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Comprendre la stratégie du séquençage de l'ADN de Sanger


La méthode de séquençage de Sanger crée un grand nombre de séquences de toutes les longueurs possibles, se terminant par un nucléotide spécifique, en se terminant par un nucléotide marqué (fluorescent) à la fin.

Mais si vous avez déjà des nucléotides fluorescents d'une base spécifique, pourquoi ne pas simplement faire une PCR régulière avec eux, créer un grand nombre de copies pleine longueur de la séquence d'origine, puis simplement voir les emplacements où le nucléotide émet une fluorescence pour déterminer tous les emplacements de cette base. Pourquoi avons-nous besoin d'un grand nombre d'exemplaires se terminant par chacun possible emplacement, comme avec la méthode Sanger?


Si vous marquez le brin complet de l'ADN avec les marqueurs fluorescents, vous obtiendrez beaucoup de signaux du même nucléotide sans possibilité de discrimination le nucléotide réel est situé sur le brin.

Le séquençage de Sanger ne se termine pas avec la préparation des brins d'ADN terminés et marqués, l'étape suivante est cruciale pour distinguer où se trouve réellement la base marquée. Après étiquetage, l'échantillon est soumis à une électrophorèse sur gel capillaire à haute résolution pour les trier par taille. Le plus petit fragment sort en premier, puis celui avec une base de plus et ainsi de suite. Le détecteur qui identifie alors quel fragment traverse est situé à l'extrémité du capillaire.

Cela fonctionne comme indiqué dans l'image schématique (à partir d'ici):

Si vous marquez un brin complet, aucune distinction par taille n'est possible (idéalement, tout l'ADN fonctionnerait sur la même hauteur d'un gel) et tous les signaux fluorescents pour toutes les positions viendraient au même endroit. Pas très utile.


Avant-propos

J'ai initialement suggéré de fermer cette question car je pense qu'elle confond les détails méthodologiques avec la stratégie. Il existe une réponse acceptée qui clarifie les choses avec un schéma clair de la méthode Sanger. Dans les circonstances, j'ai décidé d'ajouter une sorte de réponse différente - une qui met l'accent sur les principes impliqués dans les différentes approches, plutôt que sur des détails pratiques qui ne sont pas intimement associés à la logique des différentes approches.

Stratégie générale de séquençage de l'ADN

Quelle que soit la méthode, la détermination de la séquence d'ADN (ou de toute séquence linéaire) nécessite deux informations conceptuelles :

  1. Connaissance d'une position particulière dans la séquence.
  2. L'identité de la base à cette position. Ceci est illustré dans le graphique. De plus, il y a une exigence pratique :
  3. Moyens de détecter cela de manière unique.

Comparons ces trois approches de séquençage différentes.

A. Fragmentation chimique (Maxam & Gilbert)

Ici, l'ADN à séquencer marqué à une extrémité est traité avec différents produits chimiques qui se clivent à différentes bases dans des réactions séparées.

  1. La position est indiquée par la longueur du fragment.
  2. La base est connue par le produit chimique utilisé.
  3. La détection est réalisée en séparant les différents fragments par leur longueur et en utilisant leur radioactivité pour les visualiser (par autoradiographie).

B. Terminaison de chaîne pendant la synthèse (Sanger)

Cette méthode utilise une copie catalysée par une enzyme de l'ADN à séquencer, avec arrêt de la copie produite par les quatre analogues di-désoxy des désoxynucléotides triphosphates (dNTP) dans des réactions séparées.

  1. La position est indiquée par la longueur du fragment (comme en A).
  2. La base est connue à partir de l'analogue di-désoxy particulier utilisé pour terminer la réaction.
  3. La détection est réalisée en séparant les produits de synthèse par la longueur et en utilisant la radioactivité ou la fluorescence des dNTP utilisés en synthèse pour les visualiser.

(Remarque sur l'affiche : évidemment, vous avez besoin de fragments de longueurs différentes si vous voulez identifier la base à chaque position dans la chaîne.)

