats, c'est-à-dire dans une large masse à des poids moléculaires beaucoup plus élevés. Métaboliquement marqué α7/5HT3 les sous-unités, en revanche, ont migré au poids moléculaire attendu d'un monomère 60-kD, bien que certaines des 7/5HT marquées3 les sous-unités migrent également sous forme d'agrégats. Les différences dans la migration du α7/5HT marqué3 et les sous-unités 7 dans ces conditions indiquent que les deux sous-unités diffèrent dans leur état redox.

L'agrégation de sous-unités est causée par une liaison disulfure des sous-unités car aucun α7 ou α7/5HT3 des agrégats de sous-unités sont observés sur des gels réducteurs (Fig. 3A, pistes 3 et 4), et les sous-unités fonctionnent principalement sous forme de monomères à ∼60 kD. La très large distribution des agrégats sur les gels non réducteurs suggère en outre que les sous-unités sont liées au hasard par des liaisons disulfure à d'autres protéines, ainsi qu'entre elles. Étonnamment, l'agrégation des sous-unités 7 a été empêchée si la NEM était ajoutée pendant la solubilisation des sous-unités (Fig. 3 C) ou même si les cellules intactes étaient brièvement exposées à des concentrations de NEM aussi faibles que 100 M avant la solubilisation (Fig. 3 B). Pour que l'alkylation empêche l'agrégation de sous-unités à liaison disulfure, les sous-unités 7 doivent contenir des groupes sulfhydryle libres qui peuvent être alkylés avant l'agrégation de sous-unités. Parce que les agrégats de sous-unités sont empêchés par l'alkylation des sous-unités, nous concluons que les agrégats sont absents in vivo et doivent se former pendant la solubilisation. De plus, les groupes sulfhydryle libres de sous-unités 7 qui peuvent être alkylés dans les cellules intactes sont en quelque sorte empêchés de former des liaisons disulfure, et cet obstacle est supprimé lors de la solubilisation. Agrégation du α7/5HT3 sous-unités, qui s'est produite dans une moindre mesure que l'agrégation des sous-unités α7 (Fig. 3 A), a également été empêchée par l'alkylation des sous-unités avec NEM (Fig. 3 D et 4 B).

En plus des agrégats et des monomères sous-unitaires sur les gels, α7 et α7/5HT3 les sous-unités se présentent sous la forme d'une échelle de bandes de poids moléculaire plus élevé où chaque barreau est un multiple du monomère (figure 3A, figure C et figure D). Des bandes correspondant aux sous-unités dimères, trimères, tétramères et pentamères ont été observées, mais il n'y avait pas de complexes plus grands que les pentamères (voir Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6). Ces données sont cohérentes avec la complexation des sous-unités α7 en pentamères, similaires à α7/5HT3 des récepteurs de sous-unités (Rangwala et al. 1997) et d'autres AChR caractérisés (Karlin et Akabas 1995). Pour les sous-unités 7, un grand nombre de multimères était présent même sur des gels réducteurs ou alkylés avec NEM, bien que l'alkylation ait dispersé certains des plus gros multimères (Fig. 3 C). Étant donné que la plupart des multimères 7 sont restés étroitement associés même en présence de SDS, ils doivent être maintenus ensemble par des associations résistantes au SDS en plus de toute liaison disulfure. 7/5HT3 des multimères de sous-unités ont également été observés et la plupart sont restés intacts sur des gels réducteurs ou après alkylation NEM (Fig. 3 A et 4 B). Ces associations résistantes au SDS entre les sous-unités sont similaires à celles observées pour d'autres protéines oligomères telles que les sous-unités des canaux K + (Cortes et Perozo 1997). 7/5HT3 des multimères de sous-unités, précipités avec une résine d'affinité Bgt, ont été dispersés après alkylation et réduction par NEM (Fig. 3 D). Ainsi, il y a eu une perte des associations de sous-unités résistantes au SDS après l'apparition des sites de liaison Bgt sur α7/5HT3 sous-unités.

