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7.4.4 : Effets des associations médicamenteuses - Biologie


Les médicaments antimicrobiens peuvent interagir avec d'autres médicaments de manière délétère ou peuvent être utilisés en combinaison pour lutter contre les infections microbiennes.

Objectifs d'apprentissage

  • Donnez des exemples d'interactions qui peuvent rendre un antimicrobien inefficace

Points clés

  • L'interaction entre un agent antimicrobien et un autre est très complexe, ainsi que la façon dont ils ciblent les microbes et l'organisme.
  • Bien qu'il ne soit pas certain qu'un médicament puisse interagir avec des antibiotiques, il est considéré comme sage de se tromper en pensant qu'il existe des interactions potentiellement inconnues et nocives résultant du mélange de médicaments.
  • L'utilisation de plus d'un agent antimicrobien est une pratique efficace et largement utilisée pour réduire le risque que les microbes résistent à un traitement.

Mots clés

  • contre-indication: En médecine, une contre-indication est une condition ou un facteur qui sert de motif pour refuser un certain traitement médical.
  • tuberculose: Maladie infectieuse des humains et des animaux causée par une espèce de mycobactérie infectant principalement les poumons où elle provoque des tubercules caractérisées par l'expectoration de mucus et d'expectorations, de la fièvre, une perte de poids et des douleurs thoraciques, et transmise par inhalation ou ingestion de bactéries.
  • thérapie combinée: La thérapie combinée est l'utilisation de plus d'un médicament ou d'une autre thérapie. Le plus souvent, ces termes font référence à l'administration simultanée de deux ou plusieurs médicaments pour traiter une seule maladie.

La pharmacodynamie est le domaine qui tente de comprendre les effets involontaires de l'utilisation de deux médicaments ou plus. La pharmacodynamie est l'étude des effets biochimiques et physiologiques des médicaments sur le corps ou sur des micro-organismes ou des parasites à l'intérieur ou sur le corps. Il examine également les mécanismes d'action des médicaments et la relation entre la concentration et l'effet des médicaments. Ces changements sont extraordinairement difficiles à classer étant donné la grande variété de modes d'action qui existent et le fait que de nombreux médicaments peuvent provoquer leur effet par le biais d'un certain nombre de mécanismes différents. Cette grande diversité signifie également que, dans tous les cas, sauf les plus évidents, il est important d'étudier et de comprendre ces mécanismes. Le soupçon bien fondé existe qu'il existe plus d'interactions inconnues que connues.

Deux interactions bien décrites entre les médicaments antimicrobiens et d'autres médicaments sont entre les antibiotiques et l'alcool et les antibiotiques et la pilule contraceptive. Des interactions entre l'alcool et certains antibactériens peuvent se produire, provoquer des effets secondaires et diminuer l'efficacité du traitement antibactérien. Les risques potentiels d'effets secondaires et d'efficacité dépendent du type d'antibactérien administré. Malgré l'absence de contre-indication catégorique, la croyance selon laquelle l'alcool et les antibactériens ne doivent jamais être mélangés est très répandue. Certains antibactériens peuvent inhiber la dégradation de l'alcool, ce qui peut entraîner des vomissements, des nausées et un essoufflement induits par l'alcool. D'autres effets de l'alcool sur l'activité antibactérienne comprennent une activité altérée des enzymes hépatiques qui décomposent le composé antibactérien. De plus, les taux sériques d'antibactériens bactériostatiques peuvent être réduits par la consommation d'alcool, ce qui entraîne une efficacité réduite et une diminution de l'effet pharmacothérapeutique.

Une autre interaction bien étudiée est celle entre les antibiotiques et la pilule contraceptive. La majorité des études indiquent que les antibiotiques n'interfèrent pas avec les pilules contraceptives. Dans les cas où il a été suggéré que les antibactériens affectent l'efficacité des pilules contraceptives, cela peut être dû à une augmentation des activités des enzymes hépatiques hépatiques provoquant une dégradation accrue des ingrédients actifs de la pilule. Des effets sur la flore intestinale, qui pourraient entraîner une réduction de l'absorption des œstrogènes dans le côlon, ont également été suggérés, mais ces suggestions ont été peu concluantes et controversées. Les cliniciens ont recommandé que des mesures contraceptives supplémentaires soient appliquées pendant les thérapies utilisant des antibactériens suspectés d'interagir avec les contraceptifs oraux.

De plus, lorsqu'il s'agit d'une infection microbienne, l'utilisation de deux antibiotiques ou plus peut parfois lutter efficacement contre l'infection alors que chaque médicament individuellement a peu ou pas d'effet. Cette méthode est appelée thérapie combinée et est utilisée lorsque la nature d'une infection microbienne est inconnue, telle que caractérisée par la combinaison des antibiotiques ampicilline et sulbactam. L'utilisation de deux antibiotiques avec différents modes d'inhibition microbienne augmente les chances que le traitement combatte l'infection microbienne. De plus, la tuberculose a été traitée avec une thérapie combinée pendant plus de cinquante ans. Cela est dû au phénomène de résistance, par lequel un micro-organisme acquiert la capacité de résister à un médicament antimicrobien, alors qu'initialement le médicament ralentissait efficacement la croissance ou même tuait le micro-organisme cible. Traiter la tuberculose ou d'autres microbes pathogènes avec plus d'un antibiotique réduit les chances que le microbe s'adapte et survive au traitement, surtout si les deux médicaments ont des méthodes différentes pour réduire les fonctions normales du microbe.


L'IA prédit des combinaisons de médicaments efficaces pour lutter plus rapidement contre des maladies complexes

Trouver de nouvelles façons de réutiliser ou de combiner des médicaments existants s'est avéré être un outil puissant pour traiter des maladies complexes. Les médicaments utilisés pour traiter un type de cancer, par exemple, ont efficacement renforcé les traitements pour d'autres cellules cancéreuses. Les tumeurs malignes complexes nécessitent souvent une combinaison de médicaments, ou « cocktails de médicaments », pour formuler une attaque concertée sur plusieurs types de cellules. Les cocktails médicamenteux peuvent non seulement aider à éviter la résistance aux médicaments, mais aussi minimiser les effets secondaires nocifs.

Mais trouver une combinaison efficace de médicaments existants à la bonne dose est extrêmement difficile, en partie parce qu'il existe des possibilités presque infinies.