C. Synthèse par phases (« Séquençage de nouvelle génération »)

Ce type de méthode utilise également une copie catalysée par des enzymes de l'ADN à séquencer. Cependant, il n'y a pas de terminaison des chaînes, comme en B, mais les cycles d'addition sont suivis par diverses techniques.

  1. La position d'une base dans une séquence est indiquée par le cycle d'addition auquel l'insertion de la base est détectée.
  2. La base est connue à partir de laquelle des différents dNTP permettent à la réaction d'extension de se produire.
  3. Les méthodes de détection varient mais comprennent la détection de la libération de pyrophosphate par couplage à une réaction électroluminescente (pyroséquençage) et la détection des ions hydrogène libérés pendant la polymérisation à l'aide d'une puce semi-conductrice (torrent d'ions).

Coda : Principe et Pratique

En insistant sur les principes généraux du séquençage de l'ADN, la méthodologie mentionnée s'est limitée à celle requise pour la détection - il n'était même pas nécessaire de mentionner la PCR. Bien sûr, différentes méthodologies de préparation de plusieurs échantillons pour le séquençage ont énormément influencé la vitesse et le coût du séquençage de l'ADN. Cependant, l'étudiant doit comprendre les principes avant de s'enliser dans les détails, qui peuvent être trouvés par ex. dans cet article Wikipédia sur le séquençage et sur le site d'ATDBIO (même s'il s'agit d'une entreprise non désintéressée).


Comment fonctionne le séquençage de Sanger ?

Revenons à l'essentiel et explorons la plate-forme technologique qui a été considérée comme l'étalon-or pendant de nombreuses années. Vous l'aurez deviné, nous parlons du séquençage de Sanger par électrophorèse capillaire. Beaucoup pourraient demander : « Pourquoi s'appelle-t-on Sanger Sequencing ? Le séquençage Sanger doit son nom à l'inventeur de cette technologie révolutionnaire, le Dr Frederick Sanger, qui a développé cette méthode il y a plus de 40 ans au milieu des années 70. Alors, quelles sont les bases du séquençage Sanger ?

Tout commence par avoir une courte amorce se liant à côté de la région d'intérêt. En présence des 4 nucléotides, la polymérase étendra l'amorce en ajoutant le nucléotide complémentaire du brin d'ADN matrice. Pour trouver la composition exacte de la séquence d'ADN, nous devons amener cette réaction à un arrêt défini qui nous permet d'identifier la base de la toute fin de ce fragment d'ADN particulier. Sanger l'a fait en retirant un atome d'oxygène du ribonucléotide. Un tel nucléotide est appelé didésoxynucléotide. Ceci est analogue à lancer une clé dans un engrenage. L'enzyme polymérase ne peut plus ajouter de nucléotides normaux sur cette chaîne d'ADN. L'extension s'est arrêtée et nous devons maintenant identifier de quoi il s'agit. Nous identifions le nucléotide de terminaison de chaîne par un colorant fluorescent spécifique, 4 couleurs spécifiques pour être exact. Le séquençage de Sanger conduit à la formation de produits d'extension de différentes longueurs terminés par des didésoxynucléotides à l'extrémité 3'.

Les produits d'extension sont ensuite séparés par électrophorèse capillaire ou CE. Les molécules sont injectées par un courant électrique dans un long capillaire en verre rempli d'un gel polymère. Pendant l'EC, un champ électrique est appliqué de sorte que les fragments d'ADN chargés négativement se déplacent vers l'électrode positive. La vitesse à laquelle un fragment d'ADN migre à travers le milieu est inversement proportionnelle à son poids moléculaire. Ce processus peut séparer les produits d'extension par taille à une résolution d'une base. Un laser excite les fragments d'ADN marqués par un colorant lorsqu'ils traversent une petite fenêtre à l'extrémité du capillaire. Le colorant excité émet une lumière à une longueur d'onde caractéristique qui est détectée par un capteur de lumière. Le logiciel peut alors interpréter le signal détecté et le traduire en un appel de base. Lorsque la réaction de séquençage est effectuée en présence des quatre nucléotides terminés, vous obtenez finalement un pool de fragments d'ADN qui sont mesurés et séparés base par base. Ce que vous obtiendrez à la fin est un fichier de données montrant la séquence de l'ADN dans un électrophérogramme coloré et un fichier texte que vous pouvez utiliser pour répondre aux questions que vous vous posez.

