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Préparation d'ADN polymérase normale


Je n'ai pas besoin de la Taq polymérase. Juste besoin d'ADN polymérase normale. L'idée principale est donc de préparer la polymérase directement à partir de Lactobacillus sans utiliser de vecteur cloné. Mon idée est l'électrophorèse utilisant du gel d'agarose et le calcul du point isoélectrique de la polymérase en fonction de la séquence des protéines pour savoir où elles migreront après l'électrophorèse. Est-ce possible pour cette idée ?


C'est un projet très ambitieux pour un bricoleur. Pour expliquer pourquoi, je vais utiliser l'exemple de l'ADN polymérase I de E. coli.

L'ADN polymérase I est l'ADN polymérase la plus abondante dans le E. coli cellule, mais n'est néanmoins présent qu'à environ 300 copies par cellule

Ishihama Y et al. (2008) Profilage de l'abondance des protéines de la Escherichia coli cytosol. BMC Génomique. 9h102.

Il s'agit de la première ADN polymérase jamais purifiée, dans le laboratoire d'Arthur Kornberg

(Synthèse enzymatique de l'acide désoxyribonucléique : I. PREPARATION DE SUBSTRATS ET PURIFICATION PARTIELLE D'UNE ENZYME D'ESCHERICHIA COLI Lehman, MJ et al. (1958) J. Biol. Chem. 33 :163-170.).

Dans cet article, une méthode de purification est décrite qui commence avec 60 litres de culture. Il y a aussi cette déclaration :

« Un kilo de E. coli donne moins de 10 mg de l'enzyme purifiée."

Je suppose que vous n'avez aucune expérience de la purification des protéines, alors je vais juste vous dire que c'est très décourageant : de nos jours, avec la surexpression, les gens s'attendent à obtenir des quantités de mg de leurs protéines à partir de quelques grammes de cellules bactériennes.

C'est une illustration claire de pourquoi il est à peu près impensable pour vous de vous lancer dans la purification d'une enzyme comme celle-ci en utilisant des méthodes à petite échelle, et explique pourquoi les techniques de surexpression et l'utilisation de tags d'affinité ont révolutionné la purification des protéines.

Et c'est encore pire : même si vous parveniez à purifier de l'ADN polymérase I à partir d'une source bactérienne, vous constateriez qu'elle n'est en fait pas très efficace pour fabriquer de l'ADN. En effet, en plus d'étendre les amorces dans une direction 5'>3', elle est très efficace pour dégrader l'ADN dans la même direction. En d'autres termes, lorsque l'enzyme se déplace le long d'une molécule modèle, la copiant, elle dégradera tout ADN existant qu'elle rencontrera « avant » sa direction de déplacement. C'est pourquoi la forme la plus couramment utilisée de cette enzyme dans la recherche est le « fragment de Klenow », un fragment de la polymérase dépourvu de l'activité exonucléase 5'>3'. Ce fragment a été fabriqué à l'origine en traitant l'ADN polymérase I avec la protéase subtilisine, mais il est maintenant exprimé à partir d'un gène polA modifié. La polymérase du fragment de Klenow a été utilisée dans les expériences PCR originales (elle devait être ajoutée à nouveau à chaque cycle).

Je ne sais pas combien d'argent vous devez dépenser pour vos projets, mais en fait, ces enzymes peuvent maintenant être achetées à relativement bon marché. Je ne pense pas que vous puissiez vous attendre à les faire vous-même, sans que cela devienne le projet à proprement parler.

Enfin, si vous pouvez vous procurer une souche de E. coli avec un plasmide d'expression pour la polymérase Taq, vous pouvez vraiment créer le vôtre très facilement - je l'ai fait moi-même (mais je n'ai plus la souche) et la stabilité thermique de l'enzyme rend la purification triviale. Il serait beaucoup plus facile d'utiliser votre propre Taq avec un bain-marie chauffé que d'essayer de fabriquer de l'ADN polymérase I. Mais évidemment, cela dépend de ce que vous essayez de faire : la Taq polymérase peut ne pas convenir pour d'autres raisons.


Youreka Science : La découverte de la télomérase : la clé de l'immortalité chromosomique