Un ensemble similaire d'expériences a été réalisé en utilisant une construction de sous-unité α7 tronquée juste avant le premier domaine transmembranaire (Tα7-HA Fig. 1 A). Ces sous-unités 7 tronquées s'assemblent en complexes pentamériques, et un petit pourcentage des sous-unités se lie à la fois à Bgt et aux agonistes (Wells et al. 1998). Les sous-unités tronquées ont été marquées métaboliquement après expression transitoire dans des cellules tsA201 et immunoprécipitées avec l'AcM anti-HA. À plusieurs égards, l'état redox des sous-unités tronquées était similaire à celui des sous-unités α7 pleine longueur dans des conditions similaires. Sur les gels non réducteurs en l'absence d'alkylation NEM, la plupart des sous-unités tronquées ont migré sous forme d'agrégats (Fig. 3 E, piste 1). Avec ou sans NEM dans le tampon solubilisant, des multimères de sous-unités correspondant à des monomères de sous-unités tronquées à travers des pentamères ont été observés (Fig. 3 E, pistes 1 et 2 Fig. 3 F). Étant donné que les agrégats de sous-unités tronquées et les multimères étaient absents sur les gels réducteurs (Fig. 3 E, piste 3), les agrégats et les multimères résultaient de liaisons disulfure entre les sous-unités. La capacité des sous-unités 7 tronquées à former des agrégats à liaison disulfure et des multimères similaires aux sous-unités α7 pleine longueur indique que la liaison disulfure se produit entre le NH extracellulaire2-domaines terminaux des sous-unités. Il convient également de noter qu'il y avait des différences entre les sous-unités 7 tronquées et pleine longueur. Sur les gels non réducteurs en l'absence d'alkylation NEM, certaines sous-unités tronquées ont migré en tant que monomères. De plus, les multimères de sous-unités tronquées ont totalement disparu sur les gels réducteurs (Fig. 3 E, piste 3), et ainsi, n'ont pas affiché les associations résistantes au SDS des sous-unités α7 pleine longueur.

Formation de liaisons disulfure et changement de α7/5HT3 État redox de la sous-unité

Bien que les agrégats de sous-unités soient des artefacts de solubilisation, leur apparence peut être utilisée comme un dosage de α7 et α7/5HT3 état redox de la sous-unité. Les cellules exprimant l'une ou l'autre sous-unité ont été brièvement marquées métaboliquement et l'état redox des sous-unités a été dosé à différents moments après le marquage (Fig. 4A et Fig. B). Immédiatement après la synthèse des sous-unités, les sous-unités 7 étaient dans un état qui a entraîné des agrégats de sous-unités pendant la solubilisation et sont restées dans cet état après la synthèse (Fig. 4 A). Pratiquement tous les α7/5HT3 les sous-unités étaient également en agrégats sur les gels après leur synthèse (Fig. 4B, deuxième gel, piste 2). Cependant, contrairement aux sous-unités α7, une petite fraction des α7/5HT3 les sous-unités apparaissaient sous forme de monomères sur le gel et étaient donc dans un état redox différent. Le nombre de 7/5HT3 les monomères de sous-unités ont augmenté avec le temps tandis que le nombre d'agrégats de sous-unités a diminué jusqu'à ce que la plupart des α7/5HT3 les sous-unités ont migré sous forme de monomères. Sur la base de ces résultats, nous concluons que α7 et α7/5HT3 les sous-unités sont dans un état redox similaire immédiatement après la synthèse des sous-unités. Les différences observées entre ces sous-unités surviennent au fil du temps et sont causées par des événements de traitement qui convertissent α7/5HT3 sous-unités de l'état redox où les sous-unités sont agrégées à l'état où les sous-unités migrent sous forme de monomères sur les gels.