Et cela, en un mot, c'est le séquençage de Sanger.

Si vous souhaitez en savoir plus, il vous suffit de télécharger gratuitement notre manuel de séquençage Sanger.

Nous créons de nouvelles vidéos Seq It Out tout le temps, donc si vous avez une idée qui ferait un excellent sujet, envoyez-nous simplement un message.


Comprendre la stratégie du séquençage de l'ADN de Sanger - Biologie

* Le pouvoir de découverte est la capacité d'identifier de nouvelles variantes.
La résolution de la mutation est la taille de la mutation identifiée. Le NGS peut identifier de grands réarrangements chromosomiques jusqu'à des variantes nucléotidiques uniques.
‡ 10 ng d'ADN produira

1 ko avec séquençage Sanger ou

300 ko avec reséquençage ciblé (longueur d'amplicon de 250 pb × 1536 amplicons avec un workflow AmpliSeq pour Illumina)

Options pour le séquençage Sanger par rapport au séquençage de nouvelle génération

Le séquençage de Sanger est une approche efficace pour les études de dépistage de variantes lorsque le nombre total d'échantillons est faible. Pour les études de criblage de variantes où le nombre d'échantillons est élevé, le séquençage d'amplicons avec NGS est plus efficace et rentable. Pour les applications liées à la découverte, toute approche NGS fournira une puissance de découverte plus élevée que le séquençage Sanger. La puissance de découverte augmentera à mesure que la taille totale de la séquence cible augmente. Le reséquençage ciblé (méthodes d'amplicon ou d'enrichissement) est la solution la plus rentable lors du séquençage de plus de 20 régions cibles.


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1. Vous pouvez utiliser l'un des programmes suivants pour afficher votre fichier de chromatogramme .ab1

2. Vous devriez voir des pics individuels, nets et régulièrement espacés

3. Attendez-vous à obtenir 500 à 700 bases de séquence d'ADN propre et fiable

Rien de moins et vous pourriez suspecter une contamination dans votre échantillon ou envisager de demander à votre centre de séquençage d'appliquer un protocole spécial pour un modèle difficile. Rien de plus et vous vous aventurez sur un terrain incertain.

4. Ne faites jamais confiance aux 20 à 30 premières bases d'une lecture de séquençage d'ADN

Les pics ici sont généralement non résolus et petits, je suggère donc de concevoir votre amorce au moins 50 pb en amont de la séquence d'intérêt.

5. Utilisez une colonne de centrifugation en silice pour la purification des échantillons que vous envoyez pour le séquençage de l'ADN

Si votre installation de séquençage vous oblige à effectuer votre propre réaction d'amplification PCR Big Dye (par opposition à l'utilisation du service tout compris proposé par certaines entreprises), vous pouvez purifier le produit via la méthode de précipitation à l'acétate de sodium/isopropanol ou en utilisant une colonne de centrifugation en silice disponible. de plusieurs fournisseurs. La méthode de précipitation a un effet secondaire malheureux de gâcher la réaction autour de la base 70-75 de la lecture (voir l'image ci-dessous), donc je recommanderais fortement d'utiliser une colonne de spin en silice. Ils peuvent être chers, mais en valent la peine.

6. Modifiez votre séquence d'ADN

Enfin, lorsque vous voyez un pic mal appelé, ne soyez pas timide. N'hésitez pas à le modifier. La plupart des programmes de visualisation de chromatogrammes (même les gratuits) vous permettent de modifier la séquence.