00:00:16.07 Toutes les informations nécessaires pour orienter notre développement
00:00:18.17 à partir de cellules individuelles, notre susceptibilité aux maladies,
00:00:20.21 la couleur de nos yeux et de notre peau
00:00:23.07 est codé dans notre ADN.
00:00:25.03 Cette grande quantité d'informations est organisée en 46 chromosomes individuels.
00:00:30.11 Les chromosomes sont constitués de brins linéaires d'ADN.
00:00:34.21 Au fur et à mesure que les cellules se divisent et que notre ADN se réplique,
00:00:37.13 les extrémités des chromosomes linéaires
00:00:39.09 ne peuvent pas eux-mêmes être copiés.
00:00:41.00 Donc, après plusieurs divisions cellulaires,
00:00:42.21 les chromosomes deviennent de plus en plus courts.
00:00:48.02 Cela pose l'une des plus grandes énigmes de la biologie.
00:00:49.25 Au fur et à mesure que les cellules se divisent,
00:00:51.14 comment protégeons-nous toutes les informations
00:00:53.10 encodé dans notre ADN,
00:00:54.20 qui est si important pour notre survie ?
00:00:56.24 Comment les gènes sont-ils protégés contre la délétion à l'extrémité du chromosome ?
00:01:01.08 En 1938, Hermann Muller
00:01:03.20 a observé que les extrémités des chromosomes linéaires
00:01:05.27 avait des propriétés uniques
00:01:08.24 et a appelé cette région le télomère.
00:01:10.18 Dans les années 1970, Elizabeth Blackburn et Joseph Gall
00:01:13.14 a découvert que tous les télomères consistaient en une séquence d'ADN très spécifique
00:01:18.12 composé de milliers de répétitions des mêmes nucléotides
00:01:21.10 -- TTAGGG --
00:01:23.23 dans la levure, les mammifères, etc.
00:01:27.05 Mais ce qui était aussi curieux, c'est que les télomères
00:01:29.18 différaient en longueur au sein d'un individu,
00:01:32.08 et même dans une cellule.
00:01:35.18 Le fait que tous ces organismes
00:01:37.13 avait la même séquence conservée aux extrémités des chromosomes
00:01:41.09 a suggéré que le télomère était très important.
00:01:44.06 Mais, si c'est le cas,
00:01:46.23 alors il doit y avoir un mécanisme pour étendre le télomère
00:01:49.16 et l'empêcher de raccourcir
00:01:51.11 et supprimé après chaque division cellulaire.
00:01:54.00 Alors, comment le télomère s'établit-il et se maintient-il ?
00:01:58.04 Cette question a intrigué les scientifiques
00:02:00.14 dans les années 1980,
00:02:02.07 parce que rien de ce que nous savions sur la biologie ne pouvait expliquer
00:02:04.16 comment l'ADN pourrait être ajouté à la fin
00:02:07.06 d'un autre morceau d'ADN.
00:02:09.06 Réplication normale de l'ADN, par ADN polymérase,
00:02:12.14 nécessite une matrice d'ADN,
00:02:14.12 donc il ne peut rien ajouter aux extrémités des chromosomes,
00:02:17.01 où il n'y a pas de modèle.
00:02:20.12 Dans les années 1980, c'était une pièce manquante importante de la biologie
00:02:24.21 c'était assez mystérieux.
00:02:26.25 Ce puzzle a été résolu par Elizabeth Blackburn et Carol Greider
00:02:30.19 à l'Université de Californie, Berkeley
00:02:33.02 et publiés dans leur article intitulé
00:02:34.24 "Identification d'une activité spécifique de transférase terminale de télomères
00:02:38.01 dans les extraits de Tetrahymena",
00:02:40.16 dans Cell en décembre 1985.
00:02:43.25 Ici, les deux scientifiques ont utilisé un organisme intéressant
00:02:47.07 appelé Tetrahymena
00:02:48.28 qui a aussi des télomères.
00:02:50.13 Cependant, sa séquence de télomères est un peu différente --
00:02:54.01 TTGGGG au lieu des répétitions TTAGGG.
00:02:58.13 Cet organisme subit une étape de développement
00:03:01.00 où il brise son ADN
00:03:03.18 en centaines de petits morceaux,
00:03:05.09 et chaque morceau d'ADN a son propre télomère
00:03:07.22 aux deux extrémités.
00:03:09.19 C'était donc un excellent système pour étudier comment les télomères
00:03:11.25 sont établis et maintenus,
00:03:13.13 car cela semblait se produire rapidement et de manière synchrone
00:03:16.29 chez Tetrahymena, contrairement à d'autres organismes.
00:03:19.27 Plus précisément, ces scientifiques voulaient savoir
00:03:23.17 s'il y avait un facteur qui a ajouté des télomères
00:03:25.13 sur l'ADN dans les noyaux de Tetrahymena.
00:03:28.21 Ces scientifiques ont isolé les noyaux de Tetrahymena,
00:03:32.06 qui contient tout l'ADN et beaucoup d'autres protéines et facteurs.
00:03:35.29 Nous appellerons cela l'extrait de Tetrahymena.
00:03:38.23 Ils ont marqué les nucléotides T ou G avec de la radioactivité.
00:03:43.06 Ces nucléotides seraient incorporés
00:03:45.04 dans les télomères nouvellement formés
00:03:46.26 et marquer radioactivement cette nouvelle séquence.
00:03:50.13 Les scientifiques ont mélangé l'extrait,
00:03:53.05 nucléotides T et G radiomarqués,
00:03:55.22 et une matrice d'ADN simple brin
00:03:57.29 qui imite un télomère déjà existant
00:04:00.23 dans un tube à essai.
00:04:02.25 Ensuite, les scientifiques ont examiné la capacité
00:04:05.17 de l'extrait de Tetrahymena
00:04:07.15 pour étendre le modèle des télomères.
00:04:09.28 Et qu'est-ce que vous obtenez ?
00:04:14.10 L'extrait nucléaire de Tetrahymena,
00:04:16.02 lorsqu'il est mélangé avec des nucléotides T ou G radiomarqués,
00:04:20.04 était suffisant pour produire un télomère.
00:04:22.24 Cependant, si l'un des nucléotides manquait,
00:04:25.21 les télomères n'ont pas pu être produits.
00:04:29.13 Le télomère nouvellement formé et marqué radioactivement
00:04:31.14 a été ajouté au modèle simple brin,
00:04:33.29 et il s'agissait de la même séquence conservée
00:04:38.10 de TTGGGG, encore et encore.
00:04:43.09 Donc, cette importante expérience
00:04:46.14 menée il y a près de 30 ans
00:04:48.05 était la première preuve qu'il y a quelque chose dans le noyau
00:04:51.10 qui peut ajouter une séquence conservée
00:04:52.29 -- TTGGGG --
00:04:54.19 et étendre les chromosomes linéaires.
00:04:57.15 En effectuant plusieurs cycles de purification biochimique,
00:05:00.05 Elizabeth Blackburn et Carol Greider
00:05:02.28 a ensuite montré qu'une seule enzyme clé
00:05:05.17 en est responsable.
00:05:07.19 L'enzyme appelée télomérase,
00:05:09.27 car il produit des télomères.
00:05:12.28 En découvrant que la télomérase
00:05:14.28 est l'enzyme qui peut étendre les capuchons protecteurs
00:05:16.29 aux extrémités des chromosomes, appelé télomère,
00:05:19.28 ces scientifiques ont résolu l'une des énigmes les plus importantes de la biologie.
00:05:25.08 Comment notre ADN est-il protégé de la dégradation
00:05:28.09 après chaque division cellulaire ?
00:05:31.09 Cette importante découverte était la raison pour laquelle ces scientifiques,
00:05:34.06 avec Jack Szostak,
00:05:36.01 a remporté le prix Nobel de physiologie et médecine en 2009.
00:05:39.18 La télomérase a été découverte par des scientifiques
00:05:41.22 intéressé à en savoir plus sur notre propre biologie.
00:05:45.03 Depuis la découverte de la télomérase,
00:05:46.20 nous savons maintenant que cette enzyme
00:05:48.27 joue de nombreux rôles importants dans le vieillissement
00:05:51.12 et des maladies telles que le cancer.
00:05:53.11 En prolongeant les chromosomes, la télomérase
00:05:55.23 peut rendre certaines cellules immortelles.
00:05:57.14 Et les cellules cancéreuses utilisent cette enzyme
00:05:59.12 pour diviser essentiellement indéfiniment.
00:06:03.01 C'est captivant d'apprendre que nous vivons notre vie
00:06:05.11 entre les états d'extension des télomères
00:06:07.25 et raccourcissement,
00:06:09.17 et cela a des implications importantes pour notre biologie.
00:06:12.08 C'est fascinant de voir la question de la science fondamentale
00:06:16.02 de la façon dont l'ADN est protégé par plusieurs divisions cellulaires
00:06:18.27 conduit à la découverte d'une enzyme
00:06:21.04 qui est maintenant impliqué dans un nombre croissant de maladies,
00:06:23.13 et dont la biologie extrêmement complexe
00:06:26.12 nous essayons toujours de démêler 30 ans plus tard.
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Isolement de l'ARNm :

L'ADNc n'est que les séquences codantes complémentaires du transcrit d'ARNm de notre cellule ou gène de notre intérêt, désormais, nous devons d'abord isoler l'ARNm pour la synthèse d'ADNc.

L'ARNm peut être isolé à l'aide du kit d'isolement d'ARNm prêt à l'emploi. Pour isoler l'ARNm du reste de l'ARN, une colonne contenant l'oligo dT est utilisée dans le processus d'isolement.

Une fois l'ARNm transcrit, la queue poly-A est ajoutée au cours du processus appelé modifications post-transcriptionnelles. Et cela différencie l'ARNm du reste des ARN simple brin.

La queue poly-A de l'ARNm reste liée à la colonne contenant l'oligo dT. Après chaque cycle de lavage, tous les ARN sont lavés, seul l'ARNm reste dans la colonne.

Dans l'étape finale, l'ARNm est collecté dans un autre tube en utilisant le tampon d'élution.

Purification d'ARNm :

L'ARNm purifié doit nécessiter pour l'étape suivante, pour cela, l'ARNm est purifié à l'aide du kit de purification et les nucléotides complémentaires oligo-dT sont retirés de la queue poly-A en la chauffant doucement. L'ARNm purifié est utilisé pour la PCR à transcriptase inverse.

Sélection de l'enzyme :

Une polymérase normale ne peut pas synthétiser l'ADN à partir de l'ARN. Nous avons besoin d'un autre type de polymérase pour cela, une polymérase transcriptase inverse.

Une enzyme transcriptase inverse est un type spécial de polymérase isolée des rétrovirus ayant le pouvoir de synthétiser l'ADNc à partir de l'ARNm.

La transcriptase inverse du virus du myéloblastome aviaire et la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney sont deux RT disponibles dans le commerce et couramment utilisées dans la préparation de la bibliothèque d'ADNc.

PCR par transcriptase inverse :

La PCR normale est utilisée pour la synthèse d'ADN à partir d'ADN, tandis que la PCR à transcriptase inverse est applicable à la synthèse d'ADN à partir de la matrice d'ARN à l'aide de l'enzyme transcriptase inverse.

