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Les cellules cancéreuses peuvent-elles/ont-elles été/ont-elles été utilisées dans des lignées de culture de cellules souches ?


Puisque les cellules cancéreuses ont un potentiel de croissance illimité, peuvent-elles être induites vers la totipotence et la pluripotence ? Si oui, les cellules cancéreuses peuvent-elles être utilisées dans la culture de cellules souches en raison de propriétés similaires de réplication illimitée ? Peuvent-ils même être utilisés dans des lignées cellulaires pour cultiver des virus ?


Les cellules cancéreuses peuvent être et sont utilisées en culture cellulaire. Les cellules HeLa ont été la première lignée cellulaire humaine à être cultivée et elles provenaient d'une tumeur cervicale.

Cela étant dit, les lignées cellulaires cancéreuses ne nécessairement être utilisé pour le travail sur les cellules souches. Ils ont subi trop de mutations pour étudier le type de questions que les cellules souches sont utilisées pour étudier, bien que, comme le souligne MattDMo, les tératomes, des tumeurs qui proviennent de cellules souches, peuvent être utilisés dans la recherche sur les cellules souches comme modèle pour les cellules souches en culture. De plus, ils ne pourraient jamais être utilisés à des fins thérapeutiques.

Quant aux virus, les cellules HeLa ont été utilisées par Jonas Salk pour développer le vaccin contre la polio, les cellules cancéreuses sont donc utilisées dans la recherche virale.

Modifications en italique.


En plus de la réponse d'AMR, les lignées cellulaires cancéreuses sont largement utilisées pour la recherche. Ils ont généralement une croissance rapide. HeLa Long atteint la capacité d'une parabole de 10 cm en environ 48 heures, selon la façon dont vous les divisez. Maintenant, certaines lignées sont différentes des autres et ont chacune leurs avantages/inconvénients, mais le principal derrière elles est qu'elles permettent de visualiser les effets des gènes éliminés/invalidés dans les cellules humaines.

Quant à l'utilisation de virus dans les cultures cellulaires. Ils ne sont pas seulement utilisés pour la recherche virale, mais aussi pour la recherche génomique.

Ce qui est généralement fait est d'introduire un gène dans une lignée de culture cellulaire via un rétrovirus (appelé une transfection rétrovirale). C'est une méthode extrêmement efficace pour créer une lignée cellulaire stable avec votre gène d'intérêt attaché à un gène "fluorescent" afin que vous puissiez le visualiser dans la cellule lorsqu'il est transcrit. Cela conduit à l'immunofluorescence (IF) et à de nombreuses autres techniques couramment utilisées aujourd'hui.

Vous pouvez également introduire un plasmide dans des cellules qui contient un ARNsh qui "détruira" le gène dont vous étudiez les effets. De cette façon, vous pouvez voir ce qui arrive aux cellules lorsque ce gène n'est pas présent (beaucoup fait pour l'étude des protéines de réplication).

La mise en garde est que parfois ces lignées cellulaires peuvent être transitoires (ne durent que quelques passages) ou stables. Ils agissent également tous très différemment, donc généralement pour "prouver votre cas" que la protéine a la fonction que vous pensez qu'elle a, vous devriez faire des expériences avec plusieurs lignées cellulaires cancéreuses différentes.


Concernant votre question sur l'utilisation des cellules cancéreuses dans l'étude des cellules souches :

J'ai effectué des travaux sur les cellules souches et nous avons utilisé diverses lignées cellulaires de tératomes (qui sont des cancers qui ressemblent à des tissus germinaux) en parallèle avec des cellules souches embryonnaires (cellules ES) et des cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS) pour diverses expériences. Bien sûr, le choix du système expérimental dépend entièrement de ce que vous étudiez exactement, mais les tératomes se sont révélés être des systèmes modèles fiables pour examiner certains aspects de la structure, de la fonction et de la différenciation des cellules souches. L'un des plus grands avantages, du moins dans le travail que je faisais, était qu'elles se développaient relativement rapidement et de manière cohérente, tandis que les cellules iPS ou ES peuvent très facilement se différencier spontanément si extrême on ne prend pas soin de les cultiver et de les transmettre. Vous n'avez pas à vous soucier de la variation de donneur à donneur, et ils sont assez tolérants à la congélation et à la décongélation.

Le travail que j'ai fait était dans l'industrie, donc je ne peux malheureusement pas vraiment entrer dans beaucoup de détails, mais j'ai été impliqué dans l'étude de divers facteurs de transcription qui sont responsables du maintien de la pluripotence ainsi que de l'induction de la différenciation, ainsi que des tests diverses techniques d'imagerie de cellules vivantes pour suivre des voies de différenciation particulières. Nous avons fait un certain nombre d'observations à l'aide de tératomes qui se sont directement traduits en systèmes iPS et ES, sans tous les frais généraux requis par ces systèmes.


Les cellules cancéreuses subissent-elles une commutation phénotypique ? Le cas des marqueurs imparfaits des cellules souches cancéreuses

L'identification des cellules souches cancéreuses in vivo et in vitro repose sur des marqueurs de surface spécifiques qui devraient permettre de trier les cellules cancéreuses en sous-populations phénotypiquement distinctes. Des expériences rapportent qu'après un certain temps, les populations de cellules cancéreuses triées ont tendance à exprimer à nouveau tous les marqueurs d'origine, ce qui conduit à l'hypothèse d'une commutation phénotypique, selon laquelle les cellules cancéreuses peuvent se transformer de manière stochastique en cellules souches cancéreuses. Ici, nous explorons une explication alternative basée sur l'hypothèse que les marqueurs ne sont pas parfaits et sont donc incapables d'identifier toutes les cellules souches cancéreuses. Notre analyse est basée sur un modèle mathématique de prolifération des cellules cancéreuses qui prend en compte la commutation phénotypique, les marqueurs imparfaits et les erreurs dans le processus de tri. Notre conclusion est que l'observation de l'expression réversible des marqueurs de surface après tri ne fournit pas de preuves suffisantes à l'appui de la commutation phénotypique.

Les preuves indiquant que les tumeurs sont composées d'une population cellulaire hétérogène se sont accumulées depuis longtemps 1 . Il existe deux hypothèses générales différentes sur la nature de cette hétérogénéité : la première affirme que les cellules cancéreuses pourraient différer mais toutes les cellules sont potentiellement tumorigènes (modèle conventionnel) tandis que la seconde affirme que seul un sous-ensemble de cellules, les cellules souches cancéreuses (CSC), sont tumorigènes et stimulent la croissance tumorale (modèle hiérarchique) 2 . Les CSC sont généralement identifiés à l'aide de transplantations en série, validant une sous-population de CSC candidate en surveillant la capacité à récapituler l'hétérogénéité de la tumeur primaire. La transplantation xéno- et syngénique pourrait, cependant, déformer le véritable réseau complexe d'interactions avec divers supports tels que les fibroblastes, les cellules endothéliales, les macrophages, les cellules souches mésenchymateuses et de nombreux cytokines et récepteurs impliqués dans ces interactions (pour une discussion plus complète, lisez Réf.[ 3 ]). De plus, le succès de cette stratégie est lié au choix d'un marqueur approprié permettant d'identifier correctement la population de CSC à la fois dans les xénogreffes et dans les échantillons biotiques. En raison de ces problèmes, la présence de CSC dans les tumeurs solides est encore débattue.

