Informations

8.S : Techniques de Génétique Moléculaire (Résumé) - Biologie


  • La biologie moléculaire implique l'isolement et l'analyse de l'ADN et d'autres macromolécules
  • L'isolement de l'ADN génomique total implique la séparation de l'ADN de la protéine et d'autres composants cellulaires, par exemple par précipitation de l'ADN à l'éthanol.
  • La PCR peut être utilisée dans le cadre d'une méthode sensible pour détecter la présence d'une séquence d'ADN particulière
  • La PCR peut également être utilisée dans le cadre d'une méthode pour isoler et préparer de grandes quantités d'une séquence d'ADN particulière
  • Les enzymes de restriction sont des endonucléases naturelles utilisées en biologie moléculaire pour couper des séquences d'ADN à des sites spécifiques.
  • Des fragments d'ADN avec des extrémités compatibles peuvent être réunis par ligature. Si la ligature produit une séquence introuvable dans la nature, la molécule est dite recombinante.
  • La transformation est l'introduction d'ADN (généralement des plasmides recombinants) dans des bactéries.
  • Clonage de gènes dans E. coli est une technique courante en biologie moléculaire, car elle permet de fabriquer de grandes quantités d'ADN pour un gène, ce qui permet une analyse ou une manipulation plus poussée
  • Le clonage peut également être utilisé pour produire des protéines utiles, telles que l'insuline, dans les microbes.
  • Le transfert de Southern peut être utilisé pour détecter la présence de toute séquence qui correspond à une sonde, dans un mélange d'ADN (tel que l'ADN génomique total).
  • La rigueur de l'hybridation en buvardage et en PCR dépend de paramètres physiques tels que la température et le contenu de la solution de lavage.

Mots clés:

macromolécules

lyse

détergent

agent chélatant

EDTA

nucléase

pastille

PCR

apprêt

cycle thermique

dénaturer

recuire

se déployer

Taq DNApol

gel électrophorétique

endonucléase de restriction

EcoRI

extrémité collante

bout émoussé

extrémité compatible

ligature

ligase

plasmide

transformation

compétent

électroporation

marqueur sélectionnable

agarose

vecteur

bande

le bromure d'éthidium

tache sud

membrane

dénaturation

hybridation

la lessive

sonde

rigueur

tache du nord

tache occidentale

transgène

organisme génétiquement modifié

transformation

transfection

ADN nu

vecteur

électroporation

micro-injection

vésicules

cal

Assommer

récalcitrant

Agrobactérie

bombardement de particules

ADN-T

Plasmide Ti

effets de position

cellules souches


Biochimie, génétique et biologie moléculaire

8 Résumé

Au cours des 50 dernières années, les grands progrès de la biologie moléculaire, de la génétique et de la biochimie ont éclairé notre compréhension de l'homéostasie de l'eau et de l'équilibre des solutés. L'hypothalamus, le néphron distal et la soif jouent un rôle majeur dans le maintien de l'homéostasie de l'eau. Dans les années 1920-40, il y a eu la découverte de la double fonction de l'hypophyse : un vasopresseur et une fonction antidiurétique. Dans les années 1950, deux petits peptides, la vasopressine et l'ocytocine, d'extraits hypophysaires impliqués dans l'homéostasie de l'eau ont été isolés et leurs structures chimiques ont été déchiffrées et synthétisées. Le rôle du néphron distal dans la capacité de concentration de l'urine via le multiplicateur à contre-courant ainsi que la réabsorption d'eau a été bien établi dans les années 1970-1980. À peu près à la même époque, la présence de canaux d'eau dans la bicouche lipidique a été théorisée, mais la technologie n'était pas suffisamment avancée pour identifier des protéines spécifiques au sein des différentes membranes. Une décennie plus tard, le premier canal d'eau, CHIP28 (AQP1), a été identifié. Depuis lors, plusieurs récepteurs de la vasopressine, transporteurs d'urée, protéines d'aquaporine et voies de signalisation ont été identifiés. Ceux-ci ont contribué à notre compréhension de l'homéostasie de l'eau, à la fois physiologiquement et physiopathologiquement, et ont identifié de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des maladies humaines.


Introduction à la génétique moléculaire

Il est évident que les traits sont transmis d'une génération à l'autre par un mécanisme. Le domaine dédié à l'étude de cette transmission de caractères est devenu la génétique. Les premières expériences des généticiens Hershey et Chase ont déterminé que la transmission des traits était due à une substance appelée acide désoxyribosenucléique (ADN). Il a été déterminé plus tard que la méthode par laquelle l'ADN fonctionne pour transporter et transmettre des informations sur l'organisme était à travers sa séquence de bases azotées :

Les échantillons d'ADN sont placés dans les puits de la surface du gel et l'alimentation électrique est allumée. Comme l'ADN est chargé négativement, les fragments d'ADN se déplacent à travers le gel vers l'électrode positive. Le taux de migration de l'ADN dépend de la taille et de la forme. En général, les fragments linéaires plus petits se déplacent plus rapidement que les plus gros. Par conséquent, l'électrophorèse sur gel peut être commodément utilisée pour la séparation d'un mélange de fragments d'ADN, en fonction de leur taille.

L'agarose forme des gels avec des tailles de pores allant de 100 à 300 nm de diamètre. La taille réelle des pores dépend de la concentration de l'agarose. La taille des pores détermine la gamme de fragments d'ADN qui peuvent être séparés par électrophorèse. Par exemple, un agarose à 0,3 % est utilisé pour la séparation de fragments d'ADN entre 5 et 50 kb, tandis qu'un agarose à 5 % peut séparer des molécules de 100 à 500 pb.

La migration des fragments d'ADN au cours de l'électrophorèse peut être surveillée en utilisant des colorants avec des taux de migration connus. Ces colorants sont ajoutés aux échantillons d'ADN avant le chargement. Les bandes de l'ADN peuvent être détectées en trempant le gel dans une solution de bromure d'éthidium.

Lorsqu'elles sont activées par rayonnement ultraviolet, les paires de bases d'ADN associées au bromure d'éthidium émettent une fluorescence orange. Et de cette manière, les fragments d'ADN séparés par électrophorèse sur agarose peuvent être identifiés (Fig. 7.2).

Électrophorèse sur gel en champ pulsé (PFGE):

Les molécules d'ADN de grande taille (10 Mb) peuvent être séparées dans des gels d'agarose en utilisant PFGE. Ceci est rendu possible en modifiant périodiquement la direction de la migration de l'ADN en changeant l'orientation du champ électrique par rapport au gel. Au fur et à mesure que l'orientation du champ électrique change, les molécules d'ADN s'alignent et migrent dans de nouvelles directions.

La principale limitation de l'électrophorèse sur gel en champ pulsé est que les échantillons ne migrent pas en ligne droite. Cela rend l'analyse ultérieure de l'ADN assez difficile.

Électrophorèse à champ électrique homogène à contour serré (CHEF):

CHEF est une méthode améliorée pour appliquer des champs électriques alternatifs pour séparer les molécules d'ADN en électrophorèse. Dans cette approche, l'angle de réorientation du champ électrique est fixé à 120°C (voire à 90°) et l'électrophorèse est réalisée. En utilisant CHEF, de grands fragments d'ADN (200-300 kb) peuvent être systématiquement séparés en quelques heures.

Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE):

Le gel de polyacrylamide est composé de chaînes de monomères d'acrylamide réticulés avec des unités de méthylènebisacrylamide. La taille des pores du gel dépend de la concentration totale des monomères et des réticulations. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) est utilisée pour la séparation de molécules d'ADN simple brin dont la longueur diffère d'un seul nucléotide.

Les gels d'agarose ne peuvent pas être utilisés à cette fin. En effet, les gels de polyacrylamide ont des pores de taille plus petite que les gels d'agarose et permettent une séparation précise des molécules d'ADN de 10 à 1500 pb. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide est une technique merveilleuse pour la séparation fine des molécules d'ADN qui diffèrent les unes des autres, même de 1 à 3 nucléotides. La PAGE est utilisée dans le séquençage de l'ADN et pour l'identification des produits amplifiés de l'ADN par amplification en chaîne par polymérase (PCR).

Autres utilisations de l'électrophorèse sur gel:

Outre la séparation des fragments d'ADN, l'électrophorèse sur gel est également utile pour comprendre la configuration moléculaire des molécules d'ADN et les interactions protéine-acide nucléique. Ce dernier est basé sur le principe que la liaison d'une protéine à l'ADN entraîne généralement la réduction de la mobilité électrophorétique.

La technique électrophorétique pour l'interaction protéine-acide nucléique implique l'ajout d'une protéine souhaitée à des fragments d'ADN double brin, la séparation de ce complexe et de l'ADN nu par électrophorèse. Les modèles séparés peuvent être visualisés pour comprendre les interactions protéine-acide nucléique.

Technique # 2. Isolement et purification des acides nucléiques:

Presque toutes les expériences portant sur les manipulations génétiques nécessitent des formes pures d'ADN ou d'ARN, voire parfois des deux. Par conséquent, il existe un besoin pour l'isolement fiable des acides nucléiques des cellules. La purification des acides nucléiques implique globalement trois étapes.

1. Briser ou ouvrir les cellules pour exposer les acides nucléiques.

2. Séparation des acides nucléiques des autres composants cellulaires.

3. Récupération des acides nucléiques sous forme pure.

Des procédures analytiques impliquant quelques étapes à plusieurs étapes sont utilisées pour la purification d'acides nucléiques. En fait, des kits commerciaux sont facilement disponibles de nos jours pour permettre la purification de l'ADN ou de l'ARN à partir de différentes sources. Les principes de base et les procédures de purification des acides nucléiques sont brièvement décrits.

Purification de l'ADN cellulaire:

La première étape de la purification de l'ADN consiste à ouvrir les cellules et à libérer l'ADN. La méthode doit être douce pour préserver l'ADN natif. En raison de la variabilité de la structure cellulaire, les approches pour casser les cellules sont également différentes.

Les cellules bactériennes (par exemple E. coli) peuvent être lysées par une combinaison de traitements enzymatiques et chimiques. L'enzyme lysozyme et le produit chimique tétraacétate d'éthylènediamine (EDTA) sont utilisés à cette fin. Ceci est suivi par l'ajout d'un détergent tel que le dodécyl sulfate de sodium (SDS).

Les cellules animales, en particulier les cellules animales cultivées, peuvent être facilement ouvertes par traitement direct des cellules avec des détergents (SDS).

Les cellules végétales avec des parois cellulaires solides nécessitent un traitement sévère pour s'ouvrir. Les cellules sont congelées puis broyées dans un mortier et un pilon. C'est un moyen efficace de briser les parois cellulosiques.

Méthodes pour purifier l'ADN:

Il existe deux approches différentes pour purifier l'ADN des extraits cellulaires.