J'espère que ces conseils vous aideront à tirer le meilleur parti de vos résultats de séquençage d'ADN et à résoudre les problèmes qui pourraient survenir. Bonne chance pour analyser vos séquences !

Plus de ressources de séquençage d'ADN :

    Merci BitesizeBio d'avoir initialement publié ceci et de nous avoir permis de le partager avec nos lecteurs !


Séquençage ADN

David P. Clark , Nanette J. Pazdernik , dans Molecular Biology (deuxième édition) , 2013

Séquençage à 4 cycles

La plupart des réactions de séquençage utilisées pour le séquençage automatisé sont une combinaison de PCR et de séquençage régulier. Comme dans le séquençage automatisé, un mélange de matrice d'ADN double brin, d'amorce et de désoxynucléotides (dNTP) est ajouté. De plus, les ddNTP marqués par fluorescence sont mélangés dans un tube de réaction. Au lieu d'utiliser la Sequenase ou la polymérase de Klenow, une ADN polymérase résistante à la chaleur, telle qu'une Taq polymérase, est utilisé. Les réactions sont cyclées à travers trois températures différentes pour générer les fragments marqués. Tout comme en PCR, la première étape consiste à dénaturer l'ADN matrice à haute température (90°C). L'étape suivante consiste à recuire l'apprêt à une température plus basse (50-60°C) et enfin à augmenter la température à l'optimum pour Taq polymérase (70°C). Ces trois étapes sont répétées encore et encore afin de générer un grand nombre de fragments marqués pour un séquençage automatisé. Comme précédemment, chacun de ces fragments varie selon la taille par incréments de base unique en raison de l'incorporation aléatoire des didésoxynucléotides. Les produits de séquençage finaux sont séparés par taille et enregistrés pour le colorant fluorescent comme décrit dans le séquençage automatisé (ci-dessus).


La méthode de séquençage Sanger

La méthode de séquençage de Sanger repose sur des didésoxynucléotides (ddNTP), un type de désoxynucléoside triphosphate (dNTP), dépourvus de groupe hydroxyle 3 & 8242 et ayant à la place un atome d'hydrogène. Lorsque ces bases se lient à la séquence d'ADN en croissance, elles terminent la réplication car elles ne peuvent pas se lier à d'autres bases. Pour effectuer le séquençage de Sanger, vous ajoutez vos amorces à une solution contenant les informations génétiques à séquencer, puis divisez la solution en quatre réactions PCR. Chaque réaction contient un mélange avec dNTP avec l'un des quatre nucléotides substitué par un ddNTP (groupes A, T, G et C ddNTP). À la fin de la PCR, chacune de vos quatre réactions produira des produits PCR de différentes longueurs car la réplication se termine de manière aléatoire. En exécutant les échantillons sur un gel à 4 voies, vous pouvez reconstituer la séquence car chaque séquence a été répliquée à partir du même matériau d'origine. Voici un exemple où les ddNTP sont en gras et les dNTP ne le sont pas :

Votre séquence est ATGCTCAG.

Vos quatre réactions vous donnent :
Réaction avec ddATP : UNE, ATGCTCUNE, ATGCTCAG
Réaction avec ddGTP : ATg, ATGCTCAg
Réaction avec ddCTP : ATGC, ATGCTC, ATGCTCAG
Réaction avec ddTTP : AT, ATGCT, ATGCTCAG

Toutes les réactions une fois exécutées sur un gel ressembleraient à ceci (Image d'Olwen Reina):

Chaque bande désigne le code de longueurs différentes. Par exemple, la bande qui se trouve à droite sous le « A » symbolise la séquence : « ATGCTCUNE

Imaginons un jeu de société. Le jeu est un jeu de devinettes. Voici comment cela se joue :

Vous pensez à un nombre et le groupe doit le deviner. La partie délicate est que le numéro comporte 200 chiffres. Vous lisez les chiffres du nombre dans votre tête sans faire de son. De temps en temps, une personne vous interrompt et vous lui indiquez le chiffre auquel vous veniez de penser et où il se trouve dans la séquence de 200. Chaque fois que vous êtes interrompu, vous devez recommencer. Vous partez après quelques heures et le groupe doit trouver le numéro à 200 chiffres. Ils doivent reconstituer les informations que vous leur avez données, par exemple le 25 ème nombre était 5, le 40 ème nombre était 0, et ainsi de suite. En utilisant les informations de leurs interruptions, ils peuvent répéter le numéro qu'ils vous ont donné.