Aujourd'hui, Facebook AI et le Helmholtz Zentrum München introduisent une nouvelle méthode qui contribuera à accélérer la découverte de nouvelles combinaisons de médicaments efficaces. Nous avons construit le premier modèle d'IA unique qui prédit les effets des combinaisons de médicaments, des dosages, du calendrier et même d'autres types d'interventions, telles que la suppression ou la suppression de gènes. Nous mettons en libre accès ce modèle, appelé Compositional Perturbation Autoencoder (CPA), comprenant une API et un package Python faciles à utiliser. Nous avons détaillé le travail dans un article désormais disponible pour la communauté des chercheurs sous forme de pré-impression sur bioRxiv. Le travail sera également soumis à une revue à comité de lecture.

Jusqu'à présent, les méthodes de calcul pour explorer de nouvelles combinaisons se sont limitées aux interactions médicamenteuses incluses dans l'ensemble de données d'apprentissage et se décomposent lors de la gestion de changements au niveau moléculaire de grande dimension, tels que des doses et un calendrier différents. Le CPA utilise une nouvelle technique d'auto-surveillance pour observer les cellules traitées avec un nombre fini de combinaisons de médicaments et prédit l'effet de combinaisons invisibles. Pour un exemple simplifié, disons que les données contiennent des informations sur la façon dont les médicaments affectent différents types de cellules A, B, C et A+B. Maintenant, le modèle peut apprendre l'impact individuel de chaque médicament d'une manière spécifique au type cellulaire (c'est-à-dire sur différents types de cellules), puis les recombiner afin d'extrapoler des combinaisons de A+C, B+C, ou même comment A+ B interagit avec C+D.

Les chercheurs pharmaceutiques peuvent utiliser le CPA pour générer des hypothèses, guider leur processus de conception expérimentale et aider à affiner des milliards de choix pour mener des expériences en laboratoire. Par exemple, auparavant, il fallait généralement des années et de nombreuses expériences sur des lignées cellulaires pour tester différentes combinaisons de 100 médicaments et doses. hypothèses de validation et de suivi. Plus généralement, ce travail fait progresser l'IA qui peut faire un raisonnement compositionnel, ce qui a des implications au-delà de la biomédecine et pourrait conduire à une IA qui peut mieux comprendre, par exemple, le langage. Le raisonnement compositionnel donne un sens au langage et fait des représentations d'idées nuancées sur le monde.

Apprendre des milliards d'interactions médicamenteuses avec l'auto-surveillance

En biologie, le séquençage de l'ARN unicellulaire a évolué rapidement ces dernières années, produisant de vastes quantités de données avec plus de granularité que jamais auparavant. Les chercheurs et les scientifiques utilisent aujourd'hui le séquençage d'ARN monocellulaire comme moyen de mesurer les expressions des gènes d'ARN de cellules individuelles au niveau moléculaire et d'étudier les effets de diverses perturbations, telles que des combinaisons de médicaments ou la suppression de gènes, sur les systèmes biologiques. Des chercheurs universitaires et des scientifiques ont construit et publié des ensembles de données de séquençage d'ARN unicellulaires publics - composés de milliers à des millions de cellules avec jusqu'à 20 000 lectures par cellule - pour faciliter la recherche biomédicale.

De telles données de grande dimension fournissent un banc d'essai solide pour l'apprentissage automatique (ML) afin de repousser les limites des prédictions combinatoires. Jusqu'à présent, il n'y a pas eu d'approche efficace pour prédire les effets de combinaisons de médicaments invisibles et d'autres perturbations. Faire des prédictions à partir de ce type de données est difficile car les modèles d'IA doivent apprendre à généraliser, voire extrapoler, des aspects intéressants de la structure des données - sans s'appuyer sur des données d'entraînement étiquetées - pour faire des prédictions sur de nouvelles conditions.

Pour résoudre ce problème, nous avons utilisé une technique d'apprentissage auto-supervisée appelée auto-encodage, dans laquelle nous « compressons » et « décompressons » les données, forçant la machine à résumer essentiellement les données en modèles utiles pour la prédiction. Dans notre cas, l'auto-encodeur apprend à partir de vecteurs d'expression génique non marqués de différentes conditions.

Notre modèle fonctionne en séparant et en apprenant d'abord les attributs clés d'une cellule, tels que les effets d'un certain médicament, combinaison, dosage, temps, suppression de gène ou type de cellule. Ensuite, il recombine indépendamment les attributs pour prédire leurs effets sur les expressions des gènes de la cellule. Par analogie, une façon de réfléchir au fonctionnement de l'APC est d'imaginer les différents attributs cellulaires, tels que les effets des médicaments, les combinaisons, le dosage et le moment, comme des vêtements qui composent une « tenue » que la cellule porte, comme des chapeaux. , foulards, lunettes et bonnets. Lors de la formation, le CPA voit la cellule habillée, enlève des articles de ses vêtements et répare la cellule pour en savoir plus sur tous les vêtements et la cellule sous-jacente. Lors des tests, le CPA peut alors prédire les meilleures tenues (ou les effets optimaux des combinaisons) - à quoi ressemblerait un chapeau avec une écharpe particulière, par exemple.

Tout d'abord, un réseau de codeurs transforme l'expression génique associée à une cellule de l'ensemble de données en une « représentation cellulaire ». Un réseau d'intégration traduit le traitement appliqué à cette cellule en une « représentation de traitement ». En tandem, un réseau discriminateur garantit que les représentations des cellules et des traitements ne contiennent pas d'informations les unes sur les autres.

Deuxièmement, nous construisons une « représentation du goulot d'étranglement » en combinant les représentations de la cellule et du traitement.

Troisièmement, un réseau de décodeurs traduit la représentation du goulot d'étranglement en un vecteur d'expression génique. L'ensemble du modèle est entraîné de telle sorte que la sortie du décodeur corresponde à l'expression génique initialement disponible dans l'ensemble de données.

À l'étape 1 du processus d'apprentissage précédent, nous estimons comment annuler l'effet d'un traitement d'une cellule, et aux étapes 2 et 3, nous estimons comment réappliquer ce même traitement à la même cellule). Bien que les traitements annulés et appliqués soient les mêmes pendant la formation, nous intervenons dans ce processus et utilisons notre modèle CPA pour répondre à des questions contrefactuelles, telles que «Quelle aurait été l'expression génique de cette cellule, si elle avait été traitée avec le traitement B au lieu de traitement A ?

Pour répondre à ces questions, nous annulons le traitement A à l'étape 1 et appliquons le traitement B aux étapes 2 et 3.