1. Purification de l'ADN en éliminant les composants cellulaires :

Cela implique la dégradation ou l'élimination complète de tous les composants cellulaires autres que l'ADN. Cette approche est adaptée si les cellules ne contiennent pas de grandes quantités de lipides et de glucides. L'extrait cellulaire est centrifugé à basse vitesse pour éliminer les débris (par exemple des morceaux de paroi cellulaire) qui forment un culot au fond du tube.

Le surnageant est collecté et traité avec du phénol pour précipiter les protéines à l'interface entre les couches organique et aqueuse. La couche aqueuse, contenant les acides nucléiques dissous, est collectée et traitée avec l'enzyme ribonucléase (RNase). L'ARN est dégradé alors que l'ADN reste intact. Cet ADN peut être précipité par addition d'éthanol et isolé après centrifugation, et mis en suspension dans un tampon approprié.

2. Purification directe de l'ADN :

Dans cette approche, l'ADN lui-même est sélectivement retiré de l'extrait cellulaire et isolé. Il existe deux manières de purifier directement l'ADN. Dans un procédé, l'ajout d'un détergent cétyltriméthyl ammonium (CTAB) entraîne la formation d'un complexe insoluble avec les acides nucléiques. Ce complexe, sous forme de précipité est recueilli après centrifugation et mis en suspension dans une solution saline pour libérer les acides nucléiques. Par traitement avec la RNase, l'ARN est dégradé. L'ADN pur peut être isolé par précipitation à l'éthanol.

La seconde technique repose sur le principe d'une liaison étroite entre l'ADN et les particules de silice en présence d'un agent dénaturant tel que le thiocyanate de guanidinium. L'isolement de l'ADN peut être réalisé par l'ajout direct de particules de silice et de thiocyanate de guanidinium à l'extrait cellulaire, suivi d'une centrifugation. En variante, une chromatographie sur colonne contenant de la silice peut être utilisée, et à travers celle-ci l'extrait et le thiocyanate de guanidinium sont passés. L'ADN se lie aux particules de silice dans la colonne qui peuvent être récupérées.

Purification de l'ADN plasmidique:

Des formes pures d'ADN plasmidique sont souvent requises dans les expériences de génie génétique. La condition préalable à un isolement réussi de l'ADN plasmidique est la lyse appropriée et douce des cellules hôtes, de sorte que l'ADN plasmidique soit libéré sans trop de contamination de l'ADN chromosomique.

L'ADN chromosomique de la cellule hôte de poids moléculaire élevé peut être éliminé avec les débris cellulaires par centrifugation à haute vitesse. Il en résulte la formation d'un lysat clarifié à partir duquel l'ADN plasmidique pur peut être isolé. Parmi les différentes méthodes utilisées pour isoler l'ADN plasmidique, deux sont brièvement décrites.

Méthode de centrifugation isopycnique:

Le lysat clarifié (mentionné ci-dessus) est traité avec une solution de chlorure de césium (CsCI) contenant du bromure d'éthidium (EtBr). EtBr peut se lier à des molécules d'ADN linéaires (fragments d'ADN chromosomique et ADN plasmidique ouvert) et non à de l'ADN plasmidique circulaire. La densité du complexe ADN-EtBr est bien inférieure à celle de l'ADN plasmidique. L'ADN plasmidique circulaire peut être séparé par centrifugation isopycnique dans un gradient CsCI-EtBr (Fig. 7.3).

Méthode Birnboim et Doly:

La technique développée par Birnboim et Doly (1979) est largement utilisée pour la purification de l'ADN plasmidique. Cette méthode est basée sur le principe qu'il existe une plage étroite de pH (12,0-12,5) à laquelle se produit la dénaturation de l'ADN linéaire et non de l'ADN circulaire fermé.

Lorsque le lysat clarifié est soumis à un pH alcalin soigneusement contrôlé (12,0 à 12,5), les molécules d'ADN plasmidique restent en solution tandis que toutes les autres molécules d'ADN se dénaturent et précipitent. Ce précipité peut être éliminé par centrifugation. L'ADN plasmidique dans le surnageant peut être concentré par précipitation à l'éthanol. Parfois, une purification supplémentaire de l'ADN plasmidique peut être nécessaire, ce qui peut être réalisé par filtration sur gel.

Facteurs affectant la purification de l'ADN plasmidique:

Plusieurs facteurs influencent la purification de l'ADN plasmidique. Les plus importants sont brièvement décrits.

1. Numéro de copie de plasmide :

Le nombre de plasmides présents dans les cellules hôtes au moment de la récolte est important. Le nombre de copies est à son tour influencé par le milieu de croissance, le génotype de la cellule hôte et le stade de croissance. En général, plus le nombre de copies est élevé, meilleur est le rendement en ADN plasmidique lors de la purification.

2. Préparation du lysat clarifié :

La méthodologie adoptée et le soin apporté à la lyse des cellules hôtes pour préparer le lysat clarifié sont importants.

3. Cellules hôtes avec le gène de l'extrémité A :

Les cellules hôtes de type sauvage possèdent le gène endA qui code pour l'enzyme endonucléase I. Les fonctions de cette enzyme ne sont pas clairement connues. Il est cependant observé que les souches cellulaires portant des mutations endA améliorent la stabilité et le rendement de l'ADN plasmidique.

Purification de l'ARNm:

Parmi les ARN, l'ARNm est fréquemment requis sous une forme pure pour des expériences génétiques. Après rupture des cellules lors de la lyse par différentes techniques, l'extrait cellulaire est déprotéinisé par traitement avec du phénol ou des mélanges phénol/chloroforme. Lors de la centrifugation, les acides nucléiques se concentrent dans la phase aqueuse supérieure qui peut ensuite être précipitée en utilisant de l'isopropanol ou de l'éthanol.

La purification de l'ARNm peut être réalisée par chromatographie d'affinité à l'aide d'oligo (dT)-cellulose (Fig. 7.4). Ceci est basé sur le principe que l'oligo (dT)-cellulose peut spécifiquement se lier aux queues poly (A) de l'ARNm eucaryote. Ainsi, par cette approche, il est possible d'isoler l'ARNm de l'ADN, de l'ARNr et de l'ARNt.

Lorsque la solution d'acide nucléique est passée à travers une colonne de chromatographie d'affinité, l'oligo (dT) se lie aux queues poly(A) de l'ARNm. En lavant la colonne avec un tampon à haute teneur en sel, l'ADN, l'ARNr et l'ARNt peuvent être élués, tandis que l'ARNm est étroitement lié. Cet ARNm peut ensuite être élué par lavage avec un tampon pauvre en sel. L'ARNm est précipité à l'éthanol et recueilli par centrifugation (Fig. 7.4).

Technique # 3. Isolement des chromosomes:

La séparation des gros chromosomes des eucaryotes n'est pas possible par électrophorèse conventionnelle. Les chromosomes individuels des eucaryotes peuvent être séparés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), également connu sous le nom de cytométrie en flux ou caryotypage en flux.

Tri cellulaire activé par fluorescence:

Pour effectuer FACS, les cellules en division (avec les chromosomes condensés) sont soigneusement ouvertes et un mélange de chromosomes intacts est préparé. Ces chromosomes sont ensuite colorés avec un colorant fluorescent. La quantité de colorant qui se lie à un chromosome dépend de sa taille. Ainsi, les plus gros chromosomes (avec plus d'ADN) lient plus de colorants et émettent une fluorescence plus vive que les plus petits.

Les chromosomes mélangés au colorant sont dilués et passés à travers une fine ouverture qui entraîne la formation d'un flux de gouttelettes. Chaque goutte contient un seul chromosome. La fluorescence des chromosomes est détectée par un laser.

Lorsque la fluorescence indique que le chromosome illuminé par le laser est celui souhaité, une charge électrique est spécifiquement appliquée à ces gouttelettes (et à aucune autre) qui se chargent. Cela entraîne la déviation des gouttelettes avec le chromosome souhaité qui peut être séparé du reste et collecté (Fig. 7.5). Les gouttelettes non chargées qui ne contiennent pas le chromosome souhaité passent à travers un récipient de collecte des déchets.

Collection de chromosomes de taille identique:

L'application directe de FACS (décrite ci-dessus) ne convient pas à la séparation de chromosomes de tailles identiques, par ex. chromosomes 21 et 22 chez l'homme. La collecte de ces chromosomes peut être réalisée en utilisant des colorants spéciaux (par exemple Hoechst 33258 et chromomycine A3) qui se lient à l'ADN riche en AT ou à l'ADN riche en GC. Le reste de la procédure est la même que celle qui a été décrite. Il est pratique de séparer deux ou plusieurs chromosomes de tailles identiques par des colorants différents. Ceci est possible car il n'est pas probable que deux chromosomes contiennent des contenus GC/AT identiques.

Technique # 4. Techniques de transfert d'acide nucléique :

Les techniques de transfert sont des outils analytiques très largement utilisés pour l'identification spécifique de fragments d'ADN ou d'ARN souhaités à partir de milliers de molécules. Le transfert fait référence au processus d'immobilisation d'un échantillon d'acides nucléiques ou d'un support solide (membranes de nitrocellulose ou de nylon). Les acides nucléiques transférés sont ensuite utilisés comme cibles dans les expériences d'hybridation pour leur détection spécifique. Un aperçu de la technique de transfert d'acide nucléique est représenté sur la figure 7.6.

Types de techniques de buvardage:

Les techniques de buvardage les plus couramment utilisées sont énumérées ci-dessous :

I. Southern blot (pour l'ADN)

II. Northern blot (pour l'ARN)

IV. Hybridation de colonies et de plaques (cellules de colonie).

Le Southern blot est nommé d'après le scientifique Ed Southern (1975) qui l'a développé. Les autres noms Northern blotting et Western blotting sont des jargons de laboratoire qui sont maintenant acceptés. Le Western blot implique le transfert de blots de protéines et leur identification à l'aide d'anticorps spécifiques.

Une représentation schématique d'un appareil de buvardage typique est illustrée à la figure 7.7.

I. Southern Blot:

La technique de transfert de Southern est la première procédure de transfert d'acide nucléique développée en 1975 par Southern. Il est représenté sur la figure 7.8 et brièvement décrit.

L'ADN génomique isolé des cellules/tissus est digéré avec une ou plusieurs enzymes de restriction. Ce mélange est chargé dans un puits dans un gel d'agarose ou de polyacrylamide puis soumis à une électrophorèse. L'ADN, étant chargé négativement, migre vers l'anode (électrode chargée positivement), les fragments d'ADN plus petits se déplacent plus rapidement.

Les molécules d'ADN séparées sont dénaturées par exposition à un alcali doux et transférées sur du papier de nitrocellulose ou de nylon.Il en résulte une réplique exacte du motif des fragments d'ADN sur le gel. L'ADN peut être annelé au papier lors d'une exposition à la chaleur (80°C). Le papier de nitrocellulose ou de nylon est ensuite exposé à des sondes d'ADNc marquées. Ces sondes s'hybrident avec des molécules d'ADN complémentaires sur le papier. Le papier après un lavage complet est exposé à un film radiographique pour développer une autoradiographie. Ceci révèle des bandes spécifiques correspondant aux fragments d'ADN reconnus par la sonde d'ADNc.