Dans ce contexte, une hypothèse récemment proposée stipule que les phénotypes dans une population de cellules cancéreuses ne sont pas statiques mais peuvent changer de manière stochastique 4 . L'idée sous-jacente à cette hypothèse de commutation phénotypique est que tout système biologique est soumis à un degré variable de bruit dans les voies de signalisation clés qui peuvent conduire à des changements héréditaires dans l'expression des gènes par le biais de mécanismes épigénétiques 5,6. Pour éviter que ce bruit ne déclenche une réponse cellulaire inappropriée, les systèmes de signalisation peuvent être tamponnés de manière à ce que les cellules répondent pour produire une sortie biologique spécifique, telle qu'un changement de phénotype, uniquement lorsqu'un seuil de signalisation critique est franchi. Dans les cellules cancéreuses, une instabilité phénotypique pourrait être due à des lésions génétiques qui activent constitutivement une voie de signalisation jouant un rôle clé dans la mise en mémoire tampon de la sortie d'une deuxième voie conduisant les cellules à devenir plus sensibles au microenvironnement. Selon cette idée, la commutation phénotypique dans les cellules cancéreuses peut refléter un abaissement du seuil nécessaire pour déclencher un changement d'identité cellulaire en réponse à des signaux externes provenant du microenvironnement tumoral qui peuvent varier considérablement d'un endroit à l'autre. Par conséquent, si la commutation phénotypique est réversible, la plupart des cellules devraient avoir le potentiel d'adopter un phénotype de type cellule souche, ce qui explique la forte proportion de cellules capables d'ensemencer des tumeurs chez les animaux gravement immunodéprimés 7,8. Dans un article récent, Gupta et al. montrent que des sous-populations de cellules cancéreuses du sein d'un état phénotypique donné expriment à nouveau tous les phénotypes originaux au cours du temps. Ces résultats sont interprétés par un modèle de Markov simple impliquant une faible probabilité pour les cellules cancéreuses de revenir à l'état CSC 4 . D'autres articles, cependant, ne soutiennent pas l'hypothèse de commutation phénotypique. Dans le mélanome, les cellules ABCB5 - ne sont pas capables de générer des cellules ABCB5 + 9 , CD34 + Cd271/Ngfr/p75 - les cellules ont formé des tumeurs CD271 - restreint, tandis que CD34CD271/Ngfr/p75 - les cellules ont formé des tumeurs contenant à la fois des cellules CD271 + et CD271 - 10 .

Du point de vue biologique, il n'est pas facile de déterminer si la tumeur se développe selon le modèle conventionnel ou hiérarchique et de comprendre la nature de la commutation phénotypique. À cet égard, les modèles mathématiques peuvent s'avérer très utiles pour clarifier les conséquences des hypothèses biologiquement motivées. La question clé est d'expliquer comment une sous-population purifiée peut exprimer des marqueurs CSC après tri. Une explication possible est fournie par l'hypothèse de commutation phénotypique : si les phénotypes évoluent dynamiquement, il est possible que les cellules initialement négatives pour le phénotype CSC puissent l'exprimer plus tard en raison de fluctuations stochastiques (voir Fig. 1A). Cette explication est quelque peu problématique du point de vue conceptuel : si les cellules cancéreuses (CC) peuvent se retransformer en CSC, la notion même de CSC devient floue. Une distinction essentielle entre les CSC et les autres CC est que les premiers génèrent les seconds et non l'inverse. De plus, le CSC devrait être pratiquement immortel tandis que les CC devraient cesser de se répliquer après un nombre fini de divisions. Une fois que nous acceptons que les CC puissent retourner à l'état CSC, ils deviennent également potentiellement immortels. D'où la distinction entre la commutation phénotypique et le modèle conventionnel d'origine risque de devenir purement sémantique.

(A) Selon l'hypothèse de commutation phénotypique, les CC (bleu) ont une faible probabilité de revenir à l'état CSC (rouge). Si un marqueur est utilisé pour trier les cellules en différentes sous-populations, la sous-population négative finira par exprimer à nouveau le marqueur en raison de la commutation phénotypique. (B) Selon l'idée du marqueur imparfait, les CC ne peuvent pas se retransformer en CSC, mais les CC et les CSC expriment le marqueur, bien que dans des proportions différentes : la plupart des CSC sont positifs, tandis que la plupart des CC sont négatifs.

Dans cet article, nous explorons une alternative conceptuellement simple pour expliquer les résultats expérimentaux. L'identification opératoire des CSC repose sur des marqueurs de cellules souches, mais leur précision absolue est loin d'être garantie. Notre proposition est de supposer que les marqueurs CSC putatifs sont imparfaits et de dériver les conséquences expérimentales de cette hypothèse (voir Fig. 1B). Un marqueur imparfait donne une sous-population marqueur positif qui est riche en CSC, mais ne permet pas d'éliminer tous les CSC de la sous-population marqueur négatif. Les quelques CSC présentes dans la sous-population à marqueurs négatifs entraîneront la croissance tumorale et rétabliront une sous-population à marqueurs positifs dans la tumeur. Ce scénario a été exclu dans la Réf. [ 4 ] parce que le taux de croissance à court terme des cellules souches et non souches était similaire. Nous montrons ici que cette observation peut aussi s'expliquer par l'hypothèse du marqueur imparfait, puisqu'une différence de croissance n'est observable qu'à long terme, comme le montre également la Réf. [ 11 ]. Notre conclusion est que les données expérimentales actuelles qui ont été revendiquées pour soutenir l'hypothèse de commutation phénotypique 4 peuvent également être interprétées dans un scénario de marqueur imparfait.

Pour modéliser la cinétique des cellules cancéreuses, nous utilisons une approche standard de la dynamique des populations, en utilisant la théorie des processus de ramification 12,13. Les processus de ramification ont été largement utilisés au cours des dernières décennies pour modéliser la croissance des cellules souches 14,15,16,17,18,19 et plus récemment des cellules souches cancéreuses 20,21,22,23. Dans cet article, nous employons et étendons le modèle de processus de branchement pour les CSC discuté dans la réf. [ 11 ]. La principale limitation des processus de ramification est due à leur nature de champ moyen qui ne prend pas en compte la géométrie de l'arrangement cellulaire à l'intérieur d'une tumeur. Malgré cette lacune, le modèle permet une description quantitative des courbes de croissance expérimentales des cellules de mélanome, fournissant une confirmation indirecte de l'hypothèse CSC dans cette tumeur 11 . Il serait intéressant de mieux comprendre la localisation des CSC, en analogie avec les cellules souches dans les tissus où il est possible d'étudier leur cinétique spatio-temporelle in vivo 24,25, en utilisant des modèles de mécanique statistique pour comprendre les résultats 26 . Des techniques similaires pour le cancer sont encore à un stade préliminaire et ont été utilisées pour suivre les cellules métastatiques in vivo 27 . Le suivi des CSC semble être plus compliqué principalement en raison du manque de marqueurs non ambigus.


Volume 1

Niches cellulaires

Pour soutenir la croissance des cellules ES/iPS dans un état indifférencié, la première stratégie consiste à créer des niches en imitant des microenvironnements cellulaires in vivo constitués d'autres cellules. Il existe une grande variété de ces cellules en fonction de leur source ainsi que des protocoles de préparation (Crocco et al., 2013).

Cellules nourricières vivantes

Les cellules nourricières doivent fournir des interactions cellule-cellule directes, produire une matrice bioactive pour les interactions cellule-ECM et libérer des nutriments/facteurs de croissance dans le milieu de culture pour maintenir la pluripotence des cellules ES/iPS pendant la culture et empêcher la différenciation spontanée ( Thomson et al ., 1998 Takahashi et Yamanaka, 2006 ) ( Fig. 3A ). En tant que nourricières, la prolifération de ces cellules doit être complètement inhibée, mais elles peuvent être utilisées comme cellules de soutien viables non proliférantes (Richards et al., 2002). Les traitements à la mitomycine C et aux rayons gamma sont couramment utilisés pour préparer des cellules nourricières non proliférantes et métaboliquement actives ( Llames et al., 2015 ).

3 . Schéma des niches d'ingénierie. Cellules ES/iPS cultivées sur (A) des cellules nourricières vivantes mitotiquement inactivées, (B) des cellules nourricières chimiquement inactivées et (C) une MEC décellularisée.