L'ADN est synthétisé à partir du transcrit ou de l'ARNm, mais les étapes de la RT-PCR sont presque similaires à celles de la PCR conventionnelle normale.

Construction de la bibliothèque :

Maintenant, nous avons les amplicons d'un ADNc, l'ADNc est maintenant inséré dans le plasmide en utilisant la méthode de digestion par restriction.

Les extrémités cohésives sont générées sur un plasmide qui se fixe en complément des extrémités cohésives de l'ADNc, ces extrémités cohésives sont générées en utilisant la méthode de digestion par restriction.

Selon la taille et le type d'ADNc, différents types de plasmides sont utilisés pour construire différentes bibliothèques d'ADNc. Le plasmide avec l'ADNc est maintenant inséré dans la bactérie et cultivé en utilisant le milieu nutritif dans des conditions aseptiques.

L'illustration graphique du processus de synthèse d'ADNc et de préparation de bibliothèque.

Ce que nous avons maintenant dans notre BAC (chromosome artificiel bactérien) est connu comme une banque d'ADNc ou une banque d'ADNc qui a tous les fragments de notre intérêt. Nous pouvons l'utiliser à tout moment. Pour l'utiliser dans des applications en aval, l'ADN plasmidique est d'abord isolé et traité par protocole.


Préparation d'ADN polymérase normale - Biologie

Résumé de l'article:

INTRODUCTION AUX POLYMÈRES À ADN

Les molécules d'ADN sont les trésors de l'information génétique d'un organisme. L'ADN est la base de la vie et est transféré du parent à la progéniture. La teneur en ADN du parent est doublée au moyen d'un mécanisme de réplication aidé par une enzyme spécifique, les ADN polymérases. L'ADN polymérase joue un rôle central dans le processus de la vie et porte la lourde responsabilité de faire une copie précise du génome cellulaire. Les ADN polymérases sont des enzymes qui créent des molécules d'ADN en assemblant des nucléotides, les éléments constitutifs de l'ADN. La première preuve de l'existence d'une activité enzymatique capable de synthétiser l'ADN date de 1958 avec la découverte d'E. coli Pol I par A. Kornberg et ses collègues. L'ADN polymérase se déplace le long de l'ancien brin dans la direction 3'-5', créant un nouveau brin ayant une direction 5'-3'.

CLASSIFICATION DES POLYMERASES D'ADN
Sur la base de l'homologie de séquence et de la comparaison des caractéristiques de leur séquence primaire, les ADN polymérases sont classées en sept familles. A, B, C, D, X, Y et RT.


Famille

Types d'ADN polymérase

Espèce

Exemples

UNE

Polymérases réplicatives et réparatrices

Eucaryote et procaryote

ADN polymérase T7, Pol I et ADN polymérase & gamma

B

Polymérases réplicatives et réparatrices

Eucaryote et procaryote

Pol II, Pol B, Pol &zeta, Pol &alpha, &delta et &epsilon

C

Polymérases réplicatives

Procaryote

Pol III


Polymérases réplicatives

Euryarchaeota

Pas bien caractérisé

X

Polymérases réplicatives et réparatrices

eucaryote

Pol &beta, Pol &sigma, Pol &lambda, Pol &mu et Terminal désoxynucléotidyl transférase

Oui

Polymérases réplicatives et réparatrices

Eucaryote et procaryote

Pol &iota (iota), Pol &kappa (kappa), Pol IV et Pol V

RT

Polymérases réplicatives et réparatrices

Virus, rétrovirus et eucaryotes

Télomérase, virus de l'hépatite B

TYPES ET RLES DES POLYMÉRASE D'ADN (RÉPLICATIVES ET RÉPARATRICES)

1. ADN polymérase procaryote

  • La polymérase I est une enzyme de réparation de l'ADN de la famille des polymérases A qui a une activité de 5" à 3" et de 3" à 5".
  • Pol I représente plus de 95% de l'activité polymérase dans coli, bien que des cellules dépourvues de cette polymérase aient été trouvées et que son activité puisse être remplacée par les quatre autres types de polymérase.
  • Cette ADN polymérase a un faible taux de processivité, ajoutant environ 15 à 20 nucléotides par seconde.
  • Cette polymérase de réparation est impliquée dans la réparation par excision avec une activité exonucléase 3'-5' et 5'-3' et le traitement des fragments d'Okazaki générés pendant la synthèse des brins en retard.
  • Cette holoenzyme est la principale polymérase dans coliréplication de l'ADN et fait partie de la famille des polymérases C.
  • La polymérase III est le correcteur d'épreuves exonucléolytique et peut traiter à la fois les brins d'ADN en avance et en retard.
  • Cette enzyme appartient à la famille Y des ADN polymérases.
  • Pol IV est une polymérase sujette aux erreurs qui n'a pas d'activité de relecture de 3 à 5 pouces et qui est impliquée dans la mutagenèse ou l'altération de l'ADN pour donner lieu à une mutation.
  • Pol V appartient également à la famille Y des polymérases et permet de contourner les dommages à l'ADN afin que la réplication se poursuive.
  • Il est impliqué dans les mécanismes de réparation de l'ADN de la réponse SOS et de la synthèse translésionnelle.

2. ADN polymérase eucaryote

  • POL &alpha est membre de la famille des polymérases B et sont les principales polymérases impliquées dans la réplication de l'ADN nucléaire.
  • Cette enzyme unique a deux activités polymérases distinctes : une ADN polymérase 5&rsquo-3&rsquo dépendante de l'ADN et une 5&rsquo-3&rsquo
  • ARN polymérase dépendante de l'ADN. L'activité ARN polymérase est une primase. Pour cette raison, l'enzyme est souvent appelée Pol a:primase. C'est la seule enzyme connue pour avoir à la fois des activités d'ADN polymérase et de primase, et la seule capable d'auto-amorcer la synthèse d'ADN sur un ADNsb précédemment non amorcé.
  • Pol &alpha n'a pas d'activité d'exonucléase 3'-5' intrinsèque et n'a pas non plus d'activité d'exonucléase 5'-3'. In vivo, la fonction principale de Pol a:primase est de fabriquer de courtes amorces ARN/ADN pour la synthèse réplicative d'ADN.
  • ADN polymérase ? a une activité d'ADN polymérase 5'- 3' et une activité d'exonucléase 3'-5' intrinsèque.
  • Pol ? nécessite une protéine associée de 30 kDa, appelée antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA), pour une activité et une processivité complètes de la polymérase. En présence de PCNA, Pol ? est hautement processif, et c'est PCNA qui agit comme un facteur de processivité. Des études biochimiques et génétiques sur des cellules de levure et de mammifère suggèrent que Pol ? est également impliqué dans certains types de synthèse de réparation de l'ADN.
  • En raison de sa haute processivité, Pol &delta reprend la synthèse des brins en avance et en retard de Pol &alpha.
  • Appartient aux polymérases de la famille B et sont les principales polymérases impliquées dans la réplication de l'ADN nucléaire.
  • Pol ? a une activité exonucléase 3'-5'.
  • Pol e est une enzyme raisonnablement processive qui s'associe également à PCNA à une extrémité d'amorce. Ceci suggère qu'il s'agit d'une polymérase réplicative. En raison de sa forte processivité et de son activité de relecture, il a en outre été suggéré que Pol ? est impliqué dans l'allongement de l'amorce, en plus de Pol ?.
  • Pol &epsilon participe à la réparation des erreurs commises dans le brin principal lors de la réplication Pol &delta en conjonction avec la machinerie de réparation des mésappariements de l'ADN.