Facteurs affectant le Southern blot:

1. Conditions strictes (contrôle de la rigueur) :

La stringence fait référence à la spécificité avec laquelle une séquence cible d'ADN particulière est détectée par une sonde. Ainsi, dans des conditions très strictes (température élevée et faible concentration en sel), seules des séquences d'ADN complètement complémentaires se lieront et s'hybrideront.

Cependant, des conditions faiblement stringentes permettront l'hybridation de séquences partiellement appariées. Par conséquent, le contrôle de la stringence est très essentiel pour la détection spécifique de molécules d'ADN en Southern blot. Avec un bon contrôle de la stringence, il est désormais possible de détecter une molécule d'ADN avec une seule différence de paire de bases.

2. Membranes pour transfert de transfert :

Dans les premières années, la nitrocellulose était utilisée pour l'immobilisation des molécules d'ADN pendant le transfert par transfert. L'inconvénient de la nitrocellulose est qu'elle est fragile et doit être manipulée avec précaution. Ces dernières années, la plupart des laboratoires ont utilisé des membranes en nylon car elles possèdent une résistance à la traction élevée et une meilleure capacité de liaison pour les acides nucléiques.

Applications du Southern blot:

La technique de Southern blot est extrêmement spécifique et sensible, bien qu'il s'agisse d'une technique simple.

Certaines des applications sont répertoriées :

une. C'est une méthode inestimable dans l'analyse des gènes.

b. Important pour la confirmation des résultats du clonage d'ADN.

c. Utile pour cartographier les sites de restriction autour d'une séquence de gène à copie unique.

ré. Forensiquement appliqué pour détecter des quantités infimes d'ADN (pour identifier la parentalité, les voleurs, les violeurs, etc.).

e. Très utile pour la détermination du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) associé à des conditions pathologiques.

F. Des morceaux d'ADN d'une espèce (par exemple, humain) peuvent être utilisés pour détecter des molécules d'ADN d'espèces apparentées (par exemple, chimpanzé, vache). Cette technique est appelée Zoo-blotting.

II. buvardage du nord:

Le Northern blotting est la technique d'identification spécifique des molécules d'ARN. La procédure adoptée est presque similaire à celle décrite pour le transfert de Southern et est illustrée à la figure 7.9. Les molécules d'ARN sont soumises à une électrophorèse, suivie d'un transfert de transfert, d'une hybridation et d'une autoradiographie.

Les molécules d'ARN ne se lient pas facilement au papier de nitrocellulose ou aux membranes en nylon. Le transfert par transfert de molécules d'ARN est effectué en utilisant un papier chimiquement réactif préparé par diazotation d'amino-benzyloxyméthyle pour créer un papier diazobenzyloxyméthyle (DBM). L'ARN peut se lier de manière covalente au papier DBM.

Certains chercheurs ont par la suite développé des conditions appropriées pour transférer des bandes d'ARN sur du papier de nitrocellulose et des membranes de nylon modifiées. Ceux-ci sont maintenant largement utilisés dans le transfert d'ARN. L'utilisation des papiers DBM est presque abandonnée. Les molécules d'ARN transférées par transfert s'hybrident avec des sondes d'ADN qui peuvent être détectées par autoradiographie.

Le Northern blot est théoriquement une bonne technique pour déterminer le nombre de gènes (via l'ARNm) présents sur un ADN donné. Mais ce n'est pas vraiment réalisable puisque chaque gène peut donner lieu à deux ou plusieurs transcrits d'ARN. Un autre inconvénient est la présence d'exons et d'introns.

III. Dot-Blot:

Le transfert par points est une modification des techniques de transfert Southern et Northern décrites ci-dessus. Dans cette approche, les acides nucléiques (ADN ou ARN) sont directement déposés sur les filtres, et non soumis à une électrophorèse. La procédure d'hybridation est la même que dans les techniques de transfert d'origine. La technique du dot-blotting est particulièrement utile pour obtenir des données quantitatives pour l'évaluation de l'expression des gènes.

IV. Western blot:

Le Western blot implique l'identification de protéines. Il est très utile de comprendre les fonctions des acides nucléiques, en particulier au cours de manipulations génétiques. La technique de Western blot implique le transfert de bandes de protéines électrophorées du gel de polyacrylamide à une membrane de nylon ou de nitrocellulose. Ces protéines peuvent être détectées par des interactions protéine-ligand spécifiques. Des anticorps ou des lectines sont couramment utilisés à cette fin.

Autoradiographie:

L'autoradiographie est le processus de localisation et d'enregistrement d'un radiomarqueur dans un échantillon solide, avec production d'une image dans une émulsion photographique. Ces émulsions sont composées de cristaux d'halogénure d'argent en suspension dans de la gélatine. Lorsqu'une particule p ou un rayon d'un radiomarqueur traverse les émulsions, les ions argent sont convertis en atomes d'argent métallique. Il en résulte le développement d'une image visible qui peut être facilement détectée.

Autoradiographie directe:

L'autoradiographie directe est idéale pour la détection de radionucléides émetteurs β de force faible à moyenne (3 H, 14 C, 35 S). Dans cette technique, l'échantillon est placé en contact direct avec le film. Les émissions radioactives entraînent le développement de zones noires.

Autoradiographie indirecte:

Pour la détection de particules hautement énergétiques (par exemple 32 P, 125 l), l'autoradiographie directe ne convient pas. En effet, ces émissions traversent et dépassent le film, et une grande partie de l'énergie est gaspillée. L'autoradiographie indirecte est utile pour la détection de particules hautement énergétiques. Dans cette technique, l'énergie des particules est d'abord convertie en lumière par un scintillateur, qui émet ensuite des photons lors de l'exposition à une émulsion photographique.

Applications de l'autoradiographie:

Comme déjà décrit, l'autoradiographie est étroitement associée aux techniques de transfert pour la détection d'ADN, d'ARN et de protéines.

Buvardage des colonies et des plaques:

Le transfert de colonies et de plages est un processus d'hybridation pour l'identification et la purification spécifiques de colonies (par exemple, des clones bactériens). Cette technique est illustrée à la figure 7.10 et brièvement décrite ci-dessous.

Les bactéries souhaitées sont cultivées sous forme de colonies sur une plaque de gélose. Lorsqu'un papier filtre en nitrocellulose est superposé sur la plaque de gélose, les colonies sont transférées. Ils sont fixés définitivement au papier par la chaleur. Lors d'un traitement avec un alcali (NaOH), les cellules se lysent et l'ADN se dénature.

Lorsque ces empreintes d'ADN sont exposées à des sondes spécifiques (radiomarqueur), l'hybridation se produit. Le complexe hybride peut être localisé et détecté par autoradiographie. Une stratégie similaire (décrite ci-dessus pour les bactéries) peut être utilisée pour l'identification de phages et de fragments de bibliothèques de phages.

Technique # 5. Séquençage ADN:

La détermination de la séquence nucléotidique dans une molécule d'ADN est l'exigence fondamentale et fondamentale de la biotechnologie. Le séquençage de l'ADN est important pour comprendre les fonctions des gènes et la base des troubles héréditaires. En outre, le clonage d'ADN et la manipulation de gènes nécessitent invariablement la connaissance d'une séquence nucléotidique précise.

Technique de Maxam et Gilbert:

La première technique de séquençage de l'ADN, utilisant des réactifs chimiques, a été développée par Maxam et Gilbert (1977). Cette méthode est brièvement décrite ci-dessous (Fig. 7.11).

Un brin d'ADN source est marqué à une extrémité au 32P. Les deux brins d'ADN sont ensuite séparés. L'ADN marqué est réparti dans quatre échantillons (dans des tubes séparés). Chaque échantillon est soumis à un traitement avec un produit chimique qui détruit spécifiquement une (G, C) ou deux bases (A + G, T + C) dans l'ADN. Ainsi, les brins d'ADN sont partiellement digérés dans quatre échantillons aux sites G, A+G, T+C et C. Il en résulte la formation d'une série de fragments marqués de longueurs variables.

La longueur réelle du fragment dépend du site auquel la base est détruite à partir de l'extrémité marquée. Ainsi, par exemple, s'il y a des résidus C aux positions 4, 7 et 10 loin de l'extrémité marquée, alors le traitement de l'ADN qui détruit spécifiquement C donnera des morceaux marqués de longueur 3, 6 et 9 bases. Les fragments d'ADN marqués obtenus dans les quatre tubes sont soumis à une électrophorèse côte à côte et ils sont détectés par autoradiographie. La séquence des bases dans l'ADN peut être construite à partir des bandes sur l'électrophorèse.

Méthode au di-désoxynucléotide:

Actuellement, la technique préférée pour déterminer la séquence nucléotidique dans l'ADN est celle développée par Sanger (1980). Il s'agit d'une procédure enzymatique communément appelée méthode di-désoxynucléotidique ou méthode de terminaison de chaîne (Remarque : Fredrick Sanger a remporté le prix Nobel à deux reprises, une fois pour déterminer la structure de la protéine, l'insuline la deuxième fois pour le séquençage des nucléotides dans un virus à ARN).

Un di-désoxynucléotide est une molécule chimique fabriquée en laboratoire qui n'a pas de groupe hydroxyle au niveau des carbones 2 & 3 & 8242 du sucre (Fig. 7.12). Ceci contraste avec le désoxyribonucléotide naturel qui possède un groupe hydroxyle en 3 - 8242 sur le sucre.

Rôle de terminaison du di-désoxynucléotide:

Dans le processus normal de réplication de l'ADN, un nucléoside triphosphate entrant est attaché par son groupe 5′-phosphate au groupe 3′-hydroxyle du dernier nucléotide de la chaîne en croissance lorsqu'un di-désoxynucléotide est incorporé à la chaîne en croissance, aucune autre réplication ne se produit. En effet, le di-désoxynucléotide, dépourvu de groupe 3-hydroxyle, ne peut pas former de liaison phosphodiester et la synthèse de l'ADN se termine donc.

Méthode de séquençage:

Le processus de séquençage de l'ADN par la méthode di-désoxynucléotidique est brièvement décrit. Un ADN simple brin à séquencer est choisi comme matrice. Il est attaché à une amorce (une courte longueur d'oligonucléotide d'ADN) complémentaire à une petite section de la matrice. Le groupe 3-hydroxyle de l'amorce initie la nouvelle synthèse d'ADN.

La synthèse de l'ADN est réalisée dans quatre tubes de réaction. Chaque tube contient l'ADN amorcé, la sous-unité Klenow (le plus grand fragment d'ADN polymérase d'E. coli), quatre di-désoxyribonucléotides (ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP). Il est nécessaire de radiomarquer (au 32P) l'amorce ou l'un des désoxyribonucléotides.