Bien que cela ressemble au jeu le plus nul au monde, il fonctionne très bien pour le séquençage !

Malheureusement, il est lent, coûteux et (auparavant) repose sur des matières radioactives. Cela a poussé les scientifiques à développer de nouvelles et meilleures formes de séquençage du génome.


2. Séparation de taille par électrophorèse sur gel

Dans la deuxième étape, les oligonucléotides à terminaison de chaîne sont séparés par taille par électrophorèse sur gel. Dans l'électrophorèse sur gel, des échantillons d'ADN sont chargés dans une extrémité d'une matrice de gel et un courant électrique est appliqué. L'ADN est chargé négativement, de sorte que les oligonucléotides seront tirés vers l'électrode positive du côté opposé du gel. Étant donné que tous les fragments d'ADN ont la même charge par unité de masse, la vitesse à laquelle les oligonucléotides se déplacent ne sera déterminée que par la taille. Plus un fragment est petit, moins il subira de friction lorsqu'il se déplacera à travers le gel et plus il se déplacera rapidement. En conséquence, les oligonucléotides seront disposés du plus petit au plus grand, en lisant le gel de bas en haut.

Dans Manuel Séquençage Sanger, les oligonucléotides de chacune des quatre réactions PCR sont exécutés dans quatre voies distinctes d'un gel. Cela permet à l'utilisateur de savoir quels oligonucléotides correspondent à chaque ddNTP.

Dans automatique Séquençage Sanger, tous les oligonucléotides sont exécutés dans une seule électrophorèse sur gel capillaire au sein de la machine de séquençage.


Techniques de séquençage de l'ADN

Les techniques de séquençage de l'ADN sont utilisées pour déterminer l'ordre des nucléotides (A,T,C,G) dans une molécule d'ADN.

Objectifs d'apprentissage

Différencier les techniques utilisées pour séquencer l'ADN

Points clés à retenir

Points clés

  • Le séquençage du génome fera considérablement progresser notre compréhension de la biologie génétique et a un vaste potentiel pour le diagnostic et le traitement médicaux.
  • Les technologies de séquençage de l'ADN ont traversé au moins trois « générations » : le séquençage Sanger et le séquençage Gilbert étaient de première génération, le pyroséquençage était de deuxième génération et le séquençage Illumina est de nouvelle génération.
  • Le séquençage de Sanger est basé sur l'utilisation de terminateurs de chaîne, les ddNTP, qui sont ajoutés aux brins d'ADN en croissance et terminent la synthèse à différents points.
  • Le séquençage d'Illumina implique l'exécution simultanée de jusqu'à 500 000 000 de réactions de séquençage différentes sur une seule petite lame. Il utilise une réaction de réplication modifiée et utilise des nucléotides marqués par fluorescence.
  • Le séquençage au fusil de chasse est une technique permettant de déterminer la séquence de chromosomes entiers et de génomes entiers basée sur la production de fragments aléatoires d'ADN qui sont ensuite assemblés par des ordinateurs qui ordonnent les fragments en trouvant des extrémités qui se chevauchent.