  • Appartient à la famille X polymérases se trouvent principalement chez les vertébrés, et quelques-uns se trouvent dans les plantes et les champignons.
  • Pol &beta est requis pour la réparation par excision de bases en patch court, une voie de réparation de l'ADN qui est essentielle pour réparer les bases alkylées ou oxydées ainsi que les sites abasiques.
  • C'est la plus petite et la plus simple des polymérases eucaryotes classiques, elle est composée d'un seul

Polymérases &lambda, &sigma et &mu (lambda, sigma et mu)

  • Les polymérases de la famille X contiennent également la polymérase eucaryote bien connue, telle que Pol &sigma (sigma), Pol &lambda (lambda), Pol &mu (mu) et Terminal désoxynucléotidyl transférase (TdT).
  • Pol &lambda et Pol &mu, sont impliqués dans la jonction d'extrémités non homologues, un mécanisme de jonction des cassures double brin de l'ADN dues respectivement au peroxyde d'hydrogène et aux rayonnements ionisants.

Polymérases &eta, &iota et &kappa (eta, iota et kappa)

    , Pol &iota (iota) et Pol &kappa (kappa), sont des ADN polymérases de la famille Y impliquées dans la réparation de l'ADN par synthèse translésionnelle.
  • Les polymérases de la famille Y sont des polymérases de basse fidélité, mais il a été prouvé qu'elles faisaient plus de bien que de mal, car les mutations qui affectent la polymérase peuvent provoquer diverses maladies, telles que le cancer de la peau et le Xeroderma Pigmentosum Variant (XPS).
  • Pol &eta est particulièrement important pour permettre une synthèse précise par translésion des dommages à l'ADN résultant du rayonnement ultraviolet.
  • On pense que Pol &kappa agit comme un extenseur ou un insérateur d'une base spécifique au niveau de certaines lésions de l'ADN.

Polymérases &zeta (zeta)

  • Pol &zeta, une autre polymérase de la famille B, est impliquée dans la synthèse de la translésion.
  • Pol &zeta manque d'activité d'exonucléase 3' à 5', est unique en ce qu'elle peut étendre des amorces avec des mésappariements terminaux.

Polymérases &gamma et &thêta (gamma et thêta)

  • Pol &gamma (gamma) et Pol &theta (thêta) sont des polymérases de la famille A.
  • Pol &gamma, est la seule ADNmtpolymérase et donc se réplique, répare et possède une relecture de l'exonucléase 3'-5'.
  • Toute mutation qui conduit à une Pol &gamma limitée ou non fonctionnelle a un effet significatif sur l'ADNmt et est la cause la plus fréquente de troubles mitochondriaux héréditaires autosomiques.
  • Pol &theta, trouvé chez les eucaryotes, sa fonction n'est pas clairement comprise. Pol &theta appartient à la famille A polymérase.
  • Pol &theta étend les terminaisons d'amorces incompatibles et peut contourner les sites abasiques en ajoutant un nucléotide.
  1. Transcriptase inverse
  • Les rétrovirus emballent leurs génomes sous forme d'ARNss mais répliquent cet ARN via un intermédiaire ADNdb. Pour ce faire, ils emploient une ADN polymérase dépendante de l'ARN (transcriptase inverse).
  • La RT est une ADN polymérase typique dans la direction de synthèse 5'-3', une exigence pour une amorce matrice avec une extrémité 3'-OH et des exigences pour les dNTP et Mg2+.
  • La RT n'a pas d'activité exonucléase spécifique à l'ADN détectable et n'a donc pas de fonction de relecture. Par conséquent, son taux d'erreur est relativement élevé. Cela se reflète dans un taux de mutation élevé, les variants du virus sont générés à haute fréquence. C'est un aspect important de la pathogenèse : les rétrovirus sont aptes à échapper à l'immunosurveillance de l'hôte en raison de la fréquence élevée des mutations.
  • La RT est unique parmi les ADN polymérases à au moins deux égards : &bull Elle peut utiliser des ARNss naturels amorcés comme matrice. Il peut également utiliser un ADNsb amorcé comme modèle. &bull Il a une activité RNase H intrinsèque. La RNase H est une exonucléase processive qui dégrade spécifiquement le brin d'ARN d'un hybride ADN-ARN en commençant par l'extrémité 5' ou 3'. Il peut également agir comme une endonucléase. La RNase H hydrolyse les liaisons phosphodiester pour laisser des produits avec des extrémités 3' hydroxyle et 5' phosphate.
  • L'enzyme est relativement processive et peut répliquer le génome du rétrovirus de 8 kb sans facteur de processivité.

Télomérase

    est une ribonucléoprotéine recrutée pour répliquer les extrémités des chromosomes linéaires, car l'ADN polymérase normale ne peut pas répliquer les extrémités ou les télomères. La télomérase agit comme les autres ADN polymérases en prolongeant l'extrémité 3 & rsquo, mais, contrairement aux autres ADN polymérases, la télomérase ne nécessite pas de matrice.
  • Les composants protéiques et ARN constituent une enzyme active de

200 kDa. Le composant ARN (

IMPORTANCE DES POLYMERASES D'ADN EN BIOTECHNOLOGIE
Les ADN polymérases jouent également un rôle central dans la biologie moléculaire et la biotechnologie modernes, permettant des techniques telles que le clonage d'ADN, la réaction en chaîne par polymérase (PCR), le séquençage de l'ADN, la détection du polymorphisme nucléotidique unique (SNP), l'amplification du génome entier (WGA), la biologie synthétique et la biologie moléculaire. Diagnostique.
ADN POLYMÉRASE THERMOSTABLE
Taq ADN polymérase. Le rapport original de cette enzyme, purifiée à partir de la bactérie des sources chaudes Thermus aquatique, a été publié en 1976. Plus tard, la réaction en chaîne par polymérase a été développée et peu de temps après, "Taq" est devenu un mot familier dans les cercles de biologie moléculaire.
Les ADN polymérases thermophiles, comme d'autres ADN polymérases, catalysent la synthèse dirigée par matrice d'ADN à partir de nucléotides triphosphates. Une amorce ayant un hydroxyle 3' libre est nécessaire pour initier la synthèse et l'ion magnésium est nécessaire. En général, ils ont une activité catalytique maximale à 75 à 80C et des activités sensiblement réduites à des températures plus basses. A 37°C, la Taq polymérase n'a qu'environ 10 % de son activité maximale.
En plus de l'ADN polymérase Taq, plusieurs autres ADN polymérases thermostables ont été isolées et exprimées à partir de gènes clonés. Trois des polymérases les plus utilisées sont décrites dans le tableau suivant :


Polymérase

3'->5'
Exonucléase

Source et propriétés

Taq

Non

De Thermus aquatique. La demi-vie à 95°C est de 1,6 heures.

Pfu

Oui

De Pyrococcus furiosus. Semble avoir le taux d'erreur le plus bas des ADN polymérases thermophiles connues.

Évent

Oui

De Thermococcus litoralis également connu sous le nom de polymérase Tli. La demi-vie à 95 °C est d'environ 7 heures.