Le CPA n'est pas dépendant ou limité au séquençage d'ARN monocellulaire seul. Il peut également être facilement appliqué dans les données RNAseq en vrac plus traditionnelles, par exemple, et facilement étendu aux lectures génomiques multimodales.

Réaliser des prédictions fiables de nouvelles combinaisons de médicaments

Pour tester le CPA, nous l'avons appliqué sur cinq ensembles de données de séquences d'ARN accessibles au public qui contiennent des mesures et des résultats de divers médicaments, doses et autres perturbations sur les cellules cancéreuses. Nous avons divisé chaque ensemble de données en apprentissage, test et hors distribution (OOD). Nous avons mesuré les performances de notre modèle en termes de métrique R2, qui représente la précision avec laquelle nous prédisons l'expression de gènes individuels.

Sur tous les ensembles de données, les scores R2 sont restés cohérents entre la formation et les tests, et les métriques R2 pour OOD étaient également élevées. Cela signifie que les prédictions de l'ACP concernant les effets des combinaisons et des doses de médicaments clés sur les cellules cancéreuses correspondaient de manière fiable à celles trouvées dans l'ensemble de données de test. Pour tester davantage les limites du modèle, nous avons réduit la quantité de données d'entraînement et augmenté la quantité de données OOD. Bien que les performances aient considérablement chuté, les prédictions étaient toujours nettement supérieures au hasard. Le modèle n'est pas destiné à être utilisé dans des scénarios aussi extrêmes, bien qu'il soit intéressant de comprendre ses capacités d'apprentissage.


Rapport de recherche sur la marijuana Comment la marijuana produit-elle ses effets ?

La structure chimique du THC est similaire à la substance chimique du cerveau anandamide. La similarité de structure permet au corps de reconnaître le THC et de modifier la communication cérébrale normale.

Cannabinoïdes endogènes tels que l'anandamide (voir figure) fonctionnent comme neurotransmetteurs car ils envoient des messages chimiques entre les cellules nerveuses (neurones) dans tout le système nerveux. Ils affectent les zones du cerveau qui influencent le plaisir, la mémoire, la pensée, la concentration, le mouvement, la coordination et la perception sensorielle et temporelle. En raison de cette similitude, le THC est capable de se fixer à des molécules appelées récepteurs cannabinoïdes sur les neurones de ces zones cérébrales et les activent, perturbant diverses fonctions mentales et physiques et provoquant les effets décrits précédemment. Le réseau de communication neuronale qui utilise ces neurotransmetteurs cannabinoïdes, connus sous le nom de système endocannabinoïde, joue un rôle essentiel dans le fonctionnement normal du système nerveux, donc interférer avec celui-ci peut avoir des effets profonds.

Par exemple, le THC est capable de modifier le fonctionnement de l'hippocampe (voir « La marijuana, la mémoire et l'hippocampe ») et du cortex orbitofrontal, des zones cérébrales qui permettent à une personne de former de nouveaux souvenirs et de déplacer son attention. En conséquence, la consommation de marijuana provoque une altération de la pensée et interfère avec la capacité d'une personne à apprendre et à effectuer des tâches compliquées. Le THC perturbe également le fonctionnement du cervelet et des noyaux gris centraux, des zones cérébrales qui régulent l'équilibre, la posture, la coordination et le temps de réaction. C'est la raison pour laquelle les personnes qui ont consommé de la marijuana peuvent ne pas être en mesure de conduire en toute sécurité (voir « La consommation de marijuana affecte-t-elle la conduite ? ») et peuvent avoir des problèmes pour faire du sport ou se livrer à d'autres activités physiques.

Le THC, agissant via les récepteurs cannabinoïdes, active également le système de récompense du cerveau, qui comprend des régions qui régissent la réponse à des comportements sains et agréables tels que le sexe et l'alimentation. Comme la plupart des autres drogues dont les gens abusent, le THC stimule les neurones du système de récompense pour libérer le produit chimique de signalisation. dopamine à des niveaux supérieurs à ceux généralement observés en réponse à des stimuli naturels gratifiants. La poussée de dopamine « apprend » au cerveau à répéter le comportement gratifiant, ce qui explique les propriétés addictives de la marijuana.


Bien que la plupart des DMARD conventionnels aient des effets indésirables similaires, il existe plusieurs effets indésirables propres à chaque agent.

L'hydroxychloroquine est unique à cet égard car elle présente le meilleur profil d'innocuité parmi tous les DMARD conventionnels. Par rapport à d'autres DMARD conventionnels, l'hydroxychloroquine n'augmente pas le risque d'infections graves, ni ne provoque d'hépatotoxicité ou de dysfonctionnement rénal. Les effets indésirables courants de l'hydroxychloroquine comprennent les éruptions cutanées et la diarrhée. Un effet indésirable rare mais significatif de l'hydroxychloroquine est la rétinopathie/maculopathie qui est observée avec une dose cumulée plus élevée. Les facteurs de risque de maculopathie à l'hydroxychloroquine comprennent une dose supérieure à 5 mg/kg/jour, plus de 5 ans de traitement, l'âge avancé et une maladie rénale chronique. Il est recommandé aux patients sous hydroxychloroquine de subir une évaluation ophtalmologique régulière avec une tomographie par cohérence oculaire qui est un test très sensible pour la maculopathie et peut la diagnostiquer bien avant que des anomalies du champ visuel ne surviennent. D'autres effets indésirables rares de l'hydroxychloroquine comprennent l'anémie, la leucopénie, la myopathie et la cardiomyopathie.

Le méthotrexate, le léflunomide et la sulfasalazine sont similaires dans leur profil d'effets indésirables. Une détresse gastro-intestinale (nausées, douleurs abdominales, diarrhée), une éruption cutanée/réaction allergique, une aplasie médullaire, une hépatotoxicité et une incidence plus élevée d'infections courantes et parfois graves sont des effets indésirables courants de tous ces agents. Le méthotrexate et le léflunomide peuvent tous deux provoquer une alopécie. D'autres effets indésirables propres au méthotrexate comprennent une maladie pulmonaire interstitielle, une carence en acide folique et une cirrhose du foie. Le léflunomide peut provoquer une hypertension, une neuropathie périphérique et une perte de poids. La sulfasalazine présente un risque très élevé de troubles gastro-intestinaux. Il peut aussi rarement causer le syndrome DRESS.[6]

L'effet indésirable le plus préoccupant de tous les ARMM biologiques est le risque accru d'infections courantes et graves, notamment les infections bactériennes, fongiques et virales. Une réactivation de la tuberculose, du zona et de l'hépatite B/C peut également se produire. Rarement, une aplasie médullaire et une hépatotoxicité ont été rapportées avec les DMARD biologiques. Les agents anti-TNF peuvent aggraver l'insuffisance cardiaque congestive sévère, le lupus d'origine médicamenteuse et les maladies démyélinisantes du système nerveux central (SNC). Les lymphomes et les cancers de la peau autres que le mélanome peuvent également être associés aux agents anti-TNF. L'hyperlipidémie, l'élévation du test de la fonction hépatique et la pancytopénie peuvent être causés par les inhibiteurs de l'IL-6 et de la JAK. Une aggravation de la maladie obstructive chronique des voies respiratoires a été signalée comme secondaire à l'abatacept. Les inhibiteurs de l'IL-17 peuvent provoquer/aggraver une maladie intestinale inflammatoire. Une leucoencéphalopathie multifocale progressive a été rapportée chez des patients traités par rituximab. 