Au fur et à mesure que la nouvelle synthèse d'ADN est terminée, chacun des tubes contient des fragments d'ADN de longueur variable liés à l'amorce. Considérons le premier tube de réaction avec la di-désoxyadénosine (ddATP). Dans ce tube, la synthèse d'ADN se termine chaque fois que la chaîne en croissance incorpore ddA (complémentaire à dT sur le brin matrice). Par conséquent, ce tube contiendra une série de fragments d'ADN de différentes longueurs, chacun se terminant par ddA. De manière similaire, pour les 3 autres tubes de réaction, la synthèse d'ADN s'arrête lorsque les di-désoxynucléotides respectifs sont incorporés.

La synthèse de nouveaux fragments d'ADN dans les quatre tubes est représentée sur la figure 7.13.

Les morceaux d'ADN sont dénaturés pour donner des brins libres avec radiomarqueur. Les échantillons de chaque tube sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Cette technique de séparation résout des morceaux d'ADN, de taille différente même par un seul nucléotide. L'ADN le plus court sera le plus rapide à l'électrophorèse.

La séquence de bases dans un fragment d'ADN est déterminée en identifiant les bandes électrophorétiques (radiomarquées) par autoradiographie. Sur la figure 7.14, la séquence du fragment d'ADN nouvellement synthétisé qui est complémentaire du morceau d'ADN d'origine est montrée.

Il est classique de lire les bandes de bas en haut dans le sens 5′ à 3′. En notant l'ordre des bandes premier C, deuxième G, troisième T et ainsi de suite, la séquence de l'ADN peut être déterminée avec précision. Jusqu'à 350 séquences de bases d'un fragment d'ADN peuvent être clairement identifiées en utilisant des autoradiographies.

Modifications de la méthode di-désoxynucléotide:

Le remplacement du 32 P-radiolabel par 33 P ou 35 S améliore la netteté des images auto-radiographiques. L'ADN polymérase de la bactérie thermophile Thermus aquaticus (à la place du fragment de Klenow de l'ADN polymérase I de E. coli) ou une forme modifiée de l'ADN polymérase du phage T7 (séquenase) améliore la technique.

Limites de la méthode di-désoxynucléotidique:

Il y a principalement deux limites à cette technique. Le besoin d'une matrice d'ADN simple brin et l'utilisation d'une amorce pour une séquence inconnue. Ces problèmes peuvent être surmontés en utilisant le bactériophage M13.

Bactériophage M13 en tant que vecteur de clonage et de séquençage d'ADN:

Le cycle de vie du phage M13 est représenté sur la figure 7.15. Ce virus contient un ADN circulaire simple brin. Lorsqu'il infecte E. coli, l'ADN double brin est synthétisé qui est une forme réplicative (RF). L'ADN RF se réplique jusqu'à ce que 50 à 100 copies soient produites. Maintenant, le mode de réplication est modifié pour synthétiser des molécules d'ADN simple brin (ADNsb).

Chacun des ssDNA du phage M13 est recouvert d'une protéine. Les particules de phage traversent ensuite librement la membrane pour être libérées. Ainsi, les cellules E. coli infectées par M13 peut sécréter en continu des particules infectieuses, sans subir de lyse.

Bactériophage M13 est utilisé comme vecteur de clonage et de détermination de séquence d'ADN. Ceci est possible puisque la forme réplicative double brin peut être isolée et utilisée comme plasmide, tandis que l'ADN phagique simple brin peut être utilisé comme matrice pour le séquençage de l'ADN. Habituellement, un ADN cible avec moins de 500 pb peut être cloné et séquencé dans le phage M13.

Cette forme RF double brin du phage M13 sont isolés et l'ADN à cloner est inséré. Ce phage assimilable à un plasmide est retourné à E. coli. (L'absorption de phages avec inserts peut être criblée en utilisant le marqueur lac Z).

Au fur et à mesure que le phage subit son cycle de vie (Fig. 7.15), les molécules d'ADN simple brin de l'ADN inséré sont récupérées. La détermination de la séquence de l'ADN simple brin peut se faire par méthode di-désoxynucléotidique. L'amorce utilisée est complémentaire d'une partie du phage M13 ADN qui est proche du point d'insertion. Par conséquent, une seule amorce peut être utilisée pour différentes molécules d'ADN insérées. Pour déterminer la séquence d'un ADN plus grand (≤ 2 000 pb), il est nécessaire de cloner différents morceaux de l'ADN. A partir des séquences de ces fragments (se chevauchant fréquemment), la séquence finale peut être construite.

Séquençage de l'ADN par Primer Walking:

La technique de marche d'amorce ou d'extension d'amorce est utilisée pour la détermination de séquence de longs morceaux d'ADN (≥ 5 000 pb). Dans cette méthode, l'ADN cloné plasmidique contenant l'ADN cible est annelé avec une amorce (oligonucléotide synthétique). L'amorce se lie à l'ADN proche de l'ADN inséré. Maintenant, l'ADN cible (250-350 nucléotides) est séquencé, le plus souvent par la méthode di-désoxynucléotidique (déjà décrite).

A partir de la séquence de bases d'un fragment de l'ADN cible (déterminée au premier tour), la deuxième amorce est choisie. Il s'agit d'un oligonucléotide qui se lie à une région située à environ 300 nucléotides de la liaison de la première amorce. Le prochain fragment d'ADN cible peut être séquencé par 250 à 300 autres bases (deuxième tour).

Cette séquence sera utile pour choisir la troisième amorce et déterminer les prochaines 250-350 bases (troisième tour). De cette manière, la marche de l'amorce est poursuivie jusqu'à ce que l'ADN cible complet soit séquencé. Trois cycles de technique de marche d'amorce pour le séquençage de l'ADN sont illustrés à la figure 7.16.

Marche des chromosomes dans le séquençage de l'ADN:

La marche chromosomique est une méthode de séquençage de bases d'ADN dans laquelle le chromosome est analysé en étendant une extrémité pour atteindre l'autre. La technique consiste essentiellement à se déplacer systématiquement le long du chromosome d'un emplacement connu à un emplacement inconnu, et ainsi à déterminer la séquence d'ADN. La méthode adoptée pour la marche chromosomique est illustrée à la figure 7.17 et brièvement décrite ci-dessous.

Un fragment d'ADN d'environ 40 000 paires de bases peut être séquencé. Pour commencer, un marqueur est utilisé pour identifier la sonde génique appropriée (à partir de la bibliothèque de sondes d'ADN). Cette sonde génique doit avoir une section de paire de bases identique aux paires de bases du marqueur. Cette sonde initiale s'hybridera uniquement avec les clones contenant le fragment A.

Ce fragment A peut être isolé, cloné et utilisé comme sonde pour détecter le fragment B. Cette procédure de clonage et de sondage avec des fragments est répétée encore et encore jusqu'à ce que le fragment D s'hybride avec le fragment E. Comme il ressort de la description ci-dessus, la marche chromosomique utilise des sondes dérivées des extrémités de clones chevauchants pour faciliter une marche avec la séquence d'ADN. Au cours de cette marche, la séquence du gène cible souhaité peut être identifiée.

Saut chromosomique:

Une stratégie améliorée de marche chromosomique est le saut chromosomique. De nombreuses régions d'ADN difficiles à cloner en marchant peuvent être sautées. La procédure implique la circularisation de grands fragments génomiques générés par la digestion des endonucléases. Ceci est suivi d'un clonage de la région abaissant la fermeture du fragment. Par cette approche, les séquences d'ADN situées à des endroits éloignés peuvent être rassemblées et clonées. Un saut chromosomique peut être construit de cette manière et utilisé pour des promenades chromosomiques sur de longues distances.

Applications de la marche et du saut chromosomiques:

Le gène responsable de la mucoviscidose (FK) a été identifié par la marche et le saut chromosomique. Le gène de la protéine responsable de la mucoviscidose est appelé régulateur de conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR) et est situé sur le bras long du chromosome 7.

Séquençage d'ADN automatisé:

Le séquençage de l'ADN au cours des dernières années est effectué par un séquenceur d'ADN automatisé. Dans cette technique, des marqueurs fluorescents sont attachés à des nucléotides de terminaison de chaîne (di-désoxynucléotides). Cette étiquette est incorporée dans les molécules d'ADN, tout en mettant fin à la synthèse de nouveaux brins.

Quatre colorants fluorescents différents sont utilisés pour identifier les réactions de terminaison de chaîne dans un gel de séquençage. Les bandes d'ADN sont séparées par électrophorèse et détectées par leur fluorescence. Récemment, quatre colorants qui présentent une forte absorption au laser sont utilisés pour le séquençage automatisé.

Avantages du séquençage automatisé :

C'est une technique rapide et précise. Le séquenceur d'ADN automatisé peut séquencer avec précision jusqu'à 100 000 nucléotides par jour. Le coût ne dépasse pas 0,2 par nucléotide. Le séquençage automatisé de l'ADN a été utilisé avec succès dans le projet du génome humain.

Technique # 6. Méthodes alternatives de séquençage de l'ADN:

Certains groupes de chercheurs ont développé des méthodes alternatives à la méthode de Sanger pour le séquençage de l'ADN. Malheureusement, malgré l'excitation initiale, la plupart de ces méthodes ont disparu de la scène. Il existe au moins deux méthodes prometteuses pour le séquençage de l'ADN : le pyroséquençage et les puces génétiques (puces à ADN).

Pyro-séquençage:

Le pyro-séquençage est une méthode de séquençage d'ADN qui repose sur le principe de déterminer laquelle des quatre bases (A, G, C, T) est incorporée à chaque étape tandis qu'une matrice d'ADN est copiée. Dans cette technique, la matrice copie de manière directe sans didésoxynucléotides ajoutés (ddNTP).

Au fur et à mesure que le nouveau brin est synthétisé, l'ordre dans lequel les désoxynucléotides (dNTP) sont incorporés est détecté et la séquence peut être lue au fur et à mesure que la réaction progresse (Fig. 7.18). L'identification d'une addition de base devient possible puisque l'addition d'un nucléotide s'accompagne de la libération d'une molécule de pyrophosphate. Ceci peut être détecté par la technique de chimiluminescence.

Dans la procédure de pyro-séquençage, chaque dNTP est ajouté individuellement (pas les quatre ensemble), avec une enzyme nucléotidique.Cette enzyme dégrade le dNTP s'il n'est pas incorporé dans le brin d'ADN nouvellement synthétisé. Une fois que le nucléotide approprié est incorporé dans le nouveau brin d'ADN, une molécule de pyrophosphate est libérée.

Celle-ci peut être convertie par l'enzyme sulfurylase en un éclair de lumière (chimiluminescence). Par l'ajout de chaque dNTP séparément, l'un après l'autre, l'ordre des nucléotides ajoutés au brin d'ADN en croissance peut être suivi et la séquence peut être identifiée.