Pour tester si des liaisons disulfure se forment sur α7/5HT3 sous-unités pendant le changement d'état redox des sous-unités, l'agent réducteur, le DTT, a été appliqué aux cellules après avoir marqué métaboliquement les sous-unités (Fig. 4 C). Lorsqu'il est ajouté au milieu des cultures, le DTT imprègne les cellules et empêche la formation de liaisons disulfure protéiques dans le RE et réduit les liaisons disulfure existantes sans altérer la plupart des autres fonctions cellulaires (Braakman et al. 1992). Après l'ajout de 5 mM DTT, le α7/5HT3 les sous-unités sont restées sous forme d'agrégats sur les gels et toute conversion ultérieure en monomères a été bloquée (Fig. 4 C). Notez que le petit nombre de monomères observés sur la figure 4C existe pendant l'impulsion lorsqu'aucun DTT n'était présent et n'augmente pas après l'ajout de DTT. Par conséquent, l'ajout de 5 mM de DTT au milieu cellulaire après le marquage des sous-unités a empêché le changement de α7/5HT3 état redox de la sous-unité. L'effet de la TNT était réversible. Si la TNT a été retirée du support, α7/5HT3 agrégats de sous-unités à nouveau convertis en monomère α7/5HT3 conformation de la sous-unité avec le temps (données non présentées). Sur la base de ces données, nous concluons que des liaisons disulfure se forment sur α7/5HT3 sous-unités lors du changement d'état redox des sous-unités. Le α7/5HT3 les sous-unités, qui résultent du changement d'état redox, migrent sous forme de monomères de sous-unités sur des gels non réducteurs à l'exception des multimères de sous-unités qui se forment lors de la solubilisation en l'absence d'alkylation des sous-unités (voir Fig. 3 D). Les liaisons disulfure qui se forment pendant le changement d'état redox sont donc des liaisons intra-sous-unités.

La formation du site de liaison Bgt coïncide avec le changement de α7/5HT3 État redox de la sous-unité

Puisque les sites de liaison à Bgt se forment sur α7/5HT3 sous-unités et non sur les sous-unités α7 (Fig. 1 B Cooper et Millar 1997 Rangwala et al. 1997), nous avons testé si la formation du site de liaison Bgt est en corrélation avec le changement de α7/5HT3 état redox de la sous-unité. Pour surveiller la formation du site de liaison au Bgt, des aliquotes égales de α7/5HT marqué3 les sous-unités ont été précipitées en utilisant du Bgt-Sepharose ou avec le mAb anti-HA à différents moments après que les sous-unités ont été marquées (Fig. 5A). Il existe une forte corrélation entre l'apparition de sous-unités précipitées par Bgt-Sepharose et le changement de l'état redox des sous-unités, tel qu'évalué par les monomères de sous-unités précipités avec le mAb anti-HA. Le Bgt-Sepharose a précipité presque tous les 7/5HT3 monomères sous-unitaires et de plus petites quantités de α7/5HT3 agrégats de sous-unités. De plus, l'évolution dans le temps de la formation du site de liaison Bgt et l'apparition de α7/5HT3 les monomères sous-unitaires sont indiscernables.

Nous avons également testé si la formation du site de liaison Bgt est bloquée par l'ajout de DTT après le marquage des sous-unités. Encore une fois, 5 mM DTT a été ajouté au milieu des cellules dans lesquelles α7/5HT3 les sous-unités ont été étiquetées. La présence du DTT a bloqué la formation de sites de liaison au Bgt comme le montre l'absence de sous-unités supplémentaires précipitées par Bgt-Sepharose après l'application du DTT au milieu (figure 5B). Par conséquent, la liaison disulfure intrasous-unitaire de α7/5HT3 des sous-unités sont également nécessaires pour la formation du site de liaison à Bgt. De toute évidence, la formation du site de liaison Bgt et le changement d'état redox sont des événements étroitement liés pendant α7/5HT3 l'assemblage des récepteurs comme le montre le blocage des deux événements par la TNT et leur étroite corrélation dans le temps.