Défis futurs
Les ADN polymérases modifiées continueront de jouer un rôle important dans la biotechnologie et la prestation des soins de santé. Au cours des prochaines années, des méthodes moléculaires plus faciles, moins chères et plus rapides verront le jour. Dans le même temps, la biologie moléculaire évoluera vers l'analyse de biomolécules à faible concentration (c'est-à-dire un seul ensemble de chromosomes). De nouvelles techniques d'amplification sont également nécessaires pour profiler les variations génétiques entre des cellules individuelles car la quantité d'ADN génomique d'une seule cellule est insuffisante pour séquencer directement. Par conséquent, l'ADN doit d'abord être amplifié avant une analyse plus approfondie. De plus, des ADN polymérases avec des taux d'erreur très faibles sont nécessaires pour garantir que l'ADN long et amplifié soient des copies exactes du matériau de départ.
Par conséquent, de nouveaux systèmes d'amplification de l'ADN sont nécessaires pour accélérer les progrès des technologies émergentes et rendre la haute fidélité in vitro routine d'analyse et de manipulation du génome. Les ADN polymérases modifiées ou les machines de réplication cellulaire capables d'amplifier de grands fragments d'ADN ont le potentiel de permettre la génomique cellulaire, la synthèse du génome et la manipulation. Ce numéro résume les propriétés connues de divers systèmes d'ADN polymérase et comment les ADN polymérases sont actuellement manipulées pour répondre à ces demandes croissantes.

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Structure, réplication et technologie de l'ADN - Réaction en chaîne par polymérase

Il était une fois un grand épisode de Star Trek, où des extraterrestres appelés "tribbles" sont montés à bord du navire et ont continué à se reproduire au point que tout le navire était rempli de tribbles. Cet exemple n'est pas très différent de la façon dont le réaction en chaîne par polymérase (ou PCR, pour nous les nerds) fonctionne. Vous commencez avec quelques morceaux d'ADN, et en quelques heures, vous avez des milliers de copies du même morceau d'ADN.

Mais pourquoi les scientifiques ont-ils besoin de tout cet ADN ? Sont-ils une bande d'excentriques qui se drapent dans des brins d'ADN, ou se construisent des amis imaginaires à partir de bonhommes de neige à ADN ? Peut-être peut-être pas. La plupart des scientifiques ont besoin de beaucoup d'ADN pour mener des études sur ce que la génétique détermine si une personne développera ou non un cancer, ou pour fabriquer artificiellement des protéines lors de la formulation de vaccins ou de médicaments, ou pour étudier quels types d'organismes vivent dans la mer (dont beaucoup pas grandir en laboratoire). L'amplification PCR de l'ADN a été un outil magnifique (oui, nous y sommes allés) en biologie pour étudier presque tout ce que nous savons aujourd'hui. La plupart des gens disent "la meilleure chose depuis le pain tranché", mais les scientifiques disent "la meilleure chose depuis la PCR".

La PCR est généralement utilisée pour amplifier un gène, ou une partie de gène, afin que nous puissions étudier la fonction de ce gène ou de cette région de gène. Amorces sont utilisés pour flanquer la région que vous souhaitez amplifier. Chaque amorce amplifiera la séquence du gène sur les deux brins, créant un produit génique double brin. Le processus PCR suit 3 étapes :

  1. 95 °C Étape de dénaturation. Tout d'abord, vous chauffez l'ADN à une température élevée (95 °C) afin que les deux brins d'ADN génomique, et plus tard l'ADN PCR, se séparent.
  2. Étape de recuit (à

Chaque étape double la quantité de copies d'ADN de votre séquence cible. Vous pouvez répéter ces trois étapes, la dénaturation, l'hybridation et l'élongation, 20 à 40 fois pour générer des quantités massives d'une séquence génétique spécifique. Si vous n'avez qu'une copie d'un gène et que vous effectuez 40 cycles de PCR, vous aurez 240 copies de ce gène, soit 1 mille milliards copies.

Ingrédients PCR

Il n'y a que quelques ingrédients nécessaires pour que la PCR fonctionne :

  • ADN modèle
  • amorces d'ADN
  • Désoxynucléotides triphosphates (dNTP)
  • Polymérase thermophile avec un tampon.

Vous vous demandez probablement « Qu'est-ce qu'une polymérase thermophile ? » C'est une polymérase qui fonctionne mieux à haute température, comme 70 °C, car elle provient de l'organisme Thermophilis aquaticus, une archébactérie qui vit dans des bouches d'aération profondes dont la température est normalement de 80 à 90 °C. Pourquoi utilisez-vous cette polymérase au lieu de l'ADN polymérase ordinaire ? Eh bien, 40 cycles de chaleur à 95° pour l'étape de dénaturation entraîneront la décomposition de la polymérase et une perte d'activité. Vous essayez de travailler dans une chaleur de 95 °C et voyez à quel point vous vous en sortez.

Les dNTP sont essentiellement les nucléotides adénine (ATP), guanine (GTP), cytosine (CTP), et thymine (TTP) qui sont liés à trois phosphates au lieu d'un. Un dNTP catalyse la réaction de polymérisation en brisant les deux autres phosphates et en se liant à la nouvelle base pour s'apparier avec le brin matrice d'ADN. L'ADN matrice peut être un ADN génomique ou plasmidique, ou même un autre produit de PCR. Il s'agit d'une petite quantité d'ADN à partir de laquelle vous souhaitez amplifier une séquence spécifique.

Séquençage de l'ADN : vérification des bandes

L'une des applications les plus importantes de la technologie PCR est la capacité de séquencer des morceaux d'ADN. Les informations sur la séquence d'ADN sont importantes car la séquence d'ADN détermine la séquence d'acides aminés, qui détermine ensuite la fonction de la protéine. Et, de nombreuses protéines ont des régions qui se distinguent facilement en fonction de leur séquence d'acides aminés. Ces régions sont appelées domaines, et donnent souvent un indice sur la fonction de la protéine.

Séquençage par PCR est essentiellement la même que la PCR ordinaire. Cependant, PCR de séquençage va inclure didésoxynucléotides triphosphates (ddNTP). Ceux-ci manquent à la fois des groupes 3' et 2' -OH du squelette ribose, ce qui empêche une polymérisation ultérieure de l'ADN. Par conséquent, vous arrêtez prématurément la réplication de l'ADN sur un site spécifique.

Le séquençage a initialement commencé en exécutant quatre PCR simultanément avec l'ajout de ddATP, ddTTP, ddCTP ou ddGTP qui étaient radiomarqué. Une personne pourrait alors regarder la taille des bandes sur un gel et déterminer la séquence d'ADN à partir du dernier ddNTP ajouté. Vous pouvez déterminer la séquence d'un brin d'ADN en écrivant les bandes dans l'ordre du bas vers le haut du gel. Ce processus a depuis été amélioré en utilisant un mélange de ddNTP où chaque base est marquée avec une molécule fluorescente différente. Par conséquent, vous pouvez regarder la séquence en fonction de la molécule fluorescente ajoutée à quelle position. C'est un cas où suivre un groupe ne vous causera pas d'ennuis, bien que ce soit le plus proche des groupies en science.

Clonage : j'aime ça ! Avoir un autre !

The PCR technique is highly useful in biotechnology (more detail on this can be seen in the biotechnology section), particularly for molecular cloning. Thanks to PCR, we can easily amplify specific genes and put them into plasmids that can then be put into bacteria or eukaryotic cells to make proteins. This process allows researchers to easily study the function of a certain gene. Despite the limited numbers of genes in humans (

30,000 genes), scientists only know the function of a small set of them. We would know even fewer of their functions without PCR.

Plasmids are small pieces of DNA, around

1 - 1000 kilobases in length, that bacteria use to share genetic information. Sort of like bacterial email. Bacteria have one chromosome, and it contains only the most essential genes for survival. However, sometimes, bacteria need to adapt to new environments, so they share plasmids to help them survive. Plasmids usually carry antibiotic resistance genes, or other genes that improve the bacterial metabolism, which helps the bacteria survive in a host and often leads to disease in the host.