Les cellules dérivées de souris, telles que les MEF et leurs cellules SNL 76/7 dérivées, sont les plus fréquemment utilisées comme nourrisseurs pour maintenir la pluripotence des cellules ES/iPS. Cependant, l'utilisation de ces cellules nourricières murines présente un risque de contamination interspécifique par des agents pathogènes animaux qui peuvent être présents dans les cellules nourricières, la matrice de fixation ou le milieu conditionné, compromettant ainsi grandement les futures applications cliniques des cellules ES/iPS humaines. Par conséquent, les cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la moelle osseuse humaine ont été utilisées comme système d'alimentation puissant (Omoto et al., 2009). Les MSC soutiennent la prolifération in vitro prolongée des cellules iPS humaines ainsi que le maintien de leur pluripotence ( Havasi et al., 2013 ). Des cellules iPS humaines dérivées d'amniocytes humains ont été cultivées sur des couches nourricières mitotiquement inactivées préparées à partir des mêmes amniocytes ( Anchan et al., 2011 ). Des cellules iPS humaines dérivées de fibroblastes ont été établies et maintenues sur des fibroblastes parentaux isogéniques comme nourrisseurs (Takahashi et al., 2009). Les deux composants cellulaires de cette combinaison sont autologues à un seul donneur. L'utilisation de cellules nourricières humaines réduit le risque de zoonose. Des cellules iPS humaines ont également été maintenues dans un état pluripotent sur des membranes poreuses en polyéthylène téréphtalate avec des cellules stromales proliférantes dérivées de tissus adipeux humains ensemencées sur la surface inférieure des membranes ( Hwang et al., 2010 ).

Substrats dérivés de cellules

Bien que les cellules nourricières vivantes soient fréquemment utilisées comme niches pour la culture de cellules ES/iPS, il existe certains inconvénients tels que le risque élevé de contamination par les cellules nourricières lors du passage ( Xu et al., 2001 ). Pour surmonter ces inconvénients, des cellules nourricières fixées chimiquement et des MEC décellularisées sont en cours de développement comme substrats de culture pour la culture de cellules ES/iPS ( Llames et al., 2015 ).

Des cellules nourricières fixées chimiquement ont été étudiées pour soutenir la croissance et le maintien des cellules progénitrices hématopoïétiques ( Ito et al., 2006 ), des cellules ES ( Ito et al., 2007 ) et des cellules iPS ( Yue et al., 2012 ). Les cellules fixes sont également utilisées en biologie cellulaire fondamentale pour révéler comment les facteurs ou les protéines associés à la membrane affectent les cellules, ce qui a montré que les facteurs membranaires conservent leurs activités biologiques qui soutiennent la croissance indifférenciée des cellules ES/iPS ( Fig. 3 B) même après chimique fixation ( Ito et al., 2006 Tanaka et al., 2010 Joddar et Ito, 2013 ). Actuellement, un protocole de fixation chimique doux utilisant du glutaraldéhyde et du formaldéhyde a été développé pour préparer un substrat de niche à partir de cellules nourricières autologues pour la culture de cellules iPS humaines (Zhou et al., 2015 Joddar et al., 2015). Des solvants organiques, tels que le méthanol et l'éthanol, sont également utilisés pour préparer des cellules nourricières qui peuvent conserver leurs fonctions de soutien après une cryoconservation à long terme ( Huang et al., 2015 Ren et al., 2018 ). Les cellules fixes peuvent réduire le travail de préparation des cellules nourricières et être réutilisées plusieurs fois.


Les cellules d'Henrietta Lacks ont rendu ces percées possibles

Depuis sa création en 1951, la lignée cellulaire HeLa a été utilisée pour tout étudier, de la grippe à la fécondation in vitro, et les cellules HeLa peuvent désormais être trouvées dans les laboratoires du monde entier. Parmi les moments médicaux révolutionnaires que l'ADN de Lacks a rendus possibles :

1952
Jonas Salk développe le premier vaccin contre la polio au monde, mais l'avancée qui sauve des vies doit être testée avant d'être administrée aux enfants. Entrez dans le premier centre de distribution HeLa, créé pour produire des milliards de cellules et les exposer au virus.

Photo : Photothèque scientifique/Getty Images

Les cellules HeLa sont mélangées par erreur avec un liquide qui provoque le décollement de leurs chromosomes, offrant un aperçu clair de chacune d'entre elles. Le nombre total de chromosomes (46) pour la première fois donne aux médecins une base de référence pour identifier les anomalies.

Photo : Album/Art Resource, NY

Des cellules HeLa accompagnent le satellite soviétique Korabl-Spoutnik 2 en orbite, battant Youri Gagarine et John Glenn dans l'espace. La NASA réagit en plaçant HeLa à bord du Découvreur XVIII satellite pour étudier l'impact de l'apesanteur sur les cellules humaines.

Photo : Ed Compean/Hulton Archive/Getty Images

Les scientifiques Henry Harris et John Watkins annoncent qu'ils ont combiné HeLa et des cellules de souris. L'expérience permet aux chercheurs de lier la fonction des gènes à des chromosomes spécifiques, ouvrant ainsi la voie à la cartographie du génome humain.

Photo : Thomas Lohnes/AFP/Getty Images

Le virologue Harald zur Hausen teste un échantillon de la biopsie originale de Lacks et découvre qu'il est infecté par une MST appelée virus du papillome humain (VPH) 18. À l'aide de cellules HeLa, il découvre que le VPH 18 provoque le cancer du col de l'utérus et ouvre la voie à un vaccin.

Photo : Dan McCoy/Science Faction/Getty Images

Des chimistes et des ingénieurs de la Penn State University annoncent avoir implanté des nanomoteurs synthétiques dans les cellules HeLa. Cette technologie, jusqu'alors non étudiée dans les tissus humains vivants, pourrait un jour permettre aux médecins de détruire les cellules cancéreuses de l'intérieur.

Découvrez les coulisses du nouveau film de HBO basé sur l'histoire d'Henrietta Lacks.


Expression du récepteur de la cadhérine (CAD) dans différentes lignées cellulaires

Le récepteur CAD a été exprimé dans un certain nombre de lignées cellulaires différentes pour déterminer sa participation au mécanisme d'action des toxines Cry. Le premier exemple a rapporté l'expression de CAD BtR175 de B. mori (BmCAD) dans des cellules Sf9, montrant que BmCAD était exprimé à la surface des cellules et est un facteur essentiel de toxicité de la toxine Cry1Aa (Nagamatsu et al., 1999) (Fig. 2A). Les auteurs ont identifié la répétition CAD CR9, adjacente au domaine extracellulaire proximal de la membrane (MPED) comme le


Safari de cellules souches

En médecine humaine, la thérapie par cellules souches est la nouveauté à la mode. Des thérapies par cellules souches sont également disponibles pour les animaux de compagnie et offrent des traitements pour un large éventail de conditions. Mais est-ce tout ce qu'il est censé être?

Fondamentalement, il y a deux écoles de pensée. Un point de vue est que non, pour le moment, malheureusement, le domaine n'est tout simplement pas là - ce qui signifie qu'il n'y a pas de preuves cliniques que ces thérapies fonctionnent dans le monde réel.

D'autres, cependant, ne partagent pas ce point de vue et proposent en fait de guérir un large éventail de maladies des animaux de compagnie avec des traitements à base de cellules souches.

Figure 1 : Croissance des cellules nerveuses (ectoderme) à partir d'une culture de cellules souches pluripotentes. Cette culture de cellules souches a également créé les images des figures 2 et 3 ci-dessous. (en haut, à droite)


Pour quelles conditions pouvez-vous traiter mon animal de compagnie avec des cellules souches aujourd'hui ?

Les traitements par cellules souches sont un moyen d'intervenir dans le développement et potentiellement de guérir toute une série de maladies et de maladies, y compris, mais sans s'y limiter :

Arthrite 
Maladie du disque
Lésion de la moelle épinière
Troubles auto-immuns (y compris KCS, IMHA, ITP, etc.)
Maladie allergique de la peau
Maladie du rein
Insuffisance rénale
Cardiomyopathie
Insuffisance cardiaque
Incontinence
Réparation de fracture
Blessures orthopédiques
Oeil sec
Syndrome de dégénérescence rétinienne soudaine acquise (SARDS)
Plaies non cicatrisantes

Figure 3 : Des mèches vertes de cellules de tissu conjonctif (mésoderme) dans la même culture, comme indiqué sur les figures 1 et 2. (en haut, à droite)

La thérapie par cellules souches vétérinaires utilise-t-elle des embryons ?

Non. La plupart des traitements à base de cellules souches les plus courants utilisent des cellules souches adultes, normalement récoltées dans les réserves de graisse de l'animal, et ces cellules souches sont introduites dans la partie endommagée du corps. Les cellules souches se renouvellent ensuite au sein de la partie endommagée, favorisant la croissance de nouveaux tissus et remplaçant par la suite les tissus malades. Ce type de cellule souche est appelé autologue.