Plusieurs médicaments tels que les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), les inhibiteurs de la pompe à protons, la sulfasalazine, l'amoxicilline peuvent interférer avec l'excrétion rénale du méthotrexate, augmentant ainsi son efficacité et augmentant également le risque d'effets indésirables.

Bien que la combinaison d'un DMARD biologique avec un DMARD conventionnel et l'utilisation de plusieurs DMARD conventionnels soient considérées comme sûres, il n'est pas recommandé d'utiliser une combinaison de différents DMARD biologiques en raison d'un risque accru d'immunosuppression sévère entraînant une grave et potentiellement mortelle infections.


TRANSITION VERS LA DÉPENDANCE

Comme nous l'avons vu, le plaisir dérivé de l'activation des opioïdes du système de récompense naturel du cerveau favorise la consommation continue de drogues pendant les premiers stades de la dépendance aux opioïdes. Par la suite, l'exposition répétée aux médicaments opioïdes induit les mécanismes cérébraux de la dépendance, ce qui conduit à une consommation quotidienne de drogue pour éviter les symptômes désagréables du sevrage médicamenteux. Une utilisation plus prolongée produit des changements plus durables dans le cerveau qui peuvent sous-tendre le comportement compulsif de recherche de drogue et les conséquences néfastes associées qui sont les caractéristiques de la dépendance. Des recherches scientifiques récentes ont généré plusieurs modèles pour expliquer comment la consommation habituelle de drogues produit des changements dans le cerveau qui peuvent conduire à la toxicomanie. En réalité, le processus d'addiction implique probablement des composants de chacun de ces modèles, ainsi que d'autres caractéristiques.

Définitions des termes clés

dopamine (DA): Neurotransmetteur présent dans les régions du cerveau qui régulent le mouvement, les émotions, la motivation et la sensation de plaisir.

GABA (acide gamma-amino butyrique) : Neurotransmetteur dans le cerveau dont la fonction principale est d'inhiber l'activation des neurones.

locus ceruleus (LC) : Région du cerveau qui reçoit et traite les signaux sensoriels de toutes les zones du corps impliquées dans l'éveil et la vigilance.

noradrénaline (NA): Un neurotransmetteur produit dans le cerveau et le système nerveux périphérique impliqué dans l'éveil et la régulation de la pression artérielle, du sommeil et de l'humeur, également appelé norépinéphrine.

noyau accumbens (NAc) : Une structure dans le cerveau antérieur qui joue un rôle important dans la libération de dopamine et l'action stimulante, l'un des principaux centres de plaisir du cerveau.

cortex préfrontal (CFP) : La partie la plus avant du cerveau impliquée dans les fonctions cognitives supérieures, y compris la prévoyance et la planification.

aire tegmentale ventrale (ATV) : Le groupe de neurones contenant de la dopamine qui constituent un élément clé du système de récompense du cerveau, les cibles clés de ces neurones comprennent le noyau accumbens et le cortex préfrontal.

Le modèle “ à point de consigne modifié”

Le modèle de toxicomanie à point de consigne modifié comporte plusieurs variantes basées sur la neurobiologie altérée des neurones DA dans le VTA et des neurones NA du LC pendant les premières phases de sevrage et d'abstinence. L'idée de base est que l'abus de drogues modifie un cadre ou une ligne de base biologique ou physiologique. Une variante, par Koob et LeMoal (2001), est basée sur l'idée que les neurones des voies de récompense mésolimbiques sont naturellement capables de libérer suffisamment de DA dans le NAc pour produire un niveau de plaisir normal. Koob et LeMoal suggèrent que les opioïdes provoquent une dépendance en initiant un cercle vicieux consistant à modifier ce point de consigne de telle sorte que la libération de DA est réduite lorsque des activités normalement agréables se produisent et que les opioïdes ne sont pas présents. De même, un changement de point de consigne se produit dans le LC, mais dans la direction opposée, de sorte que la libération de NA est augmentée pendant le retrait, comme décrit ci-dessus. Dans ce modèle, les aspects positifs (aimer la drogue) et négatifs (sevrage de la drogue) de la toxicomanie sont pris en compte.

Une manière spécifique dont les neurones DA peuvent devenir dysfonctionnels est liée à une altération de leurs niveaux d'activité électrique de base (“resting”) et de la libération de DA (Grace, 2000). Dans cette deuxième variante du modèle de point de consigne modifié, ce niveau de repos est le résultat de deux facteurs qui influencent la quantité de libération de DA au repos dans le NAc : (𠇏reins”) qui arrêtent la libération supplémentaire lorsque les concentrations de DA deviennent excessives. L'activation des récepteurs opioïdes par l'héroïne et les médicaments apparentés contourne initialement ces freins et conduit à une libération importante de DA dans le NAc. Cependant, avec la consommation répétée d'héroïne, le cerveau réagit à ces grandes libérations successives de DA en augmentant le nombre et la force des freins sur les neurones VTA DA. Finalement, ces autorécepteurs de freinage améliorés inhibent la libération de DA au repos des neurones. Lorsque cela se produit, le toxicomane dépendant prendra encore plus d'héroïne pour compenser la réduction de la libération normale de DA au repos. Lorsqu'il arrête de consommer de l'héroïne, il en résulte un état de privation d'AD, se manifestant par une dysphorie (douleur, agitation, malaise) et d'autres symptômes de sevrage, pouvant conduire à un cycle de rechute vers la consommation de drogue.