La détection de la molécule pyrophosphate est à la base du séquençage de l'ADN, d'où le nom de pyro séquençage. Le pyro séquençage ne nécessitant pas d'électrophorèse ni aucune autre technique de séparation de fragments d'ADN, il est plus rapide que le séquençage par terminaison de chaîne.

La limitation majeure du pyro séquençage est qu'il est adapté pour détecter la séquence d'environ 200 nucléotides. C'est beaucoup moins que la méthode Sanger. De nombreuses améliorations sont apportées au séquençage pyro afin que des molécules d'ADN beaucoup plus longues puissent être séquencées. En fait, un système automatisé de pyro séquençage est également disponible dès maintenant.

Puces à ADN (puces à ADN):

Les puces à ADN ou puces à ADN sont des développements récents pour le séquençage de l'ADN grâce aux progrès réalisés dans l'automatisation et la miniarisation. Un grand nombre de sondes d'ADN, chacune avec une séquence différente, sont immobilisées à des positions définies sur la surface solide, constituées de nylon ou de verre. Les sondes peuvent être de courtes molécules d'ADN telles que des ADNc ou des oligonucléotides synthétiques. Pour la préparation de puces à haute densité, des oligonucléotides sont synthétisés in situ à la surface de verre ou de silicium. Il en résulte une puce à oligonucléotides plutôt qu'une puce à ADN.

Technique de séquençage de l'ADN:

Une puce à ADN portant un réseau de différents oligonucléotides peut être utilisée pour le séquençage de l'ADN. A cet effet, une molécule test d'ADN marquée par fluorescence, dont la séquence doit être déterminée, est appliquée sur la puce. L'hybridation se produit entre les séquences complémentaires de la molécule d'ADN à tester et les oligonucléotides de la puce.

Les positions de ces oligonucléotides d'hybridation peuvent être déterminées par microscopie confocale. Chaque oligonucléotide s'hybridant représente une séquence de 8 nucléotides qui est présente dans la sonde d'ADN. La séquence de la molécule d'ADN à tester peut être déduite des chevauchements entre les séquences des oligonucléotides s'hybridant (Fig. 7.19).

Applications des puces à ADN:

Il y a eu de nombreux succès avec cette technologie relativement nouvelle de puces à ADN. Certains d'entre eux sont répertoriés.

une. Identification des gènes responsables du développement des systèmes nerveux.

b. Détection de gènes responsables de maladies inflammatoires.

c. Construction de puces à ADN pour chaque gène du génome d'E. coli, et presque tous les gènes de la levure Saccharomyces cerevisiae.

ré. L'expression de plusieurs gènes chez les procaryotes a été identifiée.

e. Détection et criblage de polymorphismes nucléotidiques simples (SNP).

F. Détection rapide de micro-organismes pour la surveillance environnementale.

L'avenir des puces à ADN:

La principale limitation des puces à ADN à l'heure actuelle est l'indisponibilité de puces génomiques complètes pour les eucaryotes supérieurs, y compris les humains. On s'attend à ce que dans les prochaines années, de telles puces à ADN soient disponibles. Cela aidera les biotechnologues à capturer les instantanés fonctionnels du génome en action pour les organismes supérieurs.

Technique # 7. Synthèse chimique de l'ADN:

Les progrès des techniques de laboratoire ont permis de synthétiser chimiquement l'ADN en peu de temps. Ainsi, des oligonucléotides d'environ 100 bases peuvent être produits en environ 10 heures. La synthèse en laboratoire d'ADN (récemment à l'aide de synthétiseurs d'ADN ou de machines à gènes) avec une séquence spécifique de nucléotides, rapidement et à moindre coût, a contribué de manière significative au clonage. La synthèse chimique de l'ADN est basée sur la capacité de protéger les extrémités réactives -5′ et -3′ en les bloquant (protégeant).

La méthode au phosphoramidite:

La méthode au phosphoramidite est la technique de choix, actuellement utilisée, pour la synthèse d'ADN. La synthèse est effectuée sur un système en phase solide, c'est-à-dire en attachant le brin d'ADN en croissance à un support solide, dans un récipient de réaction. La procédure comprend les étapes suivantes.

1. Attachement nucléoside à un support solide :

Le nucléoside initial (base + sucre) est attaché à l'extrémité 3 à un support solide inerte, généralement à des billes de verre à pores uniformes, appelées billes de verre à pores contrôlés (CPG).

2. Préparation des phosphoramidites :

Pour chacune des quatre bases (A, G, C et T), des phosphoramidites peuvent être synthétisés. Ceci est obtenu en attachant un groupe diméthoxytrityle (DMT) au groupe 5 & 8242-hydroxyle du désoxyribose et un groupe diisopropylamine au groupe 3 & 8242-phosphite du nucléoside. Un résidu méthyle protège le groupe 3-phosphite. La structure générale du phosphoramidite est représentée sur la figure 7.20.

Un précurseur de nucléotide (c'est-à-dire un phosphoramidite) avec ses couples 3′-phosphore avec le 5′-hydroxyle du nucléoside initial lié à une bille CPG.

4. Oxydation et déprotection :

Le phosphate trivalent instable est oxydé en phosphate stable pentavalent. Ceci est suivi par l'élimination du DMT qui protège (déprotection) le groupe 5-hydroxyle. Pour plus de commodité, l'oxydation et la déprotection sont considérées ensemble sur la figure 7.21 également, ce sont en fait deux réactions indépendantes. Un autre précurseur de nucléotide est maintenant ajouté et les réactions décrites aux étapes 3 et 4 sont répétées.

Le couplage, l'oxydation et la déprotection sont les trois étapes de la réaction cyclique pour la synthèse d'ADN par la méthode au phosphoramidite. Les cycles sont répétés encore et encore pour synthétiser l'ADN souhaité. A la fin, l'oligonucléotide terminé est retiré du support en verre et les groupements protégeant les bases et les phosphates sont clivés.

Applications des oligonucléotides synthétisés:

Les oligonucléotides synthétisés chimiquement ont un certain nombre d'utilisations en biotechnologie.

1. Les lieurs et adaptateurs sont les oligonucléotides couramment employés dans la préparation d'ADN recombinant

2. Des ADN synthétisés chimiquement avec des séquences connues peuvent être utilisés pour la synthèse de protéines/polypeptides.

3. Les sondes d'ADN, en particulier les sondes oligonucléotidiques simple brin, peuvent être synthétisées en laboratoire. Ceci est basé sur la séquence de codons de l'ARNm qui à son tour dépend de la séquence d'acides aminés.

4. Les oligonucléotides simple brin sont utilisés comme amorces dans la réaction en chaîne par polymérase (PCR).

5. Pour la mutagenèse in vitro, des oligonucléotides simple brin sont utilisés.

Synthèse des gènes:

Le gène est un ADN double brin. Deux oligonucléotides complémentaires simple brin peuvent être synthétisés séparément et, lors de l'annelage, ils forment des doubles brins. Ceci peut être facilement réalisé pour des gènes plus petits (60-90 pb). Cependant, la synthèse de gènes plus longs (> 300 pb) est associée à certaines difficultés pratiques.

Ceci est principalement dû au fait que l'efficacité de couplage pour la synthèse chimique de l'ADN n'est jamais de 100%. Pour surmonter ce problème, de petits fragments d'ADN sont synthétisés et assemblés (Fig. 7.22). Le scellement des entailles est obtenu par l'utilisation d'ADN ligase T4.

Une autre façon de synthétiser des gènes consiste à produire des oligonucléotides chevauchants qui, lors de l'annelage, contiennent de grandes lacunes. Ces lacunes peuvent être comblées par la synthèse enzymatique de l'ADN par l'ADN polymérase. Lors de la synthèse des gènes en laboratoire, il convient de veiller à ce que les nucléotides soient dans la séquence correcte (cela peut être vérifié par la technique de la séquence d'ADN). Har Gobind Khorana, un scientifique américain d'origine indienne et sédentaire, et ses associés ont été les premiers à synthétiser un gène d'ARNt entier pour l'ARNt d'alanyle de levure en 1972.


Techniques de laboratoire de génétique

Pour analyser l'ADN, il est nécessaire de l'isoler de sa source. Souvent, cette source sera constituée de cellules entières d'organismes qui, en plus de l'ADN, contiendront également des lipides, des protéines, des molécules de signalisation et d'autres types de composés. L'ADN pur est obtenu par extraction du reste de la cellule, en le séparant des autres éléments de la cellule et en permettant l'analyse de l'ADN pur. Traditionnellement, cela a été fait en utilisant un processus connu sous le nom d'extraction au phénol, qui lyse la cellule et précipite l'ADN et rien d'autre dans la cellule, nous permettant d'obtenir de l'ADN par une série de mélanges et de fractionnements. Ces dernières années, cependant, des entreprises telles que Qiagen ont créé des kits qui permettent une extraction simple de l'ADN sans le long processus fastidieux normalement requis par l'extraction du phénol. Cela permet aux généticiens d'obtenir facilement et rapidement de l'ADN pur pour une analyse ultérieure.

Ces étapes ultérieures pour l'analyse de l'ADN pur, cependant, nécessitent que l'ADN soit en grande quantité. Alors que les organismes ont généralement de nombreuses cellules à partir desquelles extraire l'ADN, le processus d'extraction n'est pas entièrement précis et certaines cellules ont des ensembles d'ADN différents en raison de processus tels que la recombinaison mitotique. De plus, nos techniques d'analyse actuelles nous permettent d'analyser des longueurs spécifiées d'ADN (<1000 paires de bases) à n'importe quel endroit donné. Ainsi, il serait pratique d'avoir un grand pool pur d'un emplacement spécifique dans le génome d'intérêt. Ceci est obtenu grâce à un processus connu sous le nom de réaction en chaîne par polymérase (PCR). La PCR implique l'amplification d'une partie de l'ADN (<1000 paires de bases) sur une échelle exponentielle. Il implique des processus répétés de fusion de l'hélice double brin, d'hybridation des amorces, de synthèse du brin du complément à l'aide de la polymérase et de production de deux brins d'ADN identiques au premier. Ainsi, à chaque cycle, le nombre de brins d'ADN disponibles double. Le processus est décrit en toute simplicité dans ce schéma :

Le concept d'information de Jablonka est intentionnel et est lié aux conceptions téléosémantiques discutées ci-dessus. Selon les conceptions téléosémantiques standard, les signaux ont des informations parce que la production du signal a été sélectionnée dans l'histoire de l'évolution. Selon le point de vue de Jablonka, cependant, une entité a des informations, non pas parce qu'elle a été sélectionnée, mais parce que la réponse du récepteur à celle-ci a été sélectionnée. Le fait que quelque chose compte comme une information dépend du fait que les entités y répondent de manière (correcte) fonctionnelle.