Étant donné que les cellules souches ont été récoltées sur le corps de l'animal, théoriquement, les chances de rejet ou d'apparition d'effets secondaires sont très minimes. Parce que c'est le cas, les traitements par cellules souches offrent essentiellement une approche thérapeutique ou thérapeutique moins invasive, plus viable et plus durable que les médicaments et médicaments traditionnels.

Figure 2 : Cellules intestinales (endoderme) dans la même culture que les figures 1 et 2. Démontrer que les trois couches germinales peuvent être créées avec cette culture de cellules souches.  (ci-dessus, à droite)

La plupart des traitements à base de cellules souches vétérinaires sont-ils encore en phase de recherche ?

Oui. Il est crucial de garder à l'esprit que la plupart des traitements à base de cellules souches - à l'exception de la greffe de moelle osseuse - sont encore au stade de la recherche et n'ont pas fait l'objet d'essais cliniques. Des études chez l'animal sont en cours, mais dans le but de prouver qu'un traitement fonctionne dans humains, pas nécessairement au profit des animaux eux-mêmes.

De nombreuses études de recherche ont été menées en dehors des États-Unis depuis des années, car la recherche sur les cellules souches embryonnaires a été interdite ou sévèrement restreinte ici aux États-Unis depuis 2006 par décret présidentiel. Avec la découverte de cellules souches adultes facilement obtenues à partir du propre tissu adipeux de l'animal, cependant, des essais cliniques commencent dans les principales institutions vétérinaires et l'utilisation clinique réelle des cellules souches est devenue plus disponible.      & #0160            

Y a-t-il des risques potentiels avec l'utilisation de traitements par cellules souches ?

Oui. Outre le fait que de nombreuses recherches en sont aux phases préliminaires et avec le manque de résultats publiés, les traitements à base de cellules souches comportent de nombreux risques. Le risque le plus courant est que le traitement ne fonctionne pas car tous les facteurs de succès peuvent ne pas être connus.

Par exemple, dans le cas du cancer, il y a le danger d'aggraver cette maladie. L'introduction de cellules souches dans un animal de compagnie atteint d'un cancer peut contribuer à la croissance incontrôlée des cellules qui est le principal mécanisme du cancer. Il n'y a jamais eu de cas où cela se soit produit avec des cellules souches adultes, mais il y a encore relativement peu de cas traités, et c'est une possibilité théorique.

Un autre danger est l'utilisation incontrôlée des types de cellules souches à administrer. Embryonnaire les cellules souches ne sont utilisées que pour la recherche, sont cliniquement dangereuses et ne peuvent pas être contrôlées pour prévenir le cancer. Autologue les cellules souches sont la forme la plus sûre de cellules souches et sont celles récoltées sur un animal de compagnie et utilisées dans ce même animal de compagnie. Allogénique les cellules souches proviennent d'un autre animal de compagnie de la même espèce et sont couramment utilisées dans la recherche sur les cellules souches. Ces cellules ne sont pas encore autorisées par la FDA des États-Unis pour le traitement des patients cliniques, mais elles sont très probablement sans danger. Dans les pays sans supervision et réglementation comme celle de notre FDA, l'utilisation de hétérologue les cellules souches récoltées sur différentes espèces telles que les moutons et les requins ont été utilisées pour traiter des patients humains.  Les histoires similaires abondent sur Internet en ce qui concerne les thérapies par cellules souches chez les animaux de compagnie. C'est le genre d'applications de grande envergure qui peuvent effrayer le propriétaire moyen d'un animal de compagnie des cellules souches comme option de traitement.  

Tous les traitements par cellules souches sont-ils identiques ?

Non. Bien que le traitement par cellules souches soit disponible dans certaines cliniques vétérinaires, l'efficacité de leur traitement suscite des inquiétudes. Les cellules souches sont fragiles, meurent facilement et sont sujettes aux infections bactériennes. Un fournisseur de services de cellules souches pour les vétérinaires exige l'expédition des cellules souches via un important service de livraison de nuit, ce qui augmente considérablement la mort des cellules souches. Une autre option clinique nécessite que le vétérinaire traite les cellules souches de la graisse prélevée sur l'animal à l'aide d'une centrifugeuse et d'un bain-marie en clinique. Cependant, pour assurer le succès, une armoire biologique stérile est nécessaire pour prévenir l'infection pendant le traitement des cellules souches, ce qui, dans de nombreux cas, peut ne pas être disponible. En plus de cela, il n'y a aucun moyen de savoir combien de cellules souches vivantes sont ensuite injectées dans l'animal – un autre facteur de succès critique. De plus, peu de vétérinaires ont reçu une formation sur les techniques de traitement des cellules souches.


La différence Safari dans la thérapie par cellules souches

Traduire la recherche en réalité » est la mission de Safari Stem Cell Therapy.

Ici, dans les centres de soins vétérinaires Safari, nous mettons en œuvre une approche de médecine translationnelle [1] pour la thérapie par cellules souches. Cette méthode utilise des recherches validées en thérapie par cellules souches et applique les techniques à des cas cliniques. Une grande partie de cette recherche est effectuée sur des chiens, mais les résultats sont axés sur les besoins des humains. Nous traduisons ces résultats pour aider nos compagnons canins. Dans cet effort, Safari a développé un laboratoire de cellules souches avancé pour le traitement des cellules souches, l'évaluation de la viabilité des cellules souches, l'expansion des cultures de cellules souches et la cryoconservation des lignées de cellules souches. Safari dispose également d'un personnel certifié en techniques de thérapie par cellules souches humaines et vétérinaires, ainsi que de chirurgiens qualifiés en chirurgie du système nerveux et de la colonne vertébrale, équipés de radiologie spécialisée (fluoroscopie C-Arm) pour l'injection de cellules souches dans le disque intervertébral, la colonne vertébrale, l'articulation ou autre domaine de besoin. Safari a également des spécialistes de la rééducation armés d'outils de rééducation complets pour faire du traitement par cellules souches le cercle complet du succès.

Figure 4 : La coloration verte révèle une colonie de cellules souches programmées dans les fibrocytes qui se colorent en rouge. Ces images proviennent des cultures cellulaires réelles du Dr Garner.  (ci-dessus, à droite)

Quelles questions sont importantes à poser à mon vétérinaire lorsqu'il envisage une thérapie par cellules souches ?

Lorsque vous envisagez une thérapie par cellules souches pour votre animal de compagnie, vous devez prendre en compte certaines questions avant de vous lancer dans la thérapie par cellules souches :

    Quel type de cellules souches est utilisé ?

    Les cellules autologues - celles prélevées sur l'animal lui-même - sont préférables.

  1. Les cellules adultes dérivées du tissu adipeux sont plus sûres que les cellules embryonnaires et plus rapides que les cellules dérivées de la moelle osseuse.
  2. Ils proviennent des cellules de votre animal, et non des cellules de quelqu'un d'autre ou de quelque chose d'autre, ce qui les rend plus fiables et compatibles, et donc une option plus sûre.

  1. Les cellules préparées sur place sont plus viables.
  2. Les protocoles, méthodes et équipements de sécurité biologique stériles sont importants.

  1. Directement dans la zone de blessure ou de maladie avec une imagerie avancée pour le guidage de l'aiguille.
  2. Administré par des chirurgiens qualifiés.
  3. L'administration intraveineuse est rarement efficace lorsqu'elle est administrée seule.

  1. Les troubles neurologiques et musculo-squelettiques nécessitent une rééducation.
  2. Multiples modalités telles que physiothérapie, électrostimulation, laser thérapeutique, ultrasons thérapeutiques, tapis roulants aquatiques, certifications spécialisées.