Mots clés

  • séquençage ADN: une technique utilisée en biologie moléculaire qui détermine la séquence de nucléotides (A, C, G et T) dans une région particulière de l'ADN
  • didésoxynucléotide: tout nucléotide formé à partir d'un désoxynucléotide par perte d'un second groupe hydroxyle du groupe désoxyribose
  • in vitro: tout processus biochimique effectué en dehors de son environnement biologique naturel, comme dans un tube à essai, une boîte de Pétri, etc. (du latin pour “en verre”)

Techniques de séquençage de l'ADN

Alors que les techniques de séquençage des protéines existent depuis les années 1950, les techniques de séquençage de l'ADN n'ont été développées qu'au milieu des années 1970, lorsque deux méthodes de séquençage distinctes ont été développées presque simultanément, l'une par le groupe Walter Gilbert de l'Université Harvard, l'autre par Frederick. Le groupe de Sanger à l'Université de Cambridge. Cependant, jusqu'aux années 1990, le séquençage de l'ADN était un processus relativement long et coûteux. L'utilisation de nucléotides radiomarqués a également aggravé le problème en raison de problèmes de sécurité. Avec la technologie et les machines automatisées actuellement disponibles, le processus est moins cher, plus sûr et peut être terminé en quelques heures. La méthode de séquençage Sanger a été utilisée pour le projet de séquençage du génome humain, dont la phase de séquençage a été achevée en 2003, mais aujourd'hui, elle et la méthode Gilbert ont été largement remplacées par de meilleures méthodes.

Méthode Sanger: Dans la méthode de terminaison de chaîne didésoxy de Frederick Sanger, des didésoxynucléotides marqués par fluorescence sont utilisés pour générer des fragments d'ADN qui se terminent à chaque nucléotide le long du brin matrice. L'ADN est séparé par électrophorèse capillaire sur la base de la taille. A partir de l'ordre des fragments formés, la séquence d'ADN peut être lue. Les fragments les plus petits ont été terminés le plus tôt et ils sortent en premier de la colonne, de sorte que l'ordre dans lequel les différents marqueurs fluorescents sortent de la colonne correspond également à la séquence du brin. La lecture de la séquence d'ADN est indiquée sur un électrophérogramme généré par un scanner laser.

Séquençage de Sanger

La méthode de Sanger est également connue sous le nom de méthode de terminaison de chaîne didésoxy. Cette méthode de séquençage est basée sur l'utilisation de terminateurs de chaîne, les didésoxynucléotides (ddNTP). Les didésoxynucléotides, ou ddNTPS, diffèrent des désoxynucléotides par l'absence d'un groupe 3 & 8242 OH libre sur le sucre à cinq carbones. Si un ddNTP est ajouté à un brin d'ADN en croissance, la chaîne n'est plus prolongée car le groupe 3 & 8242 OH libre nécessaire pour ajouter un autre nucléotide n'est pas disponible. En utilisant un rapport prédéterminé de désoxyribonucléotides aux didésoxynucléotides, il est possible de générer des fragments d'ADN de différentes tailles lors de la réplication d'ADN in vitro.

Une réaction de séquençage de Sanger n'est qu'une réaction de réplication d'ADN in vitro modifiée. En tant que tels, les composants suivants sont nécessaires : ADN matrice (qui sera l'ADN dont la séquence sera déterminée), l'ADN polymérase pour catalyser les réactions de réplication, une amorce qui s'apparie avant la partie de l'ADN que vous souhaitez séquencer, les dNTP et ddNTP. Les ddNTP sont ce qui distingue une réaction de séquençage de Sanger d'une simple réaction de réplication. La plupart du temps, dans une réaction de séquençage de Sanger, l'ADN polymérase ajoutera un dNTP approprié au brin en croissance qu'elle synthétise in vitro. Mais à des emplacements aléatoires, il ajoutera à la place un ddNTP. Quand c'est le cas, ce brin sera terminé au ddNTP qui vient d'être ajouté. Si suffisamment d'ADN matrices sont inclus dans le mélange réactionnel, chacun aura le ddNTP inséré à un emplacement aléatoire différent, et il y aura au moins un ADN terminé à chaque nucléotide différent sur sa longueur aussi longtemps que la réaction in vitro peut prendre lieu (environ 900 nucléotides dans des conditions optimales.)