Jablonka résume son récit général dans la définition suivante :

Une source &mdash, une entité ou un processus &mdash peut être considéré comme ayant des informations lorsqu'un système récepteur réagit à cette source d'une manière spéciale. La réaction du récepteur à la source doit être telle que la réaction puisse réellement ou potentiellement changer l'état du récepteur d'une manière (généralement) fonctionnelle. De plus, il doit exister une relation cohérente entre les variations dans la forme de la source et les changements correspondants dans le récepteur. (Jablonka 2002, p. 582)

Jablonka souligne que selon cette définition, les gènes n'ont pas de statut théoriquement privilégié, ils sont l'une des nombreuses sources d'information. En outre, elle insiste sur le fait que l'accent doit être mis sur le « système d'interprétation du récepteur de l'information », et non sur la source.

Jablonka soutient que les informations contenues dans l'ADN ont peu de points communs avec les informations contenues dans un appel d'alarme, un ciel nuageux ou un signal chimique dans une colonie bactérienne. Dans ces derniers cas, les réactions des récepteurs (ou &ldquoresponses&rdquo) à la source sont adaptatives pour le récepteur : &ldquoan alarme avertit l'oiseau qu'il y a des prédateurs autour du ciel nuageux alerte le singe de la tempête à venir le produit chimique alerte les bactéries d'une famine imminente. » (p. 585). Mais dans le cas de l'ADN, le récepteur ne semble pas réagir d'une manière qui adapte la cellule à quoi que ce soit en particulier. &ldquoPlutôt, l'ADN est simplement &lsquolu&rsquo par la cellule, donc ce n'est pas une information dans le même sens &l'ADN hellip est une information &lsquosur&rsquo la cellule ou l'organisme, plutôt que &lsquopour&rsquo la cellule ou l'organisme.&rdquo (Jablonka 2002, p. 585). Néanmoins, Jablonka affirme que son concept s'applique aux gènes même s'il ne s'applique pas à l'ADN en général :

Cependant, si au lieu de penser à l'ADN en général, nous pensons à un locus particulier avec un allèle particulier, il n'est pas difficile de penser au rôle fonctionnel de cet allèle particulier dans un ensemble particulier de circonstances environnementales. On peut donc dire pour tous types d'informations, y compris des cris d'alarme et des morceaux d'ADN, une source S (allèle, cri d'alarme, ciel nuageux, etc.) porte des informations sur un état E pour un récepteur R (un organisme ou un produit conçu par un organisme), si le récepteur dispose d'un système d'interprétation qui réagit à S d'une manière qui finit généralement par s'adapter R (ou son concepteur, si R est humainement conçu) pour E. (Jablonka 2002, p. 585, mon stress)

Étant donné que Jablonka dit que l'ADN en général n'est pas une information dans le même sens que le cri d'alarme et le ciel nuageux (et que c'est le sens spécifié dans la déclaration ci-dessus), il est surprenant de savoir pourquoi elle prétend que la déclaration citée ci-dessus s'applique à &ldquoall types d'informations. » En outre, son affirmation selon laquelle la déclaration ci-dessus s'applique à des allèles particuliers (et apparemment pas à l'ADN en général) n'est pas simple. Le récit original de Jablonka fournit une manière éclairante de réfléchir à l'information dans les processus biologiques tels que les processus de signalisation cellulaire. Mais son récit ne justifie pas l'idée que les gènes et l'ADN contiennent des informations ou aident à élucider le rôle des gènes et de l'ADN.

5.3 Une interprétation causale des allégations sur ce que font les gènes

Une autre approche pour élucider le rôle des gènes et de l'ADN consiste à remplacer le discours d'information vague par des descriptions causales concrètes fondées sur une compréhension explicite de la causalité (Waters 2000, et à paraître). Cette approche est fondée sur l'idée que la de base théorie et les méthodes de laboratoire associées à la génétique moléculaire peuvent être comprises en termes purement causals. La théorie et la méthodologie de base concernent les synthèses d'ADN, d'ARN et de molécules polypeptidiques, et non le rôle allégué de l'ADN dans la « programmation » ou la « direction » du développement (section 2.3). Le rôle causal des gènes moléculaires dans les synthèses de ces molécules peut être compris en termes de différence réelle causalement spécifique. Cela implique deux concepts causaux, la différence réelle et la spécificité causale. Ces concepts peuvent être expliqués en termes de manipulabilité compte de la causalité.

Le concept de différence réelle s'applique dans le contexte d'une population réelle contenant des entités qui diffèrent réellement par rapport à une propriété. Dans une telle population, il peut y avoir de nombreux potentiel faiseurs de différence. C'est-à-dire qu'il peut y avoir de nombreux facteurs qui pourraient être manipulés pour modifier la propriété pertinente des entités dans la population. Mais le réel les faiseurs de différence sont (en gros) les faiseurs de différence potentiels qui diffèrent réellement, et dont les différences réelles entraînent les différences réelles dans la propriété de la population.

Le concept de réelle différence peut être illustré par le principe de différence de la génétique classique (section 2.1). Selon ce principe, les gènes peuvent être des facteurs de différence en ce qui concerne les différences phénotypiques dans des contextes génétiques et environnementaux particuliers. Ainsi, il identifie les faiseurs de différence potentiels. Lorsque ce principe est utilisé pour expliquer un modèle héréditaire réel, il est appliqué aux gènes qui différaient réellement dans la population présentant le modèle (souvent une population expérimentale). Dans de tels cas, une différence réelle dans le gène parmi les organismes de la population a causé les différences phénotypiques réelles dans cette population (voir Gifford 1990). C'est-à-dire que le gène était le véritable facteur de différence, pas seulement un facteur de différence potentiel (dans cette population).

Le concept de réelle différence peut être appliqué à la génétique moléculaire comme suit. Dans une cellule réelle, où une population de molécules d'ARN non transformées diffère par rapport à la séquence linéaire, la question se pose : qu'est-ce qui cause ces différences ? La réponse est que les différences de gènes dans la cellule provoquent les différences réelles dans les séquences linéaires des molécules d'ARN non traitées, ainsi que dans les populations de molécules d'ARN et de polypeptides. Les gènes ne sont pas les seuls véritables facteurs de différence des différences réelles dans les séquences linéaires de ces molécules. Et cela nous amène au deuxième concept causal, la spécificité causale.

La spécificité causale a été analysée par Lewis (2000). L'idée de base est qu'une relation causale entre deux propriétés est spécifique lorsque de nombreuses valeurs différentes dans une propriété causale entraînent de nombreuses valeurs différentes et spécifiquement différentes d'une variable résultante (les relations causales instancient quelque chose comme une fonction mathématique). Un interrupteur marche/arrêt n'est pas spécifique dans ce sens technique car la propriété causale n'a que deux valeurs (marche et arrêt). Un gradateur est causalement spécifique dans ce sens. Les gènes peuvent être des facteurs spécifiques de différence car de nombreuses différences spécifiques dans les séquences de nucléotides dans l'ADN entraînent des différences spécifiques dans les molécules d'ARN.Ce n'est pas le cas avec de nombreux autres générateurs de différences réels, tels que les polymérases, qui ressemblent davantage à des interrupteurs marche/arrêt (en ce qui concerne les différences dans les séquences linéaires). Les biologistes ont découvert, cependant, l'existence d'autres facteurs de différence réels, en plus des gènes et de l'ADN, qui sont causalement spécifiques en ce qui concerne les séquences linéaires d'ARN et de polypeptides transformés, au moins dans une certaine mesure. Par exemple, dans certaines cellules, les complexes d'épissage appelés splicosomes diffèrent en réalité de plusieurs manières, ce qui entraîne de multiples différences spécifiques dans les séquences linéaires des molécules d'ARN traitées.

Le fait que toutes sortes d'entités soient causalement pertinentes pour la synthèse de l'ARN pourrait amener à penser qu'il existe une parité causale entre les éléments causaux. Mais ce récit montre que les gènes et l'ADN jouent un rôle causal distinctif dans la mesure où les gènes sont les véritables facteurs de différence causalement spécifiques de la différence dans les séquences linéaires des molécules d'ARN non transformées. Ce rôle distinctif s'étend (avec des réserves importantes) aux séquences linéaires de molécules d'ARN et de polypeptides transformés. La théorie de base associée à la génétique moléculaire, par opposition à la théorie fondamentale, peut être élucidée en termes de causalité.

5.4 Explications causales sur le développement des programmes ADN

Weber (2005) et Rosenberg (2006) affirment indépendamment que l'ADN contient un programme génétique qui est exécuté au cours du développement, mais tous deux nient que cette idée dépend de la notion que l'ADN contient des informations sémantiques ou intentionnelles. Ils illustrent ce point en examinant l'explication actuelle des premières étapes de la formation de motifs antéro-postérieurs dans Drosophile embryons. Cette explication explique comment un embryon unicellulaire avec un gradient intracellulaire de protéine bicoïde (la concentration de bicoïde diminue de l'extrémité antérieure à l'extrémité postérieure) se développe en un embryon multicellulaire avec 14 parasegments (les trois premiers parasegments forment plus tard la tête, le suivant trois formeront le thorax et les segments restants formeront des segments abdominaux). Weber commence par expliquer que le gradient bicoïde est "généré par la synthèse de protéines à partir d'une espèce d'ARNm dérivée de la mère (par transcription de gènes maternels) et est déposé dans l'ovule à l'extrémité antérieure par les cellules nourricières maternelles". (Weber 2005, p. 244). Il poursuit en expliquant comment la protéine biocoïde active différentiellement un ensemble de six écart gènes, qui à leur tour activent et désactivent de manière différentielle huit paire-règle gènes, qui activent et désactivent différentiellement polarité des segments gènes et sélecteur homéotique gènes.

Les détails des cascades d'activations et de désactivations de gènes ont été étudiés expérimentalement. Les résumés des résultats de Weber et Rosenberg indiquent que les biologistes peuvent expliquer la formation initiale de motifs en termes de gradients de concentration successifs qui régulent les gènes sans faire appel essentiel aux concepts d'information. Weber rappelle ce point en avançant en détail que l'utilisation du terme « information de position » est métaphorique et que l'action du gradient bicoïde peut être expliquée sans le concept d'information. Il conclut que ce gradient et d'autres ne transportent pas d'informations dans un sens intentionnel, ils jouent plutôt un rôle causal dans la formation de nouveaux gradients par le biais de la régulation des gènes.

Rosenberg discute des problèmes face à l'idée que l'ADN contient un programme génétique pour le développement. Il commence par la question de savoir si le récit des premières étapes du développement du modèle, que lui et Weber résument (séparément), peut être élaboré pour donner « toute l'histoire du développement » (Rosenberg 2006, p.75). Toute l'histoire sera-t-elle macromoléculaire ? Il souligne également que l'explication de la formation de motifs qu'il décrit est formulée en termes de gènes. Il demande : cette explication survivra-t-elle si le concept de gène ne survit pas ? Mais en fin de compte, il exprime de l'optimisme dans la grande idée que l'explication du développement initial du modèle peut être élaborée pour rendre compte de l'ensemble du processus de développement.