[1] Tmédecine translationnelle une branche interdisciplinaire du domaine biomédical s'appuyant sur trois piliers principaux : benchside, bedside et community. L'objectif de la médecine translationnelle est de combiner les disciplines, les ressources, l'expertise et les techniques au sein de ces piliers pour promouvoir des améliorations en matière de prévention, de diagnostic et de thérapies. La médecine translationnelle est une discipline en croissance rapide dans la recherche biomédicale et vise à accélérer la découverte de nouveaux outils de diagnostic et de traitements en utilisant une approche multidisciplinaire, hautement collaborative, "du laboratoire au chevet du patient". Au sein de la santé publique, la médecine translationnelle vise à garantir que des stratégies éprouvées de traitement et de prévention des maladies sont réellement mises en œuvre au sein de la communauté. Deux obstacles doivent être surmontés : le premier bloc translationnel (T1) empêche les résultats de la recherche fondamentale d'être testés dans un contexte clinique le deuxième bloc translationnel (T2) empêche les interventions éprouvées de devenir une pratique standard. Les National Institutes of Health (NIH) ont fait un effort majeur pour financer la médecine translationnelle, en particulier dans le cadre de la recherche biomédicale, en mettant l'accent sur les collaborations interfonctionnelles (par exemple, entre les chercheurs et les cliniciens) en tirant parti des nouvelles technologies et des outils d'analyse de données et en augmentant la vitesse à laquelle de nouveaux traitements parviennent aux patients. En décembre 2011, le National Center for Advancing Translational Science (NCATS) a été créé au sein du NIH pour « transformer le processus de la science translationnelle afin que de nouveaux traitements et remèdes contre les maladies puissent être fournis plus rapidement aux patients ».

Mots clés : cellules souches allogéniques, cellules souches autologues, Dr Steven Garner DVM, cellules souches embryonnaires, Safari Veterinary Care Centers, risques liés aux cellules souches, cellules souches, médecine translationnelle


Résumé

La leucémie est le cancer du sang le plus courant, et son développement commence à divers points, conduisant à des sous-types distincts qui répondent différemment au traitement. Cette hétérogénéité est rarement prise en compte dans les thérapies, il reste donc indispensable de rechercher de nouveaux médicaments spécifiques pour les sous-types de leucémies voire pour les cas résistants aux thérapies. Les naphtoquinones (NQ) sont considérées comme des structures privilégiées en chimie médicinale en raison de leur pléthore d'activités biologiques, y compris des effets antimicrobiens et anticancéreux. Hétérocycles contenant de l'azote tels que 1,2,3-1H-les triazoles ont été identifiés comme des échafaudages généraux pour générer des inhibiteurs de glycosidases. Dans la présente étude, le NQ et 1,2,3-1H-des noyaux de triazole ont été combinés pour synthétiser chimiquement 18 nouvelles 1,2-furanonaphtoquinones attachées à 1,2,3-1H-triazoles (1,2-FNQT). Leurs cytotoxicités ont été évaluées contre quatre lignées cellulaires leucémiques différentes, dont MOLT-4 et CEM (lignées cellulaires lymphoïdes) et K562 et KG1 (lignées cellulaires myéloïdes), ainsi que des cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC). La nouvelle série 1,2-FNQT a montré un potentiel cytotoxique élevé contre toutes les lignées cellulaires leucémiques testées, et certains composés (12o et 12p) ont montré des résultats encore meilleurs que les composés thérapeutiques classiques tels que la doxorubicine ou le cisplatine. D'autres composés, tels que 12b, sont prometteurs en raison de leur sélectivité élevée contre la leucémie lymphoblastique et de leur faible activité contre les cellules hématopoïétiques normales. The cells of lymphoid origin (MOLT and CEM) were generally more sensitive than the myeloid cell lines to this series of compounds, and most of the compounds that showed the highest cytotoxicity were similarly active against both cell lines.


1. Introduction

Besides supporting the human body, bone tissue regulates blood pH, acts as a mineral source, and generates hematopoietic stem cells and Mesenchymal Stem Cells (MSCs) [1].

Today, tissue engineering represents a novel approach to repair bone-tissue defects in oral, orthopedic, and maxillofacial surgery and it has as principal actors: i) the cells and ii) the scaffold [2].

Scaffolds material are three-dimensional (3D) structures used in tissue engineering that mime the role of extracellular matrix and provide a mechanical support for cells. Moreover 3D biomaterials are also able to induce specific protein synthesis, stimulate some cellular activity, facilitate the cell adhesion and can stimulate the bone tissue formation in vivo. An appropriate scaffold should be osteogenic, i.e. able to induce the formation of bone tissue, osteoinductive, i.e. able to enroll MSCs derived from human tissues, and finally osteoconductive, i.e., able to support the growth of the bone tissue. The latter aspect of the scaffold properties is focused on the chemical composition and on the spatial geometric model qualified to provide to endothelial cells migration and sprouting of new vessels.

To date, bone tissue regeneration strategies lack an approach that effectively provides an osteogenic and angiogenic environment conducive to bone growth. In fact in the bone formation, in skeletal development or in osseointegration process the interaction between osteogenesis and angiogenesis plays a fundamental role. Recent literature has investigated the effect of coculture in bone regeneration. For example in the coculture of mesenchymal cells and endothelial cells or in the coculture of human mesenchymal stem cells and human umbilical vein endothelial cells the bone regeneration process has been promoted [3].

MSCs derived from oral tissues are easy to isolate and collect. Human Periodontal Ligament Stem Cells (hPDLSCs) are mesenchymal stem cells that showed the classical fibroblast-like phenotype, the ability to differentiate into osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages, other than the positivity for stemness surface markers and the negativity for hematopoietic surface molecules [4]. The in vivo use of hPDLSCs avoid the immunological reaction, they also mediate their therapeutic effects through paracrine signalers by the release of extracellular vesicles [5,6]. Moreover, hPDLSCs combined with different biocompatible 3D scaffold demonstrated the ability to enhance the in vivo bone formation, in particular with collagen membranes and have shown to be induced toward an endothelial differentiation [2,7].

Native bone tissue is characterized by an abundant vascular network that is of the upmost importance for the diffusion of oxygen and nutrient transport𠅎ssential elements for cell tissue homeostasis. Recent literature indicates that in bone tissue engineering, human MSCs that are able to differentiate as osteoprogenitor cells and endothelial cells (ECs), playing a vital roles in bone regeneration [8,9]. Furthermore, the ERK/MAPK transduction signaling plays an important role in the bone tissue formation and some mutations in this mechanism are related to some human skeletal syndromes, including Noonan, Costello, and cardio-facio-cutaneous syndromes [10,11].

The aim of the present study is focused on the functionalization, in vitro, of a bovine pericardium collagen membrane with hPDLSCs and E-hPDLSCs coculture to obtain an improvement of healing process in terms of bone regeneration and neovascularization when the living construct is implanted in vivo.


RÉSULTATS

Generation of FGFR2 splicing reporter minigenes for analysis of alternative splicing using fluorescence