Une troisième variation sur le changement de point de consigne met l'accent sur la sensibilité aux signaux environnementaux qui conduisent au désir ou à l'envie de drogue plutôt qu'au simple renforcement et au sevrage (Breiter et al., 1997 Robinson et Berridge, 2000). Pendant les périodes où la drogue n'est pas disponible pour les toxicomanes, leur cerveau peut se souvenir de la drogue, et le désir ou l'envie de drogue peut être un facteur majeur conduisant à une rechute de la consommation de drogue. Cette envie peut représenter une activité accrue des neurotransmetteurs excitateurs corticaux (glutamate), qui pilotent l'activité au repos des neurones VTA contenant DA, comme mentionné, et pilotent également les neurones LC NA. Au fur et à mesure que l'activité du glutamate augmente, le DA sera libéré du VTA, ce qui entraînera une envie ou une envie de drogue, et le NA sera libéré du LC, entraînant une augmentation des symptômes de sevrage des opioïdes. Cette théorie suggère que ces voies cérébrales excitatrices corticales sont hyperactives dans l'addiction à l'héroïne et que réduire leur activité serait thérapeutique. Les scientifiques étudient actuellement un médicament appelé lamotrigène et des composés apparentés appelés antagonistes des acides aminés excitateurs pour voir si cette stratégie de traitement potentielle peut vraiment fonctionner.

Ainsi, plusieurs mécanismes dans les voies cérébrales LC et VTA-NAc peuvent fonctionner pendant la dépendance et la rechute. Les voies corticales excitatrices peuvent produire peu de réponse dans le VTA pendant l'état de repos, conduisant à des réductions de DA. Cependant, lorsque l'individu dépendant est exposé à des signaux qui produisent une envie irrépressible, les voies du glutamate peuvent devenir suffisamment actives pour augmenter l'AD et stimuler le désir d'un plus grand high. Cette même augmentation de l'activité du glutamate augmentera la libération de NA par le LC pour produire un état dysphorique prédisposant à la rechute et à une dépendance continue.

Modèle de déficits cognitifs

Le modèle des déficits cognitifs de la toxicomanie propose que les individus qui développent des troubles addictifs présentent des anomalies dans une zone du cerveau appelée cortex préfrontal (PFC). Le PFC est important pour la régulation du jugement, la planification et d'autres fonctions exécutives. Pour nous aider à surmonter certaines de nos impulsions de gratification immédiate en faveur d'objectifs à long terme plus importants ou finalement plus gratifiants, le PFC envoie des signaux inhibiteurs aux neurones VTA DA du système de récompense mésolimbique.

Le modèle des déficits cognitifs propose que la signalisation des PFC au système de récompense mésolimbique est compromise chez les personnes souffrant de troubles de dépendance et, par conséquent, qu'elles ont une capacité réduite à utiliser leur jugement pour restreindre leurs impulsions et sont prédisposées à des comportements compulsifs de consommation de drogue. Conformément à ce modèle, les médicaments stimulants tels que la méthamphétamine semblent endommager le circuit cérébral spécifique, la boucle frontostriatale, qui transporte les signaux inhibiteurs du PFC vers le système de récompense mésolimbique. De plus, une étude récente utilisant la spectroscopie par résonance magnétique a montré que les alcooliques chroniques ont des niveaux anormalement bas d'acide gamma-amino butyrique (GABA), le neurochimique que le PFC utilise pour signaler au système de récompense de libérer moins de DA (Behar et al., 1999). De plus, le modèle des déficits cognitifs de la toxicomanie pourrait expliquer l'observation clinique selon laquelle la dépendance à l'héroïne est plus grave chez les personnes atteintes d'un trouble de la personnalité antisociale, qui est indépendamment associée à des déficits en PFC (Raine et al., 2000).

Contrairement aux stimulants, l'héroïne endommage apparemment le PFC mais pas la boucle frontostriatale. Par conséquent, les personnes qui deviennent toxicomanes à l'héroïne peuvent subir des dommages aux PFC indépendants de leur abus d'opioïdes, hérités génétiquement ou causés par un autre facteur ou événement de leur vie. Ces dommages préexistants aux PFC prédisposent ces individus à l'impulsivité et au manque de contrôle, et les dommages supplémentaires aux PFC résultant de l'abus chronique et répété d'héroïne augmentent la gravité de ces problèmes (Kosten, 1998).


Méthodes

Souches bactériennes

Escherichia coli La souche K-12 MG1655 a été utilisée comme souche de type sauvage (WT). Lorsque nécessaire, la sélection sur kanamycine a été réalisée à 25 g mL -1 (pour la sélection post-recombinaison, voir ci-dessous) ou à 50 g mL -1 (pour la transduction P1 et la sélection plasmidique). Une concentration de 100 µg mL -1 a été utilisée pour l'ampicilline (pCP20, résolution de cassette de résistance) et la spectinomycine (pSIM19, recombineering). La sélection des plasmides de surexpression a été faite à 35 µg mL -1 de chloramphénicol.

Pour mesurer les traces temporelles de bioluminescence, pCS-?? porteur de la bactérie luxCDABE opéron piloté par le constitutif λ-PR promoteur a été transformé dans les souches d'intérêt 16 . La sélection pour le plasmide de luminescence a été utilisée lors de la préparation des stocks de glycérol (kanamycine 50 µg mL -1 ) mais a été omise lors des mesures pour éviter des interactions inconnues entre les antibiotiques utilisés. Le plasmide a été maintenu de manière stable car nous n'avons observé aucun défaut de fitness significatif dû à pCS-λ et aucune perte spontanée apparente du plasmide, comme vérifié par placage sur des plaques sélectives et non sélectives (Fig. supplémentaire 7). À cette fin, nous avons suivi la croissance de cultures bactériennes dans des flacons, secouant dans un bain-marie dans quatre conditions. Nous avons soit activement sélectionné pour le maintien du plasmide et/ou appliqué un stress antibiotique en ajoutant 2 g mL -1 de CHL, ce qui a conduit à une inhibition 50 %. Nous avons mesuré la densité optique par des méthodes standard (à l'aide du spectrophotomètre à cuve Hitachi U-5100) après chaque mesure, nous avons reconstitué 1 ml de milieu retiré avec un milieu frais et préchauffé et corrigé les mesures de densité optique en conséquence. Après avoir atteint la phase exponentielle tardive, nous avons rapidement dilué la culture en série et étalé des volumes égaux sur des plaques sélectives et non sélectives.