Bien que Rosenberg et Weber rejettent tous deux l'idée que l'explication par les biologistes du stade initial de la formation de motifs fasse une référence essentielle à l'idée que les gènes ou l'ADN contiennent des informations intentionnelles, ils supposent que l'explication fait une référence essentielle ou implique l'existence d'un programme génétique. Mais on ne sait pas pourquoi l'utilisation du terme programme est moins métaphorique que le terme informations de position. Rosenberg soutient que nous pouvons déduire que l'ADN peut exécuter des programmes du fait que les ordinateurs peuvent être construits à partir d'ADN et que ces ordinateurs basés sur l'ADN peuvent exécuter des programmes dans le même sens que les ordinateurs à puce de silicium peuvent exécuter des programmes. Néanmoins, on ne sait pas ce que l'ajout de l'expression « exécuter un programme génétique » ajoute à l'explication de la formation initiale du modèle. Weber et Rosenberg présentent leurs résumés de l'explication en termes de causalité tels que &lsquogenerate&rsquo, &lsquodeposit&rsquo, &lsquoactivate&rsquo, et &lsquodeactive&rsquo. On peut se demander si l'explication causale remplace l'idée métaphorique selon laquelle l'ADN programme le développement.

5.5 Théorisation fondamentale versus pragmatique d'investigation

Les comptes tels que ceux présentés ci-dessus, en cas de succès, fournissent une meilleure base pour comprendre le théorie de base associés à la génétique moléculaire, mais il n'est pas clair qu'ils puissent élucider l'idée que les gènes sont des entités « fondamentales » qui « programment » le développement et le fonctionnement des organismes en « dirigant » les synthèses de protéines qui à leur tour régulent tous les processus cellulaires importants . En fait, il existe un scepticisme considérable dans la communauté philosophique au sujet de cette théorie fondamentale. Une critique courante (parmi les philosophes) est qu'elle est centrée sur les gènes.

Plusieurs philosophes ont entrepris de remplacer la théorie fondamentale associée à la génétique moléculaire par une nouvelle théorie fondamentale qui ne « privilégie » pas le gène. Parmi les propositions figure celle de Robert (2004). En s'appuyant sur les écrits de Burian, Griffiths, Keller, Oyama, Moss et d'autres, Robert essaie de construire un nouveau « cadre pour comprendre et expliquer le développement de l'organisme » (p. 78) qui ne réduit pas « le problème du développement » au problème de l'action des gènes. et l'activation des gènes. Il cherche un cadre libre de l'hypothèse alléguée que le développement implique l'expression d'une « information génétique préformée » (p. 56). Robert dit que son cadre se concentre sur les organismes plutôt que sur les gènes et qu'il « prend au sérieux » les complexités dynamiques du développement soulignées par Keller.

Les philosophes engagés dans la théorie fondamentale n'ont pas, au moins encore, attiré beaucoup d'attention de la part des scientifiques en exercice. Peut-être le manque d'attention est-il dû à une différence entre les préoccupations de (nombreux) philosophes de la biologie et les besoins des biologistes en exercice. Wagner, un biologiste théoricien qui a mené des travaux mathématiques/conceptuels sur la théorie de l'évolution ainsi que des recherches empiriques sur l'évolution des caractères morphologiques, fait l'observation suivante dans une critique du livre de Robert,

Robert et ses collègues qui plaident en faveur d'une interprétation similaire ont raison dans la mesure où les gènes seuls ne peuvent pas créer un organisme et sont plutôt intégrés dans un vaste réseau d'interactions causales. Mais les scientifiques ne sont généralement pas intéressés par les déclarations générales sur ce qui est en principe nécessaire pour comprendre un phénomène.

Oui, les scientifiques prennent des décisions pragmatiques sur ce qu'il faut étudier, mais je pense que ces décisions sont tout sauf arbitraires. Le pouvoir des approches génétiques moléculaires n'est pas venu facilement, c'est plutôt le résultat d'une longue histoire de recherche acharnée basée sur une vision dérivée des travaux de Richard Goldschmidt, Alfred Kühn et Thomas Hunt Morgan au début du 20e siècle. Ce n'est donc pas la paresse intellectuelle qui anime le programme de recherche génétique, mais nous engrangeons le butin d'une victoire durement acquise sur la complexité biologique. (Wagner 2004, p. 1405)

Le décalage entre l'intérêt de (nombreux) philosophes pour la théorie fondamentale et le besoin des biologistes pratiquants de prendre des décisions pragmatiques sur ce qu'il faut étudier soulève une question importante sur les sciences centrées sur les gènes qui a été largement négligée par les philosophes : pourquoi tant de recherche biologique est-elle centrée sur gènes et ADN ?


Qu'est-ce que la biotechnologie moléculaire?

Alors que la technologie vise généralement à créer des outils pour responsabiliser l'homme, la biotechnologie vise à changer l'homme lui-même, pour mieux l'adapter au monde. La biotechnologie est l'application des progrès réalisés dans les sciences biologiques, impliquant en particulier la science de la génétique et ses applications. La biotechnologie a contribué à améliorer la qualité, la quantité et la transformation des aliments. Il a également des applications dans la fabrication, où des cellules et des protéines simples peuvent être manipulées pour produire des produits chimiques.

Le mariage de la génétique et de la biologie moléculaire a donné naissance aux groupes de techniques que nous appelons par des noms tels que « génie génétique ». Les techniques sont rapidement devenues partie intégrante de la science biomédicale et bioagricole moderne, et elles promettent de transformer notre monde.


Marqueur moléculaire : Notes d'étude

Un marqueur moléculaire est une séquence d'ADN dans le génome qui peut être localisée et identifiée. En raison d'altérations génétiques (mutations, insertions, délétions), la composition en bases à un endroit particulier du génome peut être différente dans différentes plantes.

Ces différences, collectivement appelées polymorphismes, peuvent être cartographiées et identifiées. Les sélectionneurs préfèrent toujours détecter le gène comme marqueur moléculaire, bien que cela ne soit pas toujours possible. L'alternative est d'avoir des marqueurs qui sont étroitement associés aux gènes et hérités ensemble.

Les marqueurs moléculaires sont très fiables et avantageux dans les programmes de sélection végétale :

je. Les marqueurs moléculaires fournissent une représentation fidèle de la constitution génétique au niveau de l'ADN.

ii. Ils sont cohérents et ne sont pas affectés par les facteurs environnementaux.

iii. Les marqueurs moléculaires peuvent être détectés bien avant le développement des plantes.

iv. Un grand nombre de marqueurs peuvent être générés selon les besoins.

Principe de base de la détection de marqueurs moléculaires:

Supposons qu'il existe deux plantes de la même espèce, l'une sensible aux maladies et l'autre résistante aux maladies. S'il existe un marqueur d'ADN qui peut identifier ces deux allèles, alors le génome peut être extrait, digéré par des enzymes de restriction et séparé par électrophorèse sur gel. Les fragments d'ADN peuvent être détectés par leur séparation. Par exemple, la plante résistante à la maladie peut avoir un fragment d'ADN plus court tandis que la plante sensible à la maladie peut avoir un fragment d'ADN plus long (Fig. 53.1).

Les marqueurs moléculaires sont de deux types :

1. Basé sur l'hybridation d'acide nucléique (ADN) (approches non basées sur la PCR).

2. Basé sur l'amplification PCR (approches basées sur la PCR).

Marqueurs basés sur l'hybridation d'ADN:

Le morceau d'ADN peut être cloné et autorisé à s'hybrider avec l'ADN génomique qui peut être détecté. L'hybridation d'ADN basée sur des marqueurs est largement utilisée. La limitation majeure de cette approche est qu'elle nécessite de grandes quantités d'ADN et l'utilisation de radioactivité (sondes marquées).

Polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP):

RFLP a été la toute première technologie utilisée pour la détection du polymorphisme, basée sur les différences de séquence d'ADN. RFLP est principalement basé sur les sites d'enzymes de restriction altérés, à la suite de mutations et de recombinaisons de l'ADN génomique. Un aperçu de l'analyse RFLP est donné sur la figure 53.2 et représenté schématiquement sur la figure 53.3. La procédure implique essentiellement l'isolement de l'ADN génomique, sa digestion par des enzymes de restriction, la séparation par électrophorèse et enfin l'hybridation par incubation avec des clones et des marqueurs. sondes (Fig. 53.2).

Sur la base de la présence de sites de restriction, des fragments d'ADN de différentes longueurs peuvent être générés en utilisant différentes enzymes de restriction. Sur la figure 53.3, deux molécules d'ADN de deux plantes (A et B) sont représentées. Dans la plante A, une mutation s'est produite conduisant à la perte du site de restriction qui peut être digéré par EcoRI.

Le résultat est que lorsque les molécules d'ADN sont digérées par l'enzyme HindIII, il n'y a pas de différence dans les fragments d'ADN séparés. Cependant, avec l'enzyme EcoRI, les molécules d'ADN de la plante A ne sont pas digérées alors que la molécule d'ADN de la plante B est digérée. Il en résulte un modèle polymorphe de séparation.

Marqueurs basés sur l'amplification PCR:

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une nouvelle technique pour l'amplification de régions sélectionnées d'ADN. L'avantage de la PCR est que même une infime quantité d'ADN peut être amplifiée. Ainsi, les marqueurs moléculaires basés sur la PCR ne nécessitent au départ qu'une petite quantité d'ADN.

Les marqueurs basés sur la PCR peuvent être divisés en deux types :

1. Locus marqueurs non spécifiques, par ex. ADN polymorphe amplifié aléatoirement (RAPD) polymorphisme de longueur de fragment amplifié (AFLP).

2. Marqueurs spécifiques au locus, par ex. polymorphisme nucléotidique simple (SNP) des répétitions de séquences simples (SSR).

Marqueurs d'ADN polymorphe amplifié aléatoirement (RAPD):

RAPD est un marqueur moléculaire basé sur l'amplification PCR. Un aperçu de RAPD est représenté sur la figure 53.4. L'ADN isolé du génome est dénaturé, les molécules matrices sont hybridées avec des amorces et amplifiées par PCR.

Des amorces oligonucléotidiques courtes simples (généralement une amorce de 10 bases) peuvent être choisies arbitrairement et utilisées pour les segments d'ADN d'amplification du génome (qui peuvent être distribués dans tout le génome). Les produits amplifiés sont séparés par électrophorèse et identifiés.

Sur la base des altérations nucléotidiques du génome, les polymorphismes des séquences d'ADN amplifiées diffèrent, ce qui peut être identifié comme des coudes lors de l'électrophorèse sur gel. L'ADN génomique de deux plantes différentes donne souvent des schémas d'amplification différents, c'est-à-dire des RAPD. Ceci est basé sur le fait qu'un fragment particulier d'ADN peut être généré à partir d'un individu, et non à partir d'autres. Cela représente le polymorphisme et peut être utilisé comme marqueur moléculaire d'une espèce particulière.