These studies were initiated toward a goal of identification of trans-acting splicing regulatory proteins that are required for the highly cell-type-specific splicing of mutually exclusive exons IIIb and IIIc of FGFR2 (Fig. ​ (Fig.1). 1 ). These exons encode different peptides in the extracellular domain of FGFR2 and yield receptors with dramatic differences in ligand-binding specificity that have important functional consequences during development (Xu et al. 1998 De Moerlooze et al. 2000). Our studies of FGFR2 splicing have primarily used the rat prostate cancer cell lines, DT3 and AT3, which exclusively splice exon IIIb or IIIc, respectively, to yield FGFR2-IIIb or FGFR2-IIIc. In addition, human cell lines C4-2 (Wu et al. 1994) and 293 have been used, which yield exclusively FGFR2-IIIb and FGFR2-IIIc, respectively. Several intronic and exonic cis-elements within and flanking exons IIIb and IIIc have been described, including several elements in intron 8 that enhance splicing of exon IIIb, as shown schematically in Figure ​ Figure1 1 (Hovhannisyan and Carstens 2005 and references therein). Although several ubiquitously expressed proteins that bind these elements have been described, the mechanisms that give rise to distinct cell-type-specific expression of these isoforms remain poorly understood. To complement traditional approaches toward identification of splicing regulators, we also sought to establish functional screens for factors that regulate FGFR2 splicing in vivo. One rationale was that a functionally relevant protein might regulate splicing without directly interacting with the RNA transcript itself. For example, changes in phosphorylation of splicing factors by kinases and phosphatases have been shown to modulate binding, function, or localization of several splicing regulators and would be difficult to identify using traditional biochemical approaches (Kanopka et al. 1998 Matter et al. 2002 Patel et al. 2005). To establish these screens, we adapted previously described FGFR2 minigenes in which FGFR2 cDNA sequences encoding the exons upstream of exon IIIb, including the natural translational start codon, were fused with a cassette containing intron 7, exon IIIb, intron 8, exon IIIc, intron 9, and exon 9 (Jones et al. 2001). This minigene was joined with a downstream coding sequence for either EGFP or mRFP in which the usual start codon at the 5′-end of the ORF was changed from ATG (Met) to ATC (Ile) to preclude translational initiation at this position (Fig. ​ (Fig.2A). 2A ). This design thus replaces the intracellular FGFR2 tyrosine kinase domains with sequences encoding either fluorescent protein. Because the number of nucleotides in exon IIIb and exon IIIc (148 and 145 nt, respectively) are not multiples of three, maintenance of an ORF that will translate the fluorescent component of the fusion protein requires that one or the other exon be included in the spliced mRNA. Skipping of both exons, or inclusion of both exon IIIb and IIIc, results in a frame that terminates at stop codons upstream of either fluorescent coding sequence. In addition, the presence of numerous stop codons in the introns precludes the possibility of generating a fluorescent product from unspliced or partially spliced pre-mRNAs. We also generated minigenes in which a frameshifting nucleotide was inserted into either exon IIIb or exon IIIc. These minigenes, IIIb-FRT and IIIc-FRT, generate a frame that ends in a stop codon immediately preceding the fluorescent protein-coding sequence if the respective exon is included in the spliced transcript. As a result, production of a fluorescent fusion protein only occurs if the exon without the frameshift mutation is spliced. As a control, we also generatedਊ “prespliced” cDNA control containing exon IIIc (CIIIc) that would generate an FGFR2-fluorescent protein fusion independent of splicing. In all minigenes and controls we also deleted an extracellular peptide required for receptor dimerization to prevent direct association of the minigene products with each other or with the products of the endogenous FGFR2 gene (Wang et al. 1997). These minigenes were inserted in bicistronic expression vectors upstream of an Internal Ribosome Entry Site (IRES) directing expression of antibiotic selectable markers (e.g., neomycin-, hygromycin-, or puromycin-resistance genes). This expression system facilitated establishment of pools of stably transfected cell lines whereby nearly all cells that survived in selective media expressed the minigenes since the selectable gene was expressed under the control of the same promoter. This system also ensured that the expression of the fluorescent minigenes was maintained during prolonged culture. In previous experiments using the same minigenes in vectors containing selectable markers expressed under the control of an independent promoter, we noted a gradual loss of minigene expression over time despite maintenance of selective conditions. Furthermore, in these cases, only one-quarter to one-third of the cells that survived the initial selection also expressed the minigene based on flow cytometric analysis.

Schematic demonstrating alternative splicing of exons IIIb and IIIc. À Haut is a schematic of the protein showing the extracellular region in which exons IIIb and IIIc encode different peptides. Below is a map demonstrating the pre-mRNA region containing these alternative exons together with auxiliary cis-elements in intron 8 previously shown to promote exon IIIb inclusion (hatched boxes). (TM) Transmembrane domain, (TK) tyrosine kinase domains, (Ig) immunoglobulin-like domain. Shaded boxes represent exons, and solid lines represent introns.

Fluorescent FGFR2 minigenes can be used to detect the alternative splicing pattern of exons IIIb and IIIc in live cultured cells. (UNE) Schematic of the fluorescent minigenes. The MWT minigene has no alterations in either exon IIIb or exon IIIc. Introduction of a single additional nucleotide (frameshift) in either exon eliminates fluorescent protein expression when the affected exon is spliced. A control, the CIIIc minigene, expresses the fluorescent fusion protein containing exon IIIc without splicing and, similar to the MWT minigenes, fluorescence cells that splice exon IIIb or IIIc. (B) Determination of cell-type-specific splicing by flow cytometry in pooled stably transfected cells. Introduction of a frameshift (FRT) mutation in exon IIIb or IIIc abrogates green fluorescence in DT3 or AT3 cells, respectively. Raw data from a representative experiment are shown at la gauche. Mean fluorescence intensities (MFI) from three independent experiments were determined as the computed mean of each experimental cell population (without a gate). Data from each experiment were normalized by dividing the MFI obtained with each minigene by that of CIIIc. These data are shown graphically at droit with error bars to represent the standard deviation from three independent experiments. (C) RT-PCR to analyze the splicing pattern from transfected minigenes. Average percentage of IIIc inclusion for AT3 cells and IIIb inclusion for DT3 cells is shown with standard deviations from three independent experiments. Exon IIIb inclusion was determined as the percentage of the RT-PCR product band remaining after HincII digestion divided by the sum of this band and the band remaining after AvaI digestion. Exon IIIc inclusion was determined as the percentage of the RT-PCR product band remaining after AvaI digestion divided by the sum of this band and the band remaining after HincII digestion. Shown at droit is a schematic to illustrate results expected following digestion of RT-PCR products. (U) Uncut, (A) AvaI digestion, (H) HincII digestion, (M) molecular weight marker lane. Arrows indicate the locations of primers used for RT-PCR.

Fluorescence of cells stably transfected with FGFR2 minigenes can be used to determine the splicing pattern of the endogenous FGFR2 gene transcript

We stably transfected DT3 and AT3 cells with the set of minigenes shown in Figure ​ Figure2A, 2A , and pooled cells were subjected to flow cytometric analysis, which is presented in Figure ​ Figure2B. 2B . As expected, the minigenes with the wild-type sequences (MWT) and the cDNA control (CIIIc) both exhibited green fluorescence in both DT3 and AT3 cells that was easily distinguishable from that in cells transfected with an empty vector control. In DT3 cells, an equivalent level of fluorescence was seen with the IIIc-FRT-EGFP minigene, but a markedly lower level of fluorescence was observed with IIIb-FRT-EGFP. Conversely, in AT3 cells, reduced fluorescence was observed in cells stably transfected with the IIIc-FRT-EGFP minigene, whereas IIIb-FRT-EGFP yielded results equivalent to those with the MWT minigene or cDNA (CIIIc) control (Fig. ​ (Fig.2B). 2B ). These results were consistent with our predicted outcomes and suggested that the frame-dependent fluorescence indeed required cell-type-specific inclusion of exon IIIb or IIIc. To confirm that cell-type-specific splicing of exons IIIb and IIIc in these minigenes recapitulated that obtained from the endogenous gene, we performed an RT-PCR assay to distinguish exon IIIb from IIIc inclusion. RT-PCR confirmed that splicing of the exons from the wild-type minigene as well as minigenes containing frameshift mutations yielded predominantly exon IIIb inclusion in DT3 cells and exon IIIc inclusion in AT3 cells (Fig. ​ (Fig.2C). 2C ). However, in contrast to similar analysis of the endogenous transcript, a small but detectable amount of products containing exon IIIc was detected in DT3 cells. We also stably transfected these rat FGFR2 minigenes in the human C4-2 and 293 cell lines (that splice exon IIIb or IIIc, respectively) and confirmed that they also recapitulated the splicing pattern of endogenous FGFR2 in a manner that can be determined by fluorescence (data not shown). Taken together, the RNA analysis indicates that the relative fluorescence observed with the minigenes containing the frameshift mutations in exons IIIb or IIIc can be used to determine the inclusion level of the unmodified exon. Because this level of fluorescence can be determined in live cultured cells, these minigenes can be used to directly assess the level of exon IIIb or IIIc inclusion without the need to lyse cells and harvest RNA. Transfection of the same set of minigenes using mRFP in place of EGFP yielded similar results, indicating that flow cytometric analysis for this fluorescent protein can similarly be used as an indicator of exon IIIb or exon IIIc splicing (data not shown).