Α7 et α7/5HT3 Les complexes de liaison au Bgt contiennent des sous-unités dans différents états redox

Bien qu'il existe une forte corrélation entre l'apparition de monomères de sous-unités sur les gels et la formation de sites de liaison au Bgt, le Bgt-Sepharose a également précipité des agrégats de sous-unités et des multimères (Fig. 5 A et 3 D). Ce résultat indique que la liaison Bgt α7/5HT3 les récepteurs contiennent α7/5HT3 sous-unités dans les deux états redox. Pour tester davantage si les deux conformations sont présentes dans un récepteur, nous avons isolé la liaison Bgt de surface α7/5HT3 récepteurs. Nous avions démontré précédemment que les récepteurs de surface sont une population uniforme de pentamères avec une masse moléculaire de 260 kD et que tous les récepteurs se lient de manière coopérative à l'agoniste (Rangwala et al. 1997). Les cellules intactes ont été liées avec du Bgt imperméable aux cellules, et les récepteurs liés au Bgt ont été immunoprécipités avec des anticorps anti-Bgt pour isoler spécifiquement les récepteurs de surface. Les sous-unités marquées ont été analysées sur des gels non réducteurs et les sous-unités solubilisées en l'absence ou en présence de NEM ont été comparées (Fig. 6A). En l'absence de NEM, des agrégats de sous-unités et des multimères ont été observés avec des monomères de sous-unités. Lorsqu'ils sont alkylés avec du NEM, les agrégats et les multimères sont dispersés, ce qui augmente le nombre de sous-unités monomères sur le gel. Étant donné que les récepteurs de surface sont constitués d'une population homogène de pentamères, nous concluons que les récepteurs de surface contiennent des sous-unités dans les deux conformations redox. L'augmentation environ du double des monomères avec l'alkylation NEM démontre en outre qu'un nombre important de α7/5HT3 les sous-unités des récepteurs de surface liés au Bgt se trouvent dans les deux états redox.

Les lignées cellulaires PC12 et SH-SY5Y ont été utilisées pour examiner le traitement des sous-unités α7 dans les cellules qui produisent des récepteurs α7 fonctionnels liant Bgt. Les cellules PC12 ont des récepteurs de liaison Bgt endogènes qui contiennent des sous-unités 7 (Blumenthal et al. 1997 Rangwala et al. 1997) tandis que les cellules SH-SY5Y expriment de manière stable les sous-unités 7 de rat en plus des sous-unités α7 endogènes (Peng et al. 1994 Puchacz et al. 1994). Les sous-unités 7 dans ces lignées cellulaires sont dépourvues de l'épitope HA et le niveau de synthèse de sous-unités n'est pas aussi élevé que celui obtenu par transfection transitoire. Ces différences nous ont empêché de caractériser les sous-unités α7 dans ces lignées cellulaires au même degré que les 7-HA et α7/5HT3-Sous-unités HA dans les cellules tsA201. Néanmoins, nous avons pu précipiter les sous-unités 7 des cellules SH-SY5Y et PC12 à l'aide de Bgt-Sepharose et effectué une analyse par transfert Western sur les sous-unités 7 des deux lignées cellulaires (Fig. 6b et Fig. c). Le traitement des sous-unités 7 dans les cellules SH-SY5Y et PC12 était différent de celui des sous-unités 7 dans les cellules tsA201. En l'absence d'alkylation NEM, de nombreuses sous-unités α7 dans ces cellules ont migré en tant que monomères sur un gel non réducteur (Fig. 6b et Fig. c, piste 1). De tels monomères n'ont jamais été observés sur des gels non réducteurs avec l'expression des sous-unités α7-HA dans les cellules tsA201. En plus des monomères, il y avait des agrégats de sous-unités et des multimères. Comme la liaison Bgt α7/5HT3 sous-unités dans les cellules tsA201 (Fig. 3 D), les multimères de la sous-unité α7, précipités avec de la résine d'affinité Bgt, ont été dispersés par alkylation et réduction NEM (Fig. 6b et Fig. c, piste 2). Des résultats identiques ont été trouvés pour les PC12 BgtR de surface cellulaire spécifiquement isolés en liant Bgt à des cellules intactes et en immunoprécipitant les récepteurs liés à Bgt avec des anticorps anti-Bgt (Fig. 6C, pistes 4 et 5).