La plateforme de titrage du facteur de traduction a été établie dans la souche HG105 (MG1655 ΔlacIZYA) 50 . En bref, les gènes endogènes codant pour les facteurs de traduction ont d'abord été sous-clonés dans le vecteur pKD13 sous le contrôle de PLlacO−1 promoteur avec une cassette de résistance à la kanamycine flanquée de FRT (kan R ) et TrrnB terminateur en amont et en aval du gène, respectivement 13,27,36,51 . Le tandem de kan R et d'un gène avec tous les éléments régulateurs a été intégré dans le chromosome (galK locus) en utilisant la recombinaison λ-rouge (plasmide pSIM19 52). Les cassettes de résistance à la kanamycine ici et dans les étapes suivantes ont été résolues en utilisant la résolvase FLP de levure exprimée à partir de pCP20 53 . La perte de la cassette de résistance et le durcissement du plasmide pCP20 ont été vérifiés par stries sur des plaques de gélose de sélection avec des antibiotiques et par PCR de jonction (pour la résolution). Suite à la résolution de kan R , le facteur endogène a été inactivé par délétion dans le cadre : kan R a été intégré dans le locus du gène puis résolu, ce qui a laissé un peptide de 34 résidus 51 . Nous n'avons pas pu introduire kan R directement dans la souche avec PLlacO−1 conduit frr par conséquent, nous avons d'abord effectué la délétion dans une souche auxiliaire MG1655 portant le plasmide ASKA avec frr 54 [JW0167(-GFP)], qui complétait la délétion chromosomique lors de l'ajout d'IPTG. La délétion a été possible dans la souche auxiliaire, donnant MG1655 ΔFrr::kanR. Nous avons ensuite déplacé la suppression par transduction P1 généralisée 55 . Pour tufAB, nous avons P1-transduit les délétions (Δtuf::kan R ettufB::kan R ) séquentiellement à partir des souches de délétion de gènes respectives de la collection KEIO 56 . Toutes les autres suppressions ont été effectuées directement dans les souches d'intérêt en utilisant ??-red recombineering utilisant pKD13 comme matrice pour l'amplification de la cassette 51 . Dans la dernière étape, lacI entraîné par le PLlacO−1 promoteur (donnant une autorégulation négative indépendante du taux de croissance 13,36) avec le kan R flanqué de FRT a été intégré dans le intS locus et la cassette de résistance a été résolue. L'allèleintS::kan R-PLlacO−1-lacI-TrrnB a été déplacé dans les souches par transduction P1 généralisée. Toutes les modifications chromosomiques ont été validées par PCR. The factor titration platform and the repressor operon were Sanger-sequenced at the integration junctions using PCR primers or a primer binding into the kan R promoter region (which is upstream of the PLlacO−1 promoter prior the resolution). The final genotype for the strains bearing the factor titration platforms is HG105 ΔgalK::frt-PLlacO−1-X ??X::frt ΔintS::frt-PLlacO−1-lacI, où X denotes the chosen factor. These strains contained no plasmids and no antibiotic resistance cassettes but had a single copy of a translation factor under inducible control.

To generate the strain with independently regulated initiation and translocation factors, we started with a strain carrying a single infB copy driven by PLlacO−1. Then, the negatively autoregulated tetR repressor was integrated into the chromosome, followed by FLP resolvase-mediated resolution of the selection marker. This enabled the integration of PLtetO-1-driven fusA dans le intS locus the resolution was followed by the disruption of the endogenous copy of fusA. Furthermore, we introduced a negatively autoregulated lacI dans le xylB lieu. This yielded a marker-less strain with the two essential genes infB et fusA under inducible, negatively autoregulated, and independent control. The final genotype is: HG105 ΔgalK::frt-PLlacO−1-infB ??infB::frt ΔycaCD::frt-PLtetO−1-tetR ??intS::frt-PLtetO−1-fusA ??fusA::frt ΔxylB::frt-PLlacO−1-lacI. Oligonucleotide sequences, targeted template, restrictions sites (when used), and a brief description of use are listed in Supplementary Data 1. All DNA modifying enzymes and Q5 polymerase used in PCR were from New England Biolabs.

We constructed overexpression strains by transforming HG105 with pCS-λ and plasmids from the ASKA library 54 and its derivatives. We used ASKA plasmids in which GFP has been excised from the reading frame we had to repeat the excision of GFP from the infB-bearing plasmid by NotI digestion and subsequent ligation as per ref. 54 . All plasmids were Sanger-sequenced. For controls we used (i) plasmid pAA31 (gift from A. Angermayr), in which the open reading frame is cleanly deleted, as transcription-only control, and (ii) the ASKA plasmid bearing lacZ as a neutral protein overexpression control. We note that the overexpression of proteins leads to growth inhibition 13,57 hence, we actively selected for plasmid maintenance by adding 35 μg mL −1 of chloramphenicol into the growth medium.

Growth rate assay and two-dimensional concentration matrices

Rich lysogeny broth (LB) medium, which at 37 °C supports a growth rate of 2.0 ± 0.1 h −1 , was used. LB medium was prepared from Sigma Aldrich LB broth powder (L3022), pH-adjusted to 7.0 by adding NaOH or HCl, and autoclaved. Antibiotic stock solutions were prepared from powder stocks (for catalog numbers, see Supplementary Table 1), dissolved either in ethanol (CHL, ERM, and TET), DMSO (LAM and TMP) or water (KAN, CRY, LCY, KSG, FUS, and STR), 0.22 μm filter-sterilized and kept at −20 °C in the dark until used. Antibiotics were purchased from Sigma Aldrich or AvaChem. Some of the antibiotics (e.g., ERM, FUS, and LCY) are not used in the clinic against certain Gram-negative bacteria due to generally poor efficacy however, at higher concentrations (yet still well below the solubility limit) inhibition of growth is observed.