Establishment of flow cytometry parameters that enable specific detection of fluorescence from minigenes containing EGFP or mRFP

Because of the distinctly different excitation and emission wavelengths of mRFP and EGFP, microscopic or flow cytometric analysis can be carried out in which expression of either fluorescent protein can be distinguished, even in the same cell. As a result, we expected that it would be possible to independently assess splicing of two different reporters present in the same cell, provided that one of the minigenes contained the EGFP coding sequence and the other included the mRFP coding sequence. Prior to generating cell lines containing these reporters, we evaluated our ability to distinguish fluorescence generated by these minigenes using fluorescence analysis of live stably transfected DT3 and AT3 cells by flow cytometric analysis. Pools of DT3 and AT3 were stably transfected with the IIIb-FRT or IIIc-FRT minigenes containing either the EGFP or mRFP coding sequence (four different minigenes). By using advanced flow cytometry systems, such as the LSR II (BD Biosciences), in which precise wavelengths of excitation and detection can be specified, conditions have been established that permit sensitive detection of both EGFP and mRFP without any bleeding through of one fluorescent color to the other. This permits independent flow cytometric analysis for expression of either fluorescent protein in the same cell.

We subjected DT3 and AT3 cells transfected with the minigenes described above to fluorescent analysis using conditions set up for detection of each fluorescent protein, and the results are shown in Figure ​ Figure3. 3 . In DT3 cells, using settings for EGFP (FL1) we noted the highest level of fluorescence with IIIc-FRT-EGFP and a significantly lower level of fluorescence with IIIb-FRT-EGFP, consistent with the relative differences in exon IIIb and IIIc inclusion described previously. No fluorescence was detected in cells transfected with IIIb-FRT-mRFP or IIIc-FRT-mRFP. However, when settings optimal for mRFP (532-nm green laser, 585/42-nm detection settings) were used, IIIc-FRT-mRFP yielded the highest fluorescence, with lower levels from IIIb-FRT-mRFP and none from either EGFP containing minigene. As described previously, DT3 cells exhibit a low level of IIIc inclusion, and thus the low level of fluorescence observed with the IIIb-FRT minigenes is attributable to its inclusion. Similar results were also observed in AT3 cells, with the significant difference being that in both cases fluorescence was higher with the IIIb-FRT than IIIc-FRT minigenes. Thus, both fluorescent proteins can be detected separately from one another.

Green and red fluorescence can be independently detected by flow cytometry. (Upper left) DT3 cells display significantly greater green fluorescence with the IIIb-FRT-EGFP than the IIIc-FRT-EGFP minigenes, but none with mRFP containing minigenes at these settings. (Upper right) DT3 cells display greater red fluorescence with the IIIb-FRT-mRFP than the IIIc-FRT-mRFP minigenes, but none with EGFP containing minigenes using these settings. (Lower left) Fluorescence is only detected in AT3 cells stably expressing minigene IIIb-FRT-EGFP. (Lower right) Under conditions established for RFP detection, fluorescence is only detected in AT3 cells expressing IIIb-FRT-mRFP. The black line represents results from control untransfected cells.

Stable cell lines containing dual color minigene reporters facilitate detection of changes in FGFR2 splicing regulation induced by trans-acting protein factors

The results described thus far confirmed that splicing outcomes from minigenes containing either EGFP or mRFP can independently be analyzed by flow cytometry. Therefore, cells can be identified and sorted using fluorescence activated cell sorting (FACS) on the basis of the relative fluorescence of either (or both) of these fluorescent markers. Since fluorescence of cells expressing these minigenes can be used to monitor splicing of FGFR2 exon IIIb (using the IIIc-FRT minigenes) or exon IIIc (using the IIIb-FRT minigenes), cells expressing these minigenes represent an ideal substrate for the establishment of genetic screens for the identification of functional splicing regulators. A simple screen using cells stably expressing a single fluorescent reporter could be used for these purposes. However, changes in fluorescence of a single reporter could be achieved through gain or loss of factors that would not necessarily be due to changes in splicing. For example, changes in transcription, transport, mRNA stability, or translational efficiency of minigene-derived transcripts could likewise affect fluorescence. To obviate this possibility and establish more elegant genetic strategies, we established cell lines stably expressing two minigenes in which exon IIIb or exon IIIc inclusion is reflected by relative EGFP or mRFP expression from the respective minigenes. This was achieved through use of a IIIc FRT-EGFP minigene containingਊ puromycin-resistance cassette and a IIIb-FRT-mRFP minigene linked to hygromycin resistance. Cells stably expressing both minigenes were obtained by sequential transfection and selection with the appropriate antibiotic. After stable insertion of both minigenes, DT3 cells displayed easily detectable green fluorescence, but only low levels of red fluorescence (data not shown). Predictably, AT3 cells instead displayed intense red fluorescence but green fluorescence that was near background levels (data not shown). 293 Cells, which also express FGFR2-IIIc, also displayed intense red fluorescence, and significantly lower green fluorescence. Thus, cells expressing this combination of minigenes enabled use of either EGFP or mRFP expression to independently determine the level of exon IIIb or IIIc splicing.

The resulting cell lines expressing both EGFP and mRFP containing splicing reporters can be used in screens in which an induced increase in the level of only one fluorescent protein is highly predictive of a change in splicing. Because both minigenes contain the same CMV promoter and 5′- and 3′-untranslated regions (UTRs), any induced changes in the level of transcription, stability, or translational efficiency would be expected to yield parallel changes in EGFP and mRFP. Therefore, through use of FACS-based sorting to select cells that only cause a shift in fluorescence of one marker, we can more robustly and elegantly screen for cellular mutants that switch splicing or for the ability of exogenously expressed regulatory factors to induce a splicing switch. To validate the feasibility of using these cell lines for this purpose, we tested the ability of a panel of previously described splicing regulatory proteins to induce changes in FGFR2 splicing in a 293 cell clone stably expressing both fluorescent minigenes. Although splicing regulation of FGFR2 is complex and involves combinatorial functions of several regulatory factors, several observations are consistent with the function of at least one protein required for exon IIIb inclusion, but not for exon IIIc inclusion (Carstens et al. 1998). Therefore, overexpression of such factors in 293 cells might result in a shift from predominant inclusion of exon IIIc to exon IIIb that can be detected as an increase in EGFP, but not mRFP. Although expression of a single factor may not be sufficient to cause a complete switch in exon IIIc or exon IIIb splicing, an added benefit of use of fluorescence to establish these screens is that even a partial switch in splicing can be detected. As shown in Figure ​ Figure4A, 4A , transient transfection of plasmids expressing cDNAs for several regulatory proteins resulted in detectable increases in EGFP without parallel changes in mRFP. Analysis of endogenous FGFR2 splicing by RT-PCR confirmed that the relative level of EGFP obtained after transfection of each protein corresponded to partial switches from inclusion of exon IIIc to exon IIIb (Fig. ​ (Fig.4B). 4B ). The most robust switch was observed in response to overexpression of the related Fox-1 and Fxh RNA-binding proteins (Lieberman et al. 2001 Jin et al. 2003). While we anticipated that a decrease in mRFP expression might result, we suspect this reduction was not detected, because it would not only require a reduction in production of exon IIIc containing spliced mRNAs from the mRFP minigene but also turnover of pre-existing FGFR2-mRFP fusion proteins. We also noted a small but reproducible increase in exon IIIb splicing in response to TIA-1. A TIA-1 effect is consistent with previous reports demonstrating that it binds to uridine-rich sequences downstream of exon IIIb and enhances its inclusion (Del Gatto-Konczak et al. 2000). In addition to the factors shown in Figure ​ Figure4, 4 , several additional RNA-binding proteins (FBP, Etr-3, CELF4, CELF6, and TLS/FUS) were also tested that did not result in changes in splicing of either reporter or the endogenous FGFR2 transcript (data not shown). While these results demonstrated the ability of several proteins to increase exon IIIb splicing, the supra-physiologic level of expression often achieved in transient transfections might suggest that the observed effects of these proteins do not reflect a normal biological role in FGFR2 splicing. Therefore, we also determined the feasibility of using 293 cells containing both reporters to detect changes in splicing following stable integration of a cDNA expressing such factors. To further demonstrate that these experiments can also be performed with the respective fluorescent proteins swapped, we used a 293 cell clone stably expressing IIIc-FRT-mRFP and IIIb-FRT-EGFP minigenes. The Fox-1 cDNA in a bicistronic plasmid encoding blasticidin resistance was transfected in these cells, and selection was carried out using blasticidin. This bicistronic design is expected to yield a population of cells in which nearly all stably express Fox-1. As shown in Figure ​ Figure4C, 4C , stable expression of Fox-1 was also capable of inducing a partial switch from exon IIIc to exon IIIb splicing, although in this case the magnitude was lower. In this case, an increase in red fluorescence was observed without a change in green fluorescence (Fig. ​ (Fig.4C). 4C ). Again, the increase in fluorescence correlated with changes in splicing of the endogenous transcript (Fig. ​ (Fig.4D). 4D ). Taken together, the results in 293 cells indicate that use of two color splicing assays should facilitate larger scale screens for FGFR2 splicing regulators using either loss- or gain-of-function approaches.