Les sous-unités α7 isolées des cellules SH-SY5Y et PC12 différaient de α7 et α7/5HT3 sous-unité des cellules tsA201 en ce que les sous-unités ont migré sous forme de doublet après l'alkylation NEM sur des gels réducteurs (Fig. 6 B, piste 2 et C, pistes 2 et 4). Les deux bandes doublets sont reconnues par les anticorps spécifiques de 7 sur les transferts Western et sont donc des formes différentes de la sous-unité 7. Dans les mêmes conditions, les bandes doublet sont également observées avec les sous-unités marquées métaboliquement (données non présentées). La bande inférieure du doublet a migré précisément à la même position que la bande de monomère de sous-unité 7-HA exprimée par tsA201 (Fig. 6b et Fig. c, piste 3). La bande inférieure correspond donc à la forme de sous-unité α7 observée dans les cellules tsA201, qui migre à cette position uniquement lorsque l'alkylation NEM empêche l'agrégation et la réticulation des disulfures. La bande supérieure migre plus lentement après l'alkylation que lorsqu'elle est non alkylée (Fig. 6 B, piste 1 et C, pistes 1 et 5), et elle est présumée être dans le deuxième état conformationnel. Il est important de noter que le doublet de sous-unités 7 a été observé dans des conditions qui devraient éliminer toute différence dans l'état redox des sous-unités, c'est-à-dire à la fois l'alkylation NEM et un gel réducteur. La présence de deux bandes de sous-unités 7 dans ces conditions indique que les sous-unités 7 dans ces cellules se distinguent par plus qu'une différence dans l'état redox des sous-unités.


Le financement

Ce travail a été soutenu par le Fonds de recherche du Qu󩯬 – Santé, le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (RGPIN-2017-04790), les Instituts de recherche en santé du Canada (MOP 123389) et le Fondation J.-Louis L&# x00E9vesque à JW. Cette étude a également été rendue possible grâce à une subvention de groupe de la National Sciences Foundation of China (#81361120264) à J-ZS, S-JH, TW et JW, et une subvention de la National Natural Science Foundation of China (#81700363) à YW.


Introduction

Les syndromes myasthéniques congénitaux (SMC) sont des troubles hétérogènes associés à une faiblesse musculaire fatigable due à une marge de sécurité compromise de la transmission neuromusculaire. Actuellement, pas moins de 33 gènes de maladies CMS ont été identifiés. 1-3 Les variants identifiés affectent le développement, la stabilité ou la capacité de transmission de signaux de la jonction neuromusculaire. Environ la moitié des CMS identifiés sont causés par des mutations dans différentes sous-unités du récepteur de l'acétylcholine (AChR).

L'AChR est un canal ionique cationique à ligand pentamérique composé de sous-unités homologues avec une stoechiométrie (α1)21δε. Chaque récepteur a deux sites de liaison, un site de haute affinité formé entre les sous-unités α et et un site de faible affinité entre les sous-unités α et . La sous-unité forme la face principale de chaque site de liaison, et les sous-unités et forment la face complémentaire. Chaque sous-unité contient quatre domaines transmembranaires, le second domaine transmembranaire (M2) de chaque sous-unité formant la paroi du canal ionique. Au sein de M2, les résidus hydrophobes conservés parmi les sous-unités contribuent à la synchronisation des canaux, mais on ne sait pas si les résidus à des positions équivalentes des sous-unités contribuent de manière équivalente à la synchronisation des canaux.

Les mutations des sous-unités AChR peuvent réduire l'expression du récepteur à la surface cellulaire, modifier la cinétique d'activation du récepteur, ou les deux. Les CMS avec défauts cinétiques sont divisés en deux catégories, les CMS à canal rapide (FCCMS) et les CMS à canal lent (SCCMS). Les SCCMS présentent une décroissance lente des potentiels de plaques d'extrémité miniatures (MEPP) ou des courants (MEPC) en raison d'une ouverture prolongée du canal ou d'une réouverture accrue du canal. 4 Pendant l'activité physique, les PPE prolongées s'additionnent en escalier, ce qui dépolarise la membrane postsynaptique et provoque un bloc de dépolarisation qui inactive les canaux sodiques voltage-dépendants. De plus, les EPP prolongées permettent un afflux excessif de calcium dans la région postsynaptique, ce qui initie une dégénérescence focale des plis jonctionnels, une perte d'AChR et une apoptose des noyaux sous-jonctionnels, collectivement appelées myopathie de la plaque terminale. 5 De plus, les AChR des patients SCCMS sont sujets à la désensibilisation, ce qui réduit le nombre d'AChR disponibles pour l'activation. 6 À ce jour, 24 mutations des canaux lents ont été rapportées dans différents domaines des sous-unités AChR, 7 mais seules deux mutations impliquant le même résidu ont été identifiées dans la sous-unité . 8, 9 La plupart des mutations des canaux lents apparaissent dans les domaines transmembranaires des sous-unités AChR, mais l'analyse détaillée de leurs conséquences cinétiques a été entravée par l'incapacité des instruments d'enregistrement à capturer les étapes de déclenchement les plus rapides avec ACh comme agoniste. Par conséquent, la choline, un agoniste faible provoquant un taux d'ouverture de canal plus lent que l'ACh, a été utilisée pour étudier la cinétique d'activation des mutations du SCCMS. 7, 10, 11