A previously established growth-rate assay based on photon counting was used to precisely quantify the absolute growth rates for 5–9 generations 16 . Cultures were grown in 150 μL of media in opaque white 96-well microtiter plates (Nunc 236105), which were tightly sealed by transparent adhesive foils (Perkin-Elmer 6050185 TopSeal-A PLUS) to prevent contamination and evaporation. We prepared glycerol stocks of WT and factor-titration platform strains from saturated overnight cultures. We inoculated the cultures with

10 2 cells per well (1:10 6 dilution) from either thawed glycerol stocks (for the drug interaction network) or from liquid cultures in which we first incubated the bacteria containing the factor titration-platform for 1 h in the absence of IPTG (inoculated by 1:2000 dilution of the glycerol stock) to partially dilute out the remaining factor molecules before additional 1:1000 dilution into measurement plates. Between 10 and 20 plates were cycled through a plate reader using a stacking system (Tecan M1000, controlled by Tecan i-control software, v1.10.4). We built a custom incubator box around the stacker towers to facilitate ventilation and fix the temperature to 37 °C (Supplementary Fig. 7). This incubator was designed and troubleshot by B.K. and Andreas Angermayr (IST Austria and University of Cologne) and built by IST Miba Machine Shop. Each plate was read every 20–40 min and was shaken (orbital 10 s, 582 rpm) immediately before reading (settle time 10 ms, integration time 1 s). Plates were manually pipetted and concentration gradients of antibiotics and inducers (IPTG, aTc) were prepared by serial dilution (0.70-fold).

Growth rates were determined as a best-fit slope of a linear function fitted to the (mathrm,) -transformed photon counts per second. The fitting procedure and examples of growth curves are shown in Supplementary Fig. 1. In rare cases of occurrence of mutants (as evidenced by sudden growth) we manually removed the measurement (only in the case of tufA titration). We verified that the luminescence-based technique leads to the same results as a classical optical density-based one (Supplementary Fig. 7).

Normalization of dose–response surfaces

All growth rates were normalized relative to the average growth rate in the drug-free medium [for factor-titration strains at the highest inducer concentration (5 mM)]. Small differences between individual dose–response curves were inevitable due to known challenges of preparing identical concentrations gradients on different days. To correct for such day-to-day variability, we rescaled the concentration units to the IC50 for each drug. Le CI50 was obtained from fitting the Hill function (y(x)=1/left[1+>>_<50> ight)>^ ight]) to the individual dose–response curves. The dose–response curve of each drug was measured seven times and averaged. Le CI50 and corresponding errors reported in Table 1 are extracted from such average dose–response curves (Supplementary Fig. 1g). Induction curves were normalized slightly differently, using a shifted and increasing Hill function in the form (g(b)=[(b+_<0>)/<< m>>_<50>]^/left<1+_<0>)/<< m>>_<50> ight]>^ ight>) , where b0 is a concentration offset. The latter parameter was required as the complete cessation of growth was not achievable in some cases even in the absence of inducer as the promoter PLlacO−1 is leaky. Inducer concentrations were thus rescaled via b → (b + b0)/IC50.

Smoothing of dose–response surfaces

To reduce noise when plotting response surfaces, we smoothed the data using a custom Mathematica script that implements locally weighted regression (LOESS) 58 . This approach only smoothed the contours and did not alter the character of dose–response surfaces. Smoothing was only used for plotting and not for the analysis in which only interpolation between adjacent points was used (Mathematica function Interpolation).

Statistics and reproducibility

We measured the dose–response surfaces for all 28 drug interactions in duplicate. As the dose–response surface was measured over a 12 × 16 grid, the duplicates swap the drug axes (12 × 16 → 16 × 12 across two 96-well plates) on different days to check for effects coming from spreading the measurements over different plates. The experimental and analysis procedure led to reproducible measurements of growth rates between days (Supplementary Fig. 1, ?? ≈ 0.86). For the double factor titration experiment, the inducer gradients were set up across 6 plates to form a 24 × 24 grid. Each response surface is thus based on multiple measurements and the impact of individual points is assessed by bootstrapping. In total, we measured over 20,000 growth curves. We automatized the collection and analysis of the data to allow for unbiased interpretation of the data.

We characterized the type of drug interaction by calculation of the Loewe interaction score [Supplementary Equation (1)]. The effects of bottlenecks on the efficacy of antibiotics were quantified by calculating the bottleneck dependency score [Supplementary Equation (2)]. To classify the interactions between antibiotics and antibiotic-bottleneck pairs, we estimated the null distributions by bootstrapping (Supplementary Information).

We assessed the accuracy of our predictions by “isobole sliding,” which measures the average deviation of measured isoboles from predicted ones (Supplementary Information). We performed bootstrapping to statistically determine the significances of predictions.

A biophysical model for a pair of antibiotics

We constructed a minimal mathematical model describing the combined antibiotic action based on growth laws 13 and kinetics of antibiotic transport and binding 14 . The corresponding system of coupled ordinary differential equations (ODEs) and additional analysis are specified in the Supplementary Information. Differential equations describe the time-evolution of unbound, individually-bound and double-bound ribosomes, as well as the intracellular concentrations of antibiotics. Growth laws convert the concentration of unbound ribosomes into the growth rate, which determines the total abundance of ribosomes 13,14 . Steady-state solutions were found numerically. A more detailed analysis of model extensions is reported in ref. 23 .

TASEP model of translation

We developed a mean-field mathematical model of factor-mediated translation which recovers the suppression between inhibitions of initiation and translocation. We took into account that ribosomes can perform a specific step only when bound by a corresponding translation factor. The mathematical framework is detailed in Supplementary Methods followed by a Supplementary Discussion of the effect of mRNA growth-rate dependence, rescue mechanisms, and inefficiency of a direct response to translocation inhibition.

Materials availability

Strains described in this study can be obtained from the corresponding author upon reasonable request.

Reporting summary

Further information on research design is available in the Nature Research Reporting Summary linked to this article.


Renseignements à l'appui

S1 Fig. Effect of antibiotics on virulence factor production in P. aeruginosa PAO1 populations.

We exposed PAO1 to all four antibiotics in two the experimental media: CAA+Tf (iron-limited CAA with transferrin) and CAS. After 48 hours of exposure, we measured virulence factor production: pyoverdine in CAA+Tf and proteases in CAS. The inhibition of virulence factors followed the same pattern as for growth inhibition, except for ciprofloxacin and meropenem, where pyoverdine production slightly increased at intermediate antibiotic concentrations and only dropped at higher antibiotic levels. Dots show means ± standard error across six replicates. All data are scaled relative to the drug-free treatment. Data stem from the same two independent experiments as shown in Fig 1. The red dots indicate the highest concentration used for each experiment, from which 7 serial dilution steps were tested. Curves were fitted with log-logistic functions. The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. CAA, casamino acid medium CAS, casein medium Tf, human apo-transferrin.

S2 Fig. Statistical significance maps for antibiotic-antivirulence drug interactions.