Scientists working on plasmids one day thought, "Why can't we do that?" and decided to start putting in genes that they are interested in on plasmids. Since then, hundreds of genes have been isolated and studied, and we have gained massive insight into the biology of genes by putting them into plasmids and expressing them. One example would be the green fluorescent protein (GFP) from jellyfish. Scientists extracted that gene from jellyfish DNA, put it into a plasmid, and expressed that gene in different tissues. Studying the function of GFP has allowed us to understand how cellular processes work.

Brain Snack

Scientists have made a wide variety of animals that make GFP so that they glow green under UV light. Examples include mice, bunnies, cats, flies, and pigs.


Introduction

DNA double-strand breaks (DSBs) can be caused by exogenous agents (e.g., ionising radiation), defective cellular processes (e.g., replication–transcription collisions or topoisomerase dysfunction), or intentionally by the cell (e.g., in meiosis or immunoglobulin recombination) [1–3]. We have a detailed understanding of DSB repair pathways based on decades of research [4–6] but much less understanding of which pathways are used in a given genomic context in response to particular types of damage.

Prior to the introduction of high-throughput sequencing methods, genome-wide studies of DSB formation and processing were largely restricted to meiotic recombination, where frequent DSBs at well-defined sites can be stabilised either before or after end resection and mapped on microarrays [7–9]. However, these microarray methods lacked the signal-to-noise ratio required for DSB detection in other situations, and so the development of the direct DSB sequencing method BLESS marked a step change in mapping technologies [10]. In BLESS, an adaptor is directly ligated to the DSB end to prime Illumina sequencing reads, allowing precise mapping and relative quantification of breaks. Modifications of BLESS have improved ligation efficiency (END-seq [11], DSB-capture [12]), quantitation (qDSB-seq [13], BLISS [14]), signal-to-noise and generality (BLISS [14], i-BLESS [15]), and variants have been developed for specific systems including meiosis (S1-seq [16]). These methods differ in detail but all involve blunting of the DNA end with nuclease activities that remove 3′ extended single-stranded DNA to form a double-stranded end for adaptor ligation. This can be a problem as end resection forms long tracts of 3′ extended single-stranded DNA each side of a DSB that are degraded by blunting, such that the sequencing adaptor is ligated to the chromosomal DNA many kilobases from the original break site if resection has occurred. Other strategies for DSB mapping include direct labelling of DNA ends with biotin or extracting protein-linked DNA on glass fibre, to allow fragment purification prior to ligation of sequencing adaptors (Break-seq, CC-seq) [17–19] however, like BLESS, these yield the locations of 5′ rather than 3′ ends. Therefore, if resection has occurred, the original location of DNA breaks as opposed to the end point of end resection cannot be mapped by any of these methods, which is problematic as DSB repair is often easiest to inhibit postresection (such as in classic rad51Δ or rad52Δ mutants in yeast).

Profiles yielded by DSB mapping methods can rarely be considered in isolation as replication has a dramatic influence on the distribution of DNA strand breaks in a cell [13,15] replication defects can be a primary cause of DNA damage but replication also provides both opportunity and the requirement to repair existing lesions. Replication forks moving rapidly through chromosomes stall at protein obstacles, DNA damage, and through collisions with the transcription machinery [20–22], and must be restarted by pathways that carry an increased risk of mutation [20–23]. Understanding the distribution and causes of DNA damage across the genome therefore requires integration of DSB profiles with approaches to monitor DNA replication.

Many methods for mapping DNA replication have been developed, which can be broadly divided into those which measure copy number changes through S-phase and those which analyse replication forks or replication bubbles directly. Copy number analysis stratifies the genome based on replication timing and defines early and late-firing origins [24–27]. This requires segregation of cell populations at different stages of replication or between replicating and non-replicating cells, either by cell cycle synchronisation or, more flexibly, by flow cytometry. Copy number methods are well refined, and the innate simplicity of this approach has even allowed application to single cells, revealing surprising uniformity in replication profiles across mammalian cells [28,29]. However, these methods do not have the resolution to detect individual origins in mammalian cells unless markedly different in timing, and a range of other more specialised approaches have been applied to study replication initiation [30,31], particularly by isolating short nascent DNA strands to identify individual origins or initiation zones [32–34]. Methods have also been developed to detect replication fork directionality through isolation and sequencing of Okazaki fragments (OK-seq) [35,36] as well as revealing origins, these methods identify regions that are uniformly replicated in the forward or reverse direction and termination zones in which replication direction will vary depending on the point at which forks converge in individual cells. Although powerful, methods for direct analysis of forks and origins are technically demanding since replication bubbles, short nascent strands and Okazaki fragments are rare species that need to be carefully separated from each other and from contaminating genomic DNA. As an alternative, PU-seq uses a relatively simple DNA library preparation to identify leading and lagging strands based on ribonucleotide incorporation but does require very specific DNA polymerase mutants with reduced ribonucleotide discrimination [37].

Direct ligation of a sequencing adaptor to the 3′ end of individual DNA strands would be a very attractive means of quantifying DNA damage irrespective of DNA resection, and direct labelling of DNA 3′ ends may reveal replication fork direction, particularly in mutants unable to ligate Okazaki fragments. Some methods aimed at mapping single-strand breaks and base changes theoretically have this capability [38,39], and very recently, the Ulrich lab described such a method, GLOE-seq, that is capable of replication profiling in DNA ligase-deficient yeast and human cells and also maps DSBs, although activity on resected substrates was not tested [40]. Here, we describe an alternative method, Tr ansferase- A ctivated E nd L igation sequencing (TrAEL-seq), which accurately maps DNA 3′ ends at DSBs that have undergone DNA resection. Remarkably, in addition to resected DSBs, we find that TrAEL-seq can profile DNA replication fork direction with excellent sensitivity even in wild-type yeast and mammalian cell populations without labelling or synchronisation.


The plant DNA polymerase theta is essential for the repair of replication-associated DNA damage

Safeguarding of genome integrity is a key process in all living organisms. Due to their sessile lifestyle, plants are particularly exposed to all kinds of stress conditions that could induce DNA damage. However, very few genes involved in the maintenance of genome integrity are indispensable to plants' viability. One remarkable exception is the POLQ gene, which encodes DNA polymerase theta (Pol θ), a non-replicative polymerase involved in trans-lesion synthesis during DNA replication and double-strand break (DSB) repair. The Arabidopsis tebichi (teb) mutants, deficient in Pol θ, have been reported to display severe developmental defects, leading to the conclusion that Pol θ is required for normal plant development. However, this essential role of Pol θ in plants is challenged by contradictory reports regarding the phenotypic defects of teb mutants and the recent finding that rice (Oryza sativa) null mutants develop normally. Here we show that the phenotype of teb mutants is highly variable. Taking advantage of hypomorphic mutants for the replicative DNA polymerase eta, which display constitutive replicative stress, we show that Pol θ allows maintenance of meristem activity when DNA replication is partially compromised. Furthermore, we found that the phenotype of Pol θ mutants can be aggravated by modifying their growth conditions, suggesting that environmental conditions impact the basal level of replicative stress and providing evidence for a link between plants' responses to adverse conditions and mechanisms involved in the maintenance of genome integrity.

Mots clés: DNA replication Pol θ abiotic stress genome stability plants.


  1. Reaction Setup: We recommend assembling all reaction components on ice and quickly transferring the reactions to a thermocycler preheated to the denaturation temperature (98°C). All components should be mixed and centrifuged prior to use. It is important to add Phusion DNA Polymerase last in order to prevent any primer degradation caused by the 3´&rarr 5´ exonuclease activity. Phusion DNA Polymerase may be diluted in 1X HF or GC Buffer just prior to use in order to reduce pipetting errors. Please note that protocols with Phusion DNA Polymerase may differ from protocols with other standard polymerases. As such, conditions recommended below should be used for optimal performance.