Les ddNTP qui terminent les brins ont des marqueurs fluorescents qui leur sont attachés de manière covalente. Chacun des quatre ddNTP porte une étiquette différente, de sorte que chaque ddNTP différent aura une couleur fluorescente différente.

Une fois la réaction terminée, la réaction est soumise à une électrophorèse capillaire. Tous les fragments nouvellement synthétisés, chacun terminé par un nucléotide différent et donc chacun une longueur différente, sont séparés par taille. Lorsque chaque fragment de taille différente sort de la colonne capillaire, un laser excite l'étiquette fluorescente sur son nucléotide terminal. À partir de la couleur de la fluorescence résultante, un ordinateur peut suivre quel nucléotide était présent comme nucléotide de terminaison. L'ordinateur garde également une trace de l'ordre dans lequel les nucléotides de terminaison sont apparus, qui est la séquence de l'ADN utilisé dans la réaction d'origine.

Séquençage de deuxième génération et de nouvelle génération

Les méthodes Sanger et Gilbert de séquençage de l'ADN sont souvent appelées séquençage de «première génération» car elles ont été les premières à être développées. À la fin des années 1990, de nouvelles méthodes, appelées méthodes de séquençage de deuxième génération, plus rapides et moins chères, ont commencé à être développées. La méthode de séquençage de deuxième génération la plus populaire et la plus utilisée était celle appelée pyroséquençage.

Aujourd'hui, un certain nombre de méthodes de séquençage plus récentes sont disponibles et d'autres sont en cours de développement. Celles-ci sont souvent appelées méthodes de séquençage de nouvelle génération. La méthode de séquençage la plus utilisée actuellement est celle appelée séquençage Illumina (du nom de la société qui a commercialisé la technique), mais de nombreuses méthodes concurrentes sont en cours de développement et pourraient supplanter le séquençage Illumina.

Dans le séquençage Illumina, jusqu'à 500 000 000 de réactions de séquençage distinctes sont exécutées simultanément sur une seule lame (de la taille d'une lame de microscope) placée dans une seule machine. Chaque réaction est analysée séparément et les séquences générées à partir des 500 millions d'ADN sont stockées dans un ordinateur connecté. Chaque réaction de séquençage est une réaction de réplication modifiée impliquant des nucléotides marqués par fluorescence, mais aucun didésoxynucléotide de terminaison de chaîne n'est nécessaire.

Lorsque le génome humain a été séquencé pour la première fois à l'aide du séquençage de Sanger, il a fallu plusieurs années, des centaines de laboratoires travaillant ensemble et un coût d'environ 100 millions de dollars pour le séquencer presque entièrement. Le séquençage de nouvelle génération peut séquencer un génome de taille comparable en quelques jours, à l'aide d'une seule machine, pour un coût inférieur à 10 000 $. De nombreux chercheurs se sont fixé pour objectif d'améliorer encore plus les méthodes de séquençage jusqu'à ce qu'un seul génome humain puisse être séquencé pour moins de 1000 $.

Séquençage de fusil de chasse

La séquence de Sanger ne peut produire que plusieurs centaines de nucléotides de séquence par réaction. La plupart des techniques de séquençage de nouvelle génération génèrent des blocs de séquence encore plus petits. Les génomes sont constitués de chromosomes longs de dizaines à centaines de millions de paires de bases. Ils ne peuvent être séquencés que dans de minuscules fragments et les minuscules fragments doivent être placés dans le bon ordre pour générer la séquence ininterrompue du génome. La plupart des projets de séquençage génomique utilisent aujourd'hui une approche appelée séquençage du génome entier.