Dans cette étude, nous rapportons un patient porteur d'une nouvelle mutation L273F dans le domaine M2 de la sous-unité AChR , évaluons ses effets pathogènes par des études cliniques et morphologiques, et examinons les conséquences cinétiques de la mutation avec la choline comme agoniste. Nous comparons également les conséquences cinétiques de L273F à celles d'une mutation εL269F précédemment rapportée 12 située à une position équivalente à celle de δL273F.


Matériaux et méthodes

Animaux.

Des expériences ont été réalisées sur des souris WT (souche C57BL/6J), des souris α4 −/− , 6 −/− , 4 −/− × α6 −/− et α4vec nAChR âgées de 8 à 21 semaines et pesant 25 à 35 g. Les souris α4 −/− et α6 −/− ont été générées comme décrit précédemment (Matériaux et méthodes SI et réf. 21 et 40).

In Vivo Electrophysiology: Extracellular Single-Cell Recordings.

Les souris ont été anesthésiées avec de l'hydrate de chloral, 400 mg/kg i.p., complétées selon les besoins pour maintenir une anesthésie optimale tout au long de l'expérience, et ont été placées dans un cadre stéréotaxique (David Kopf). La température corporelle a été maintenue à 37 °C au moyen d'une couverture chauffante thermostatée. Tous les animaux avaient un cathéter inséré dans la veine saphène pour i.v. administration de nicotine. Les procédures d'enregistrement électrophysiologique des cellules DA ont été décrites précédemment (14). Après un enregistrement de base de 15 à 30 minutes, 10 L de solution saline (0,9 % de NaCl) ont été injectés par voie intraveineuse. dans la veine saphène, et après 3 à 5 min, de la nicotine (30 g/kg) a été administrée par voie intraveineuse. La dose était basée sur des études antérieures montrant que la nicotine peut être administrée par voie intraveineuse. auto-administré à cette dose chez la souris (41).

Identification des cellules DA.

L'identification extracellulaire des neurones DA était basée sur leur localisation ainsi que sur l'ensemble des propriétés électrophysiologiques uniques qui caractérisent ces cellules in vivo (Matériaux et méthodes SI). Nous avons également marqué certaines cellules avec de la neurobiotine (Fig. 3B) pour calculer le risque de classification erronée d'une cellule non-DA comme dopaminergique (Matériaux et méthodes SI).

Préparation des tranches et voltamétrie.

Des tranches striatales coronales, de 300 um d'épaisseur, contenant à la fois du NAc et du CPu ont été préparées à partir de cerveaux de souris de divers génotypes en utilisant des méthodes décrites précédemment (17, 42). [AD]o a été contrôlé à 32 °C dans du liquide céphalo-rachidien artificiel tamponné au bicarbonate (contenant 2,4 mM de Ca 2+ ) à l'aide d'une voltamétrie cyclique à balayage rapide avec des microélectrodes en fibre de carbone de 10 μm (longueur de la pointe ∼ 50 à 100 m, fabriquées en interne) et un voltmètre Millar (systèmes PD) comme décrit précédemment (17, 42). En bref, la tension de balayage était une forme d'onde triangulaire (plage de -0,7 V à +1,3 V par rapport à Ag/AgCl) à une vitesse de balayage de 800 V/s et une fréquence d'échantillonnage de 8 Hz. Le signal de courant évoqué a été attribué au DA en comparant les potentiels des courants d'oxydation et de réduction de pointe avec ceux du DA dans les milieux d'étalonnage (+500-600 et -200 mV vs Ag/AgCl, respectivement). Les électrodes ont été calibrées dans 2 M de DA dans des milieux expérimentaux. La stimulation électrique par tranche est décrite dans Matériaux et méthodes SI.