Component 20 µl Reaction 50 µl Reaction Final Concentration
Eau sans nucléase to 20 µl to 50 µl
5X Phusion HF or GC Buffer 4 µl 10 µl 1X
10 mM dNTPs 0.4 µl 1 µl 200 µM
10 µM Forward Primer 1 µl 2.5 µl 0.5 µM
10 µM Reverse Primer 1 µl 2.5 µl 0.5 µM
Template DNA variable variable < 250 ng
DMSO (optional) (0.6 µl) (1.5 µl) 3%
Phusion DNA
Polymerase
0.2 µl 0.5 µl 1.0 units/50 µl PCR
Notes: Gently mix the reaction. Collect all liquid to the bottom of the tube by a quick spin if necessary. Overlay the sample with mineral oil if using a PCR machine without a heated lid.

Transfer PCR tubes from ice to a PCR machine with the block preheated to 98°C and begin thermocycling:

Thermocycling conditions for a routine PCR:


STEP
TEMP
TIME
Initial Denaturation 98°C 30 seconds
25-35 Cycles 98°C
45-72°C
72°C
5-10 seconds
10-30 seconds
15-30 seconds per kb
Final Extension 72°C 5-10 minutes
Hold 4-10°C

General Guidelines:

Template:
Use of high quality, purified DNA templates greatly enhances the success of PCR. Recommended amounts of DNA template for a 50 &mul reaction are as follows:
ADN Amount
genomic 50 ng&ndash250 ng
plasmid or viral 1 pg&ndash10 ng

If the template DNA is obtained from a cDNA synthesis reaction, the volume added should be less than 10% of the total reaction volume.

Amplification of difficult targets, such as those with GC-rich sequences or secondary structure, may be improved by the presence of additives such as DMSO (included). A final concentration of 3% DMSO is recommended, although concentration can be optimized in 2% increments. It is important to note that if a high concentration of DMSO is used, the annealing temperature must be lowered as it decreases the primer Tm (2). Phusion DNA polymerase is also compatible with other additives such as formamide or glycerol.

During thermocycling, the denaturation step should be kept to a minimum. Typically, a 5&ndash10 second denaturation at 98°C is recommended for most templates.

For high Tm primer pairs, two-step cycling without a separate annealing step can be used.


Cloning of Specific Genes and their Identification

In this article we will discuss about the top five techniques used for cloning of specific genes and their identification. The techniques are: 1. Direct Selection of Recombinant Clones 2. Colony Hybridization 3. Complementary DNA (c-DNA) 4. Isolation of a Specific Gene: Southern Blotting 5. Polymerase Chain Reaction (PCR).

The restriction digest always contains an assortment of donor DNA fragments depending on the number of restriction sites of the enzyme used. A specific gene that is desired to be cloned may be present on a single fragment, or more often on several fragments. When the assortments of fragments are cloned into the vector DNA, only a few of the recombinants contain the desired gene or part of the gene.

Detection of such recombinants presents a problem. Several techniques have been developed to tackle this problem. One solution is to identify the desired recombinants directly with the help of the marker genes, or indirectly by the technique of colony-hybridization using a radioactive probe of the specific DNA or RNA. Another approach is to use a pre-selected DNA segment containing the desired gene for cloning.

This can be prepared from an m-RNA by reverse transcription (RT). The DNA so produced can be multiplied by the polymerase chain reaction (PCR). The combination of the two is called RT-PCR technique. A desired gene can also be isolated by the Southern blotting technique.

The principles of these techniques are discussed below:

(a) Direct Selection of Recombinant Clones:

A recombinant clone can be selected with the help of marker genes present in the vector as well as in the donor DNA. An example of direct selection can be cloning of threonine synthesis gene (thr + ) in a thr + -amp s host through a vector containing an ampicillin-resistance gene (amp r ). In this case, the objective would be to select a clone containing the thr + gene.

Transformation with recombinant DNA will form some host cells which have the thr + -gene. The non-trans-formant host cells fail to grow in a medium which contains ampicillin but no threonine. Also, those host cells which take up the vector DNA other than thr + gene fail to grow in such a medium, because threonine is absent, though such host cells possess the amp’ gene carried by the vector.

Only those trans-formants are able to form colonies on such a selective medium which have taken up the thr + gene from the donor DNA fragment and amp’ gene of the vector. The presence of these genes in a recombinant host enables it to synthesise threonine and to destroy ampicillin. As a result, such a trans-formant can form a clone of cells.

This is diagrammatically represented in Fig. 9.136:

(b) Colony Hybridization:

By this procedure, it is possible to detect the colonies of recombinants which have taken up a desired DNA segment containing a gene of choice. For detection of such colonies a sample of the DNA containing the particular gene which has been labelled with radioactivity must be available. Alternatively, a sample of radioactive m-RNA of that gene may also be used.

After the host cells are transformed by the recombinant vector DNA, they are plated on agar to allow formation of individual discrete colonies. Among these colonies, the majorities are produced by trans-formants without the desired gene, and only very few might contain it. An impression of the colonies is next transferred to a nitrocellulose filter.

They are then treated with alkali (sodium hydroxide) which causes lysis of the cells. At the same time, the DNA molecules liberated from the cells are denatured in situ to produce single-strands. At the next step, the radioactive DNA probe, denatured to produce single-strands or the radioactive m-RNA is added to the filter.

The single-stranded probe DNA or RNA is allowed to hybridize with the single stranded DNA of the colonies. After removing the unbound radioactive nucleic acid by washing, the filter is kept in contact with an X-ray film for a few weeks to detect the presence of colonies which have taken up the desired gene (auto­-radiographic technique).

The procedure is schematically shown in Fig. 9.137:

(c) Complementary DNA (c-DNA):

The molecular biological techniques make it possible to prepare a DNA which contains a desired gene. Such DNA can be used for cloning into a suitable vector and be inserted into a host, so that selection of the recombinant from a large number of clones which do not contain the desired gene can be avoided. One such method is to prepare a complementary DNA or c-DNA. It is generally applicable for isolation of a gene of the eukaryotic organisms.

Certain specialized cells of eukaryotic organisms produce a particular protein in abundance e.g. the egg-albumin in the oviduct of hens, or insulin in the β-cells of the pancreas. Such cells can act as a source of the specific m-RNA which codes for the protein because the particular species of m-RNA produced in these cells forms the major portion of the total m-RNA can be isolated in pure form.

From such isolated pure m-RNA, DNA can be prepared using the enzyme reverse transcriptase which can use m-RNA as a template for synthesis of a complementary DNA (c-DNA) forming a heteroduplex, i.e. an m-RNA strand duplexed with a single-stranded DNA.

It may be recalled that the eukaryotic m-RNA molecules have a poly-A tail at the 3′-end. The poly-A tail serves as a priming site for initiation of c-DNA synthesis by reverse transcriptase, provided a short sequence of poly de-oxy-thymidine is annealed to the poly-A tail. The enzyme reverse transcriptase then adds nucleotides to poly-dT sequence in the 5′ —> 3′ direction by copying the m-RNA template.

A characteristic feature of reverse transcription is that the synthesis of c-DNA continues even after reaching the 5′-end of m-RNA for some distance producing a hairpin bend where the c-DNA itself acts as template. This extension beyond the 5′-end of m-RNA contains 10 to 20 bases. The m-RNA molecule is then removed by treatment with alkali and the single- stranded DNA is converted to a double-stranded DNA with DNA-polymerase I of E. coli.

The hairpin bend serves as a primer for DNA synthesis. Finally, the hairpin is cleaved by treatment with SI nuclease which specifically attacks single-stranded DNA. As the final form of m-RNA in eukaryotes is without any introns, the DNA produced in this way is also devoid of any introns.