Polymorphisme de longueur de fragment amplifié (AFLP):

AFLP est une nouvelle technique impliquant une combinaison de RFLP et RAPD. L'AFLP repose sur le principe de génération de fragments d'ADN à l'aide d'enzymes de restriction et d'adaptateurs oligonucléotidiques (ou linkers), et leur amplification par PCR. Ainsi, cette technique combine l'utilité de la digestion de restriction et de la PCR.

L'ADN du génome est extrait. Il est soumis à une digestion de restriction par deux enzymes (un coupeur rare par exemple Msel un coupeur fréquent par exemple EcoRI). Les extrémités coupées des deux côtés sont ensuite ligaturées à des séquences connues d'oligonucléotides (Fig. 53.5).

La PCR est maintenant réalisée pour la présélection d'un fragment d'ADN qui possède un seul nucléotide spécifique. Par cette approche d'amplification présélective, le pool de fragments peut être réduit par rapport au mélange d'origine. Dans le deuxième tour d'amplification par PCR, trois séquences nucléotidiques sont amplifiées.

Cela réduit encore le pool de fragments d'ADN à un niveau gérable (< 100). Une autoradiographie peut être réalisée pour la détection de fragments d'ADN. L'utilisation d'amorces radiomarquées et de fragments marqués par fluorescence accélère l'AFLP.

L'analyse AFLP est fastidieuse et nécessite l'intervention d'un personnel technique qualifié. Certaines personnes ne sont donc pas favorables à cette technique. Ces dernières années, des kits commerciaux sont disponibles pour l'analyse AFLP. L'AFLP est très sensible et reproductible. Il ne nécessite pas de connaissance préalable des informations de séquence. Par AFLP, un grand nombre de bandes polymorphes peuvent être produites et détectées.

Sites marqués par séquence (STS):

Les sites étiquetés par séquence représentent des segments de copie simples uniques de génomes, dont les séquences d'ADN sont connues et qui peuvent être amplifiées par PCR. Les marqueurs STS sont basés sur le polymorphisme de simples répétitions de nucléotides, par ex. (GÉORGIE)m, (GT)m, (CAA)m etc. sur le génome. Les STS ont été récemment développés dans les plantes. Lorsque les loci STS contiennent des polymorphismes de longueur de séquence simples (SSLP), ils sont très précieux en tant que marqueurs moléculaires. Les loci STS ont été analysés et étudiés dans un certain nombre d'espèces végétales.

Les microsatellites sont les multicopies répétées en tandem de motifs mono-, di-, tri- et tétra nucléotidiques. Dans certains cas, la séquence flanquante des séquences répétées peut être unique. Des amorces peuvent être conçues pour de telles séquences flanquantes afin de détecter les microsatellites à séquence étiquetée (STMS). Cela peut être fait par PCR.

Régions amplifiées caractérisées par la séquence (SCAR) :

Les SCAR sont les formes modifiées des marqueurs STS. Ils sont développés par des amorces PCR qui sont faites pour les extrémités du fragment RAPD. Les marqueurs RAPD convertis en STS sont parfois appelés SCAR. Les SCAR sont utiles pour le développement rapide de marqueurs STS.

Sélection assistée par marqueurs moléculaires :

La sélection des caractères souhaités et l'amélioration des cultures font partie des programmes de sélection conventionnels. Ceci est principalement basé sur l'identification des phénotypes. Il est désormais admis que les phénotypes ne représentent pas nécessairement les génotypes. Plusieurs fois, l'environnement peut marquer le génotype. Ainsi, le potentiel génétique de la plante n'est pas vraiment reflété dans l'expression phénotypique pour diverses raisons.

La sélection assistée par marqueurs moléculaires est basée sur l'identification de marqueurs ADN qui relient/représentent les traits de la plante. Ces traits comprennent la résistance aux agents pathogènes et aux insectes, la tolérance aux stress abiotiques et divers autres traits qualitatifs et quantitatifs. L'avantage d'un marqueur moléculaire est qu'un obtenteur peut sélectionner un marqueur approprié pour le caractère souhaité qui peut être détecté bien à l'avance. En conséquence, des programmes de sélection peuvent être planifiés.

Voici les principales exigences pour la sélection moléculaire marquée en amélioration des plantes :

je. Le marqueur doit être étroitement lié au trait souhaité.

ii. Les méthodes de criblage des marqueurs doivent être efficaces, reproductibles et faciles à mettre en œuvre.

iii. L'analyse doit être économique.

Sélection moléculaire :

Avec les progrès rapides de la biologie moléculaire et du génie génétique, il est désormais possible d'améliorer les plantes cultivées en termes de rendement et de qualité. Le terme de sélection moléculaire est fréquemment utilisé pour représenter les méthodes de sélection couplées aux techniques de génie génétique.

L'amélioration de l'agriculture pour répondre aux besoins alimentaires du monde est un domaine hautement prioritaire. Depuis plusieurs années, les programmes conventionnels de sélection végétale (bien que chronophages) ont certainement contribué à améliorer le rendement en grains et la production céréalière.

Le développement de variétés naines et semi-naines de riz et de blé a été à l'origine de la « Révolution verte » qui a contribué à nourrir des millions de personnes frappées par la pauvreté dans le monde. De nombreux développements sur le front de l'agriculture sont attendus dans les années à venir grâce à la sélection moléculaire.

L'analyse de liaison traite essentiellement des études visant à corréler le lien entre le marqueur moléculaire et un trait souhaité. C'est un aspect important des programmes de sélection moléculaire. L'analyse des liens doit être effectuée entre les populations de plusieurs générations pour établir le lien approprié. Au cours des premières années, l'analyse de liaison était effectuée à l'aide d'isoenzymes et des polymorphismes associés. Des marqueurs moléculaires sont maintenant utilisés.Les techniques employées à cet effet ont déjà été décrites.

Loci de traits quantitatifs:

Ce sont de nombreuses caractéristiques contrôlées par plusieurs gènes de manière complexe. Quelques bons exemples sont l'habitude de croissance, le rendement, l'adaptabilité à l'environnement et la résistance aux maladies. Ceux-ci sont appelés traits quantitatifs. Les emplacements sur les chromosomes de ces gènes sont considérés comme des loci de traits quantitatifs (QTL).

Le problème majeur auquel le sélectionneur est confronté est de savoir comment améliorer un caractère complexe contrôlé par de nombreux gènes. Il n'est pas facile de manipuler plusieurs gènes en génie génétique. Par conséquent, il s'agit d'un processus très difficile et long. Par exemple, le développement du riz doré (avec provitamine A enrichie) impliquant l'insertion de seulement trois gènes a pris environ sept ans.

Biotechnologie des plantes arides et semi-arides :

Les termes zone aride sont utilisés pour désigner des conditions environnementales difficiles avec une chaleur et un froid extrêmes. Les champs ont peu d'eau et de minéraux. C'est une tâche différente de faire pousser des plantes et d'obtenir un bon rendement des cultures dans les zones arides. Les régions semi-arides se caractérisent par des conditions météorologiques imprévisibles, des précipitations irrégulières, de longues saisons sèches et de faibles nutriments dans le sol.

La plupart des régions de l'Inde et de nombreux autres pays en développement (Afrique, Amérique latine et Asie du Sud-Est) ont des régions semi-arides. Les cultures comme le sorgho, le millet, l'arachide et le niébé sont principalement cultivées dans les régions tropicales semi-arides. Outre les conditions météorologiques imprévisibles, les stress biotiques et abiotiques contribuent à la perte de récoltes dans ces zones.

Les approches biotechnologiques pour les programmes de sélection dans les régions semi-arides devraient couvrir les domaines suivants :

je. Développement de cultures tolérantes à la sécheresse et à la salinité.

ii. Améliorations pour résister à divers stress biotiques et abiotiques.

iii. Techniques de micro-propagation pour répandre des plantes économiquement importantes qui peuvent résister à des conditions environnementales difficiles.

Un certain succès a été obtenu dans l'amélioration des cultures de sorgho, de mil et de légumineuses qui sont cultivées dans les régions semi-arides. La transformation génétique du sorgho a été possible en utilisant la méthode des microprojectiles.

Technologie des serres et des serres :

Serre signifie littéralement un bâtiment composé de verre pour faire pousser des plantes. Les serres sont nécessaires pour faire pousser des plantes régénérées pour une propagation ultérieure et pour faire pousser les plantes jusqu'à maturité. Les serres sont les étapes intermédiaires impliquant l'étape de transition entre les cultures végétales et les champs de plantes. Le but des serres est d'acclimater et de tester les plantes avant qu'elles ne soient relâchées dans le milieu naturel.

Les plantes sont cultivées en serre pour développer des systèmes racinaires et des feuilles adéquats afin de résister à l'environnement du champ. Les serres sont normalement équipées de systèmes de refroidissement pour contrôler la température. Les serres ont des chambres équipées de lumières artificielles. Il est possible de soumettre les plantes à différents profils d'éclairage. Ces dernières années, de nombreuses améliorations ont été apportées au développement de serres plus adaptées. Il s'agit notamment des paramètres tels que le sol et l'humidité.

La principale limitation de la technologie des serres est l'augmentation des émissions de CO2 production qui à son tour augmente la température. Certaines approches sont disponibles pour contrôler la température. La technologie de la maison verte est un développement récent. Dans ce cas, la température est contrôlée en utilisant un minimum d'énergie.


Techniques moléculaires

Bien que chevauchant les techniques biochimiques, les techniques de génétique moléculaire sont profondément impliquées dans l'étude directe de l'ADN. Ce domaine a été révolutionné par l'invention de la technologie de l'ADN recombinant. L'ADN de tout gène d'intérêt d'un organisme donneur (comme un humain) peut être coupé d'un chromosome et inséré dans un vecteur pour produire de l'ADN recombinant, qui peut ensuite être amplifié et manipulé, étudié ou utilisé pour modifier les génomes d'autres organismes par transgénèse. L'amplification est une étape fondamentale de la technologie de l'ADN recombinant. Ceci est réalisé en insérant la molécule d'ADN recombinant dans une cellule bactérienne, qui se réplique et produit de nombreuses copies du génome bactérien et de la molécule d'ADN recombinant (constituant un clone d'ADN). Une collection d'un grand nombre de clones de molécules d'ADN de donneur recombinant est appelée bibliothèque génomique. De telles bibliothèques sont le point de départ pour le séquençage de génomes entiers tels que le génome humain. Aujourd'hui, les génomes peuvent être analysés à la recherche de petites variantes moléculaires appelées polymorphismes nucléotidiques simples, ou SNP (« snips »), qui agissent comme des marqueurs chromosomiques vers des régions spécifiques associées de l'ADN qui ont une propriété d'intérêt et peuvent être impliquées dans une maladie ou un trouble humain.


Voir la vidéo: Capsule Ecriture formelle en génétique TS (Janvier 2022).