Changes in splicing of endogenous FGFR2 in response to overexpression of splicing regulatory factors can be detected specifically using cell lines stably expressing dual color fluorescent reporter minigenes. (UNE) A 293 clonal cell line expressing both IIIc-FRT-EGFP and IIIb-FRT-mRFP was transiently transfected with constructs expressing the indicated RNA binding proteins (RBPs) or the same expression construct without an inserted cDNA (Vector). (B) Confirmation that the induced increases in green fluorescence represents changes in splicing of endogenous FGFR2. RNAs from the same cells analyzed by flow cytometry were analyzed by RT-PCR. Percentage IIIb inclusion was determined as described in the legend to Figure ​ Figure2C. 2C . (C) An increase in red, but not green, fluorescence was observed in response to stable transfection with a Fox-1 cDNA in a 293 clonal cell line containing the opposite combination of minigene/fluorescent protein. () RT-PCR analysis demonstrating increased exon IIIb inclusion in response to stable expression of Fox-1.

Dual color fluorescent reporters can be used to detect induced splicing changes via defined ISEs

The results shown in Figure ​ Figure4 4 show the applicability of cell lines containing these reporters for identification of trans-acting factors involved in regulation of FGFR2 exons IIIb and IIIc. While identification of such regulators should be highly informative, these minigenes contain numerous regulatory cis-elements in all three introns as well as both exons. As a result, several regulators may be identified without elucidating mechanisms or cis-elements that mediate their effects on splicing. Therefore, we also established dual color fluorescence assays that allow us to discover factors that enhance exon IIIb splicing through the ISEs located in intron 8. For this purpose, we adapted minigenes from a reporter construct that was successfully used to detect cell-type-specific functions of ISE/ISS-3 using fluorescence (Hovhannisyan et al. 2006). As shown in Figure ​ Figure5A, 5A , these minigenes contain an ORF consisting ofਊ 159-nt ORF derived from rat protein kinase C (PKC)-γ inਊ 5′-terminal exon. In the parental PKC-neg-40B minigenes, a single 40-nt artificial exon (exon 40B), together with flanking introns, separates this ORF from a 3′-terminal exon containing a coding sequence for either EGFP or mRFP. Splicing of the 40B exon maintains an ORF that yields green or red fluorescence, whereas skipping of the exon generates a frame terminating in a stop codon upstream of the fluorescent protein reading frame. Due to to its small size and weak splice sites, this artificial exon is included in only 3%𠄵% of spliced transcripts in transfected 293 cells the predominant splicing pathway leads to skipping of the exon and thus low levels of green or red fluorescence. However, insertion of FGFR2 intron 8 ISE elements downstream of this exon results in substantial activation of exon 40B splicing in DT3 cells but not in AT3 or 293 cells (data not shown). This activation is most robust when an intronic fragment (intron fragment 3, IF3) containing all five of the ISE elements shown in Figure ​ Figure5A 5A is inserted downstream of the test exon. In contrast, insertion of an intron 8 fragment that has been truncated at the 3′-end to exclude both the UGCAUG element and ISE/ISS-3 does not result in increased exon inclusion in any cell lines tested (data not shown). Although factors that bind ISE/ISS-3 and regulate splicing have not been described, Fox-1 and Fxh (also referred to as Fox-2) have been shown to bind UGCAUG sequence elements and mediate splicing enhancement (Jin et al. 2003 Underwood et al. 2005). Therefore, the most straightforward mechanism by which these factors can promote exon IIIb splicing in 293 cells would include binding to this sequence in intron 8 (Baraniak et al. 2003). Because the most robust activation of splicing requires the contribution of all five of the indicated FGFR2 cis-elements, we cotransfected 293 cells with combinations of these minigenes in which one fluorescent reporter contained IF3 (with all indicated ISEs including UGCAUG), whereas the second reporter with the other fluorescent marker contained no sequences from FGFR2. These reporters were also cotransfected with either an empty expression vector, or the same vector containing cDNAs for Fox-1 and KSRP. As shown in Figure ​ Figure5B, 5B , when the mRFP reporter contained IF3 (40B-mRFP-IF3)ਊnd the EGFP reporter did not (40B-EGFP), Fox-1 induced an increase in red, but not green, fluorescence as predicted. KSRP, which was previously shown not to increase exon IIIb splicing, showed no change in fluorescence of either marker. When the opposite combination of minigene/fluorescent protein (40B-EGFP-IF5 and 40B-mRFP) was used, we noted an increase in green, but not red, fluorescence with Fox-1 overexpression. To confirm that the specific changes in either fluorescent reporter corresponded to changes in inclusion of the 40B exon, we also performed RT-PCR assays with RNAs from the same cells that were analyzed by flow cytometry. As shown in Figure ​ Figure5C, 5C , Fox-1 induced an increase in exon 40B inclusion to 㹀% in minigenes containing the FGFR2 IF3 sequences. In contrast, neither the empty vector control nor KSRP elicited any change in splicing whether IF3 was present or not. Therefore, these findings validated the utility of this dual color fluorescent approach to identify factors that mediate splicing enhancement by a defined ISE or set of ISEs.

Dual color fluorescent assays can be used to detect splicing changes mediated by specific auxiliary cis-éléments. (UNE) Schematic of the heterologous parent PKC-neg-40B minigene (Haut) and FGFR2 intron 8 fragments (IF3) that were inserted downstream of exon 40B and tested for splicing activation. (B) 293 Cells were transiently cotransfected with PKC-40B minigenes with and without FGFR2 ISEs (containing opposing fluorescent markers) together with empty expression plasmid (Vector), Fox-1, or KSRP. Increased fluorescence is only observed when the fluorescent marker is present in minigenes containing FGFR2 intron fragment 3. Flow cytometry results from three experiments are shown as mean fluorescence intensities (MFI) normalized to Fox-1. Normalization was performed by dividing each MFI by that of Fox-1 and multiplying by 100. Error bars represent standard deviations. (C) RT-PCR confirmation that induced increases in fluorescence correspond to activation of exon 40B splicing only when FGFR2 auxiliary cis-elements are present. The percentage of spliced products containing exon 40B (vs. exon skipping) is indicated beneath each lane as well as the standard deviation (S.D.) compiled from three independent experiments.


Nanoparticle Applications

Studies in various species of mice have revealed that using nanoparticles to target delivery of clot tPA drug can drastically reduce the needed dosage for the drug leading to reduced side effects like internal bleeding. The drug preventing clotting was attached to a group of nanoparticles that break the turbulent flow of blood especially the one formed by the restricted flow of blood due to a clot.

Nanoparticles targeting proteins common to blood clots have been invented to deliver bismuth –a chemical element- to unstable plaques and clots in the bloodstream. This chemical element enhances CAT scan images, and the technique has been shown in labs in testing clots in mice.

This idea will be used by researchers to locate clots and unstable plaque that could break and block arteries. The technique will be a significant boost in curing heart-related diseases once fully implemented.

A research done in Manchester’s School of Materials is geared to developing a nanoscale sensor which is coated in DNA. This DNA binds to a chemical named myoglobin that increases in blood plasma in a heart attack and can be detected and measured by an electric test.

This technique is used in many hospitals to determine whether a patient has had a heart attack. Experts state that this advancement in the detection of heart attack will improve the rate of survival after a heart attack.

Another way that has been introduced by scientists is the use of nanotubes to alter adult stem cells into a type that will aid in restoring injured heart tissues. The method has been adopted since a patient’s heart is incapable of initiating a self-repair process.

Nanotechnology can be seen as the answer to the battle against cardiovascular diseases. The advancements in the medical world and research institutes have brought hope to many patients who are suffering from different heart ailments.