However, the quantity of DNA produced is infinitesimally small and to get an usable quantity for cloning purpose, it has to be multiplied. This is achieved by the polymerase chain reaction (PCR). Thus, a sample of DNA containing a desired gene can be prepared and used for cloning into a suitable vector. The preparation of a double-stranded DNA from an m-RNA is schematically presented in Fig. 9.138.

(d) Isolation of a Specific gene: Southern Blotting:

This method is used for identification of a specific gene in one or a few DNA fragment(s) from amongst the numerous fragments produced by restriction enzyme acting on a genome. The number of fragments produced by a restriction enzyme depends on the length of the recognition sequence of the particular enzyme.

The number of fragments decreases with the length of the recognition sequence, because the probability of the presence of longer sequences on a given DNA molecule is less than that of the presence of shorter sequences.

The principle of identifying a specific gene in a DNA fragment is more or less the same as that of colony hybridization. The technique was developed by E. Southern and has come to be known as Southern blotting. The presence of a particular gene in a fragment is detected with the help of a radioactive probe containing the DNA of that gene. The probe is prepared from a cloned DNA segment of the gene which is desired to be isolated.

The first step is to cleave the genome with a suitable restriction enzyme into large number of fragments of which only one or a few will include the gene desired to be isolated. Next, the restriction digest is subjected to electrophoresis on agarose gel causing the fragments to move to different distances depending on their size i.e. their molecular weights.

Fragments of similar size thereby form separate bands in the gel. Although these bands are not visible as such, they can be made visible under ultraviolet light when treated with a fluorescent dye like ethidium bromide. The smaller DNA fragments move faster in an electric field and form bands further away from the origin than larger fragments.

After the DNA fragments have been separated by electrophoresis, they are denatured in situ by treatment with NaOH, so that the double stranded DNA molecules form single strands. This is necessary for hybridization with the radioactive probe DNA which is similarly treated to produce single strands.

The next step involves transfer of the denatured DNA bands from agarose gel to nitrocellulose filter where they are immobilized, because single-stranded DNA binds tightly to nitrocellulose and is not removed by washing. A firm contact between the gel and the filter is essential for ensuring the transfer of bands intact without diffusion.

In the following step, the filter with the immobilized DNA bands is flooded with the probe containing 32 P-labelled single-stranded DNA, thereby allowing the radioactive DNA to hybridize with the homologous immobilized DNA on the filter. For this purpose, the filter is put into an airtight plastic bag for 16-20 hrs. at a suitable temperature to allow optimal in situ hybridization.

The filter is then washed to remove unbound radioactive probe, dried and auto-radiographed by placing it in contact with an X-ray film for a sufficiently long time (few days to several weeks). On developing the X-ray plate, the band or bands of DNA which hybridized with the probe can be identified.

The corresponding band or bands from an untreated parallel agarose gel electrophorogram can be taken out and DNA can be eluted from the band or bands. This DNA contains the gene from which the probe was prepared. It can be used for cloning in a suitable vector as such, or, if required, it can be multiplied by the PCR technique.

Outline of the procedure of Southern blotting in shown in Fig. 9.139:

The blotting technique developed for isolation and identification of a specific DNA fragment can also be applied for RNA with suitable modifications. The process of blotting RNA bands on agarose gel electrophorogam has been humorously called Northern blotting. Similarly, transfer of electrophoretically separated protein bands to filters has been named Western blotting. Obviously, these designations of blotting techniques have nothing to do with the directions south, north or west.

(e) Polymerase Chain Reaction (PCR):

Polymerase chain reaction is purely a biochemical procedure by means of which a minute sample of DNA can be enormously amplified within a short time without resorting to gene cloning. This powerful technique was developed by Kary Mullis in 1984 .for which he was awarded the Nobel Prize. A DNA fragment containing a selected gene produced by the c-DNA technique or Southern blotting technique can be multiplied to millions of copies by the polymerase chain reaction in a PCR machine within a few hours.

The PCR technique utilizes the same ingredients as are required for normal DNA replication viz. the precursors which are deoxyribonucleoside triphosphates — dATP, dCTP, dTTP and dGTP, the DNA polymerase, a template of single-stranded DNA and the primers which are extended by addition of deoxyribonucleotides. In normal DNA replication, the double-stranded molecule is gradually unwound forming a replication fork and the new strands are synthesized in the leading and the lagging strands using the mother strands as template.

In the PCR technique, on the other hand, another property of DNA is made use of. A characteristic feature of DNA is that on bringing it to a certain high temperature — known as the melting temperature (Tm) — the double strands fall apart into single strands by dissolution of the H-bonds. When the temperature is lowered, the two strands again anneal to restore the double-helix structure. The PCR technique utilizes this properly of DNA for replication.

In the PCR technique, small fragments of DNA having the size of an average gene can be multiplied, but a whole genome which contains thousands of genes cannot be treated. The technique essentially consists of mixing the ingredients and heating the mixture alternately to the melting temperature of the DNA and cooling to a temperature at which new DNA strands can be generated. Each strand of the sample DNA serves as a template for new strand synthesis.

The process requires primers which are short sequences of deoxyribonucleotides complimentary to the respective 3′ and 5′ ends of the sample DNA and can form base-pairs with the single strands of the sample DNA. Through completion of each cycle which takes about two minutes, the number of DNA molecules doubles.

The PCR machine is a thermal cycler in which the temperature, time, number of cycles required for amplification of the sample DNA can be preset for automatic operation. As normal DNA polymerase is thermolabile, a thermo-stable DNA polymerase obtained from a thermophilic organism is used.

This avoids the addition of the enzyme in each cyclic operation. Generally, the DNA polymerase of Thermus aquaticus is used for DNA synthesis in PCR. This enzyme, Taq-polymerase, has an optimum temperature of 72°C and the enzyme remains stable at 94°C. Other DNA-polymerases e.g. that of Pyrococcus furiosus which has an optimal temperature of growth of 100°C can also be used.

Another reason for using thermo-stable DNA polymerases is that DNA synthesized at high temperature is relatively more error-free than DNA synthesized at ordinary mesophilic temperature, like 25° to 30°C.

The cyclic events occurring in a thermal cycler of PCR are described below and they are diagrammatically shown in Fig. 9.140.

(i) The mixture containing the DNA to be amplified, the thermo-stable DNA-polymerase, the deoxyribonucleoside triphosphate precursors and the primers is taken in a tube and placed in the thermal cycler which has been preset for the different temperatures viz. 94°C, 72°C and 60°C, time of treatment at each temperature and the number of cycles to be repeated for obtaining the adequate amplification.

(ii) The operation is started by raising the temperature to 94°C for 1 minute. At this temperature, the double-stranded sample DNA denatures to form single strands, so that each strand can act as a template.

(iii) The temperature is lowered to 60°C for 1 minute during which the added primers anneal with each strand.

(iv) The temperature is next raised to 72°C for 1 minute to allow synthesis of new strands by extension of the primers. Two DNA molecules are produced. Thereby, one cycle is completed.

(v) The temperature is further raised once more to 94°C for 1 minute to denature the newly synthesized double-stranded DNA molecules into single strands which then act as templates for another round of DNA replication.

The above steps are repeated in the automated thermal cycler until DNA sample initially fed is amplified to the desired level. It should be noted that by completion of each cycle, the initial quantity of DNA is doubled. Thus in PCR, DNA increases exponentially. Within a few hours, billions of copies of the sample DNA can be obtained. Thus, a single molecule of DNA produced by reverse transcription of an m-RNA can be multiplied enormously to be used in a cloning programme.


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