Médicaments.

La solution de nicotine pour les mesures in vivo a été préparée comme suit : 0,5 mM de tartrate de nicotine a été dissous dans une solution de NaCl à 0,9 % et ajusté à pH 7,2 à l'aide de NaOH. Une étude préliminaire a montré qu'une solution i.v. l'injection d'une solution témoin (0,9% NaCl/0,5 mM de KNa-tartrate) n'a eu aucun effet sur les caractéristiques électrophysiologiques des neurones DA chez les animaux WT.

Vecteur lentiviral.

Les vecteurs d'expression lentiviraux sont dérivés des vecteurs d'expression pHR′ décrits pour la première fois par Naldini et al. (43), avec plusieurs modifications ultérieures comme indiqué par Maskos et al. (8). Dans le lentivirus utilisé dans cette étude, l'expression bicistronique de l'ADNc de la sous-unité nAChR WT 4 de souris et de l'ADNc EGFP est sous le contrôle du promoteur de la phosphoglycérate kinase de souris (10). Pour les expériences avec des souris 4vec, les contrôles étaient des souris α4-/- et WT injectées avec un lentivirus exprimant EGFP uniquement. (Les détails de l'injection stéréotaxique de lentivirus sont donnés dans Matériaux et méthodes SI.)

125 I-Epibatidine Autoradiographie.

Des coupes coronales (20 µm) ont été incubées à température ambiante avec 200 pM de 125 I-épibatidine (Perkin-Elmer) (activité spécifique 2 200 Ci/mmole) (Perkin-Elmer) dans du Tris 50 mM, pH 7,4, pendant 30 min. Après incubation, les coupes ont été rincées deux fois pendant 5 min dans le même tampon et brièvement dans de l'eau distillée. Les coupes ont ensuite été exposées à des films Kodak Biomax pendant la nuit.

Protocole d'auto-administration.

Pour évaluer les effets de renforcement de la nicotine, nous avons utilisé un modèle murin d'ICSA précédemment décrit (8, 44). Ce modèle est basé sur une tâche de discrimination du labyrinthe en Y entre un bras renforcé de nicotine et un bras neutre (Matériaux et méthodes SI).

Analyses statistiques.

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de R, un langage et un environnement de calcul statistique (http://www.r-project.org).

Quantification du schéma de tir.

Le tir de cellules DA in vivo a été analysé en ce qui concerne le taux de tir moyen et le pourcentage de pointes dans une rafale (Matériaux et méthodes SI). Pour quantifier l'effet de la nicotine, l'activité de chaque cellule a été rééchelonnée par sa valeur de base en moyenne pendant les 2,5 minutes avant l'injection de nicotine. Nous avons utilisé un test de rang signé Wilcoxon non paramétrique apparié pour comparer la fréquence de décharge et le % SWB avant et après l'injection de nicotine. Des tests de Wilcoxon non appariés ont été utilisés pour comparer la fréquence de tir et le % SWB dans deux populations (Matériaux et méthodes SI).

Détection voltamétrique de la dopamine.

Les données sont exprimées en moyenne ± SEM, et la taille de l'échantillon, m, est le nombre d'observations. Chaque ensemble de données représente les résultats de trois animaux ou plus. Les comparaisons des différences de moyennes ont été évaluées par ANOVA à un ou deux facteurs, comparaison multiple post hoc t tests (Bonferroni), ou non appariés t tests à l'aide de GraphPad Prism. L'ajustement des courbes et les régressions linéaires ont été effectués dans GraphPad Prism ou SigmaPlot.


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