Le séquençage par séquençage du génome entier consiste à isoler de nombreuses copies de l'ADN chromosomique d'intérêt. Les chromosomes sont tous fragmentés en tailles suffisamment petites pour être séquencés (quelques centaines de paires de bases) à des emplacements aléatoires. En conséquence, chaque copie du même chromosome est fragmentée à différents endroits et les fragments de la même partie du chromosome se chevaucheront. Chaque fragment est séquencé et des algorithmes informatiques sophistiqués comparent tous les différents fragments pour trouver lesquels se chevauchent. En alignant les régions superposées, un processus appelé pavage, l'ordinateur peut trouver les plus grandes séquences continues possibles pouvant être générées à partir des fragments. En fin de compte, la séquence de chromosomes entiers est assemblée.

Séquençage par fusil de chasse du génome entier.: Dans le séquençage shotgun, plusieurs copies du même chromosome sont isolées puis fragmentées à des emplacements aléatoires. Les différentes copies du chromosome finissent par générer des fragments de longueurs différentes. Lorsque la collection complète de fragments a été séquencée, la comparaison des séquences de tous les fragments révélera quels fragments ont des extrémités qui se chevauchent avec d'autres fragments. La séquence complète d'une extrémité de l'ADN d'origine à l'autre peut être assemblée en suivant la séquence du premier fragment chevauchant au dernier.

Le séquençage du génome fera grandement progresser notre compréhension de la biologie génétique. Il a un vaste potentiel pour le diagnostic médical et le traitement.


Clonage moléculaire et technologie de l'ADN recombinant

Séquençage ADN

Le séquençage de l'ADN est utilisé pour déterminer la séquence exacte des nucléotides (A, G, C, T) dans un brin d'ADN. Les Méthode de terminaison de chaîne didésoxy de Sanger peut déterminer la séquence de nucléotides avec une haute fidélité pour un tronçon d'environ 200 à 500 paires de bases dans n'importe quel échantillon d'ADN purifié. Basé sur in vitro Synthèse d'ADN, la méthode de Sanger synthétise de courts morceaux d'ADN en présence de bases nucléotidiques auxquelles d'autres bases ne peuvent pas être ajoutées : les didésoxyribonucéoside triphosphates à terminaison de chaîne. Ces nucléotides de terminaison de chaîne sont marqués et mélangés avec des bases nucléotidiques régulières de sorte que des fragments d'ADN soient créés à de nombreuses longueurs différentes, chacun arrêté au hasard par l'ajout d'un nucléotide de terminaison de chaîne. Les quatre nucléotides de terminaison de chaîne sont chacun marqués avec un colorant fluorescent de couleur différente. Des milliers de fragments de différentes longueurs sont analysés sur un gel, et un détecteur de fluorescence automatisé peut balayer rapidement le gel pour lire l'identité du dernier nucléotide de terminaison (figure 10.6). Les laboratoires modernes de biologie moléculaire ont tendance à ne pas exécuter eux-mêmes les réactions de séquençage, car il est généralement plus rapide et moins coûteux d'envoyer des échantillons d'ADN à une installation dédiée pour le séquençage.

Graphique 10.6. Séquençage ADN.

Chaque nucléotide de terminaison de chaîne est marqué avec un colorant fluorescent différent et de nombreux fragments d'ADN sont synthétisés. Lorsque tous les fragments d'ADN synthétisés sont séparés par électrophorèse sur gel, ils seront séparés par taille et un détecteur peut détecter automatiquement quel marqueur se trouve à chaque position en mesurant l'intensité de chaque signal fluorescent.

La méthode Sanger est l'étalon-or pour le séquençage de l'ADN, et elle est encore couramment utilisée pour la vérification quotidienne des expériences de biologie moléculaire. Cependant, les méthodes de séquençage de l'ADN ont évolué rapidement au cours de la dernière décennie dans ce qu'on appelle séquençage de nouvelle génération (NGS) techniques, qui rendent le séquençage de grandes étendues d'ADN moins coûteux et plus rapide. Les techniques NGS ont permis le séquençage à grande échelle de génomes entiers et ont permis le développement rapide du domaine de la génomique.


Voir la vidéo: Le séquençage du génome (Janvier 2022).