For each drug concentration combination, we tested whether the degree of synergy is significantly different from zero (i.e., independent drug interaction). Heatmaps depict p-values ranging from white (no significant drug interaction) to blue (significant antagonism) to red (significant synergy). p-Values are shown for gallium-antibiotic combinations (UN D for growth E-H for pyoverdine production) and furanone-antibiotic combinations (I-L for growth M-P for protease production). To account for multiple comparisons, we corrected the p-values for each drug combination using the “false discovery rate” method. The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364.

S3 Fig. Assessing the relationship between the degrees of synergy for growth and virulence factor inhibition.

We found that the degrees of synergy for the two measured traits across the 9×9 antibiotic-antivirulence combination matrix correlated in 6 out of 8 cases (Pearson correlation coefficient: ciprofloxacin-gallium: r = 0.09, t79 = 0.85, p = 0.394 colistin-gallium: r = 0.69, t79 = 8.51, p < 0.001 meropenem-gallium: r = 0.17, t79 = 1.52, p = 0.130 tobramycin-gallium: r = 0.58, t79 = 6.39, p < 0.001 ciprofloxacin-furanone: r = 0.34, t79 = 3.22, p = 0.002 colistin-furanone: r = 0.96, t79 = 32.50, p < 0.001 meropenem-furanone: r = 0.87, t79 = 15.48, p < 0.001 tobramycin-furanone: r = 0.75, t79 = 10.16, p < 0,001). Solid lines show association trend lines between the two levels of interactions. The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364.

S4 Fig. Clones evolved under antibiotic treatments show altered dose-response curves.

To confirm that the evolved clones are resistant to the antibiotic in the two experimental media (iron-limited [CAA+Tf] and CAS media), we measured for each antibiotic the dose-response curves for the ancestral WT and one randomly selected clone either in CAA+Tf or CAS. For each antibiotic and medium, we tested 11 concentrations within these ranges: ciprofloxacin: 0–1 μg/mL (CAA+Tf), 0–4 μg/mL (CAS) colistin: 0–1.2 μg/mL (CAA+Tf), 0–3.33 μg/mL (CAS) meropenem: 0–1.6 μg/mL (CAA+Tf), 0–7 μg/mL (CAS) tobramycin: 0–2.4 μg/mL (CAA+Tf), 0–24 μg/mL (CAS). All evolved clones showed an attenuated dose-response curve, were able to grow at higher drug concentrations than the ancestral WT and had significantly higher IC50 valeurs. Measurements of OD600 were taken after 48 hours incubation time at 37°C under static conditions. Growth values are scaled relative to the untreated control for each strain. Data are shown as means ± standard errors across four replicates. Curves were fitted with four parameters log-logistic functions. In the lower left corner of each panel we show the mean IC50 values of the WT and AtbR clones ± standard errors (μg/mL) and the respective statistical analysis comparing the ratio of the means. The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. AtbR clones, antibiotic resistant clones CAA, casamino acid medium CAS, casein medium IC50, half maximal inhibitory concentration OD600, optical density at 600 nm Tf, human apo-transferrin WT, wild-type.

S5 Fig. Antivirulence dose-response curves for AtbR clones of P. aeruginosa PAO1.

To check whether resistance to antibiotics influenced the susceptibility to antivirulence compounds, we exposed our selected AtbR clones to a range of concentrations of both gallium (0–50 μM) and furanone (0–390 μM). Under gallium treatment, only the colistin resistant clone showed increased sensitivity to the antivirulence drug. Under furanone treatment, the clones resistant to ciprofloxacin and colistin showed a certain level of cross-resistance to this antivirulence compound, while we found collateral sensitivity between tobramycin and furanone. All values are scaled relative to the untreated control for each strain, and data points show the mean across four replicates. We used either log-logistic functions (in CAA+Tf) or three-parameter Weibull functions (in CAS) to fit the curves and extract mean IC50 values ± standard error, which are reported in the left bottom corner of each panel together with the respective statistical analysis comparing the ratio of the means. The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. AtbR clones, antibiotic resistant clones CAA, casamino acid medium CAS, casein medium IC50, half maximal inhibitory concentration OD600, optical density at 600 nm Tf, human apo-transferrin WT, wild-type.

S6 Fig. Testing for correlations between the degree of synergy for growth inhibition and the outcome of competitions.

We tested whether the degree of synergy for growth inhibition is a predictor of the competition outcome between the AtbR clones and the susceptible WT under combination treatment. We compared the degrees of synergy of each drug combination for the AtbR clones (UNE) or the WT (B) to their relative fitness values in competition. Positive or negative y-values indicate that the clones increased or decreased in frequency during the competition, respectively. Positive or negative values on the x-axis indicate synergy or antagonism, respectively. There were no significant associations between the relative fitness and the degree of synergy for growth inhibition neither for the AtbR clones nor for the WT (ANOVA, for AtbR: F1,65 = 0.88, p = 0.353 for WT: F1,65 = 1.85, p = 0.179). Instead, relative fitness was significantly affected by the type of antivirulence drug (ANOVA, for AtbR clones: F1,65 = 106.36, p < 0.001 for WT: F1,65 = 44.58, p < 0.001) and the specific antibiotic-antivirulence combination applied (ANOVA, for AtbR clones: F3,65 = 37.45, p < 0.001 for WT: F3,65 = 14.50, p < 0,001). The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. AtbR clones, antibiotic resistant clones WT, wild-type.

S7 Fig. Validation of mCherry fluorescence as a proxy for growth measurements.

The CAS media has a very high turbidity due to the poor solubility of casein, which interferes with OD600, which is typically used as a measure of growth. We therefore used mCherry fluorescence, constitutively expressed from a single-copy chromosomal insertion, as a proxy for bacterial growth in CAS. To validate this method, we grew PAO1-mCherry (able to digest CAS) and PAO1 ΔlasR-mCherry (unable to digest CAS) in CAS medium for 48 hours at 37°C in a Tecan plate reader tracking OD600 and mCherry fluorescence every 15 minutes. (UNE) Blank corrected OD600 trajectories for PAO1-mCherry and PAO1 ΔlasR-mCherry. PAO1 ΔlasR-mCherry grew poorly but showed a standard sigmoid growth pattern by digesting the supplemented CAA. In stark contrast, the OD600 of PAO1-mCherry first increased sharply, then declined dramatically, followed by a slow linear increase over time. This trajectory is explained by the simultaneous growth of bacteria (increasing OD600) and clearance of the turbidity due to protein digestion (decreasing OD600), thus demonstrating that OD600 is an unsuitable measure for growth. (B) Blank corrected mCherry trajectories for PAO1-mCherry and PAO1 ΔlasR-mCherry. As for OD600, PAO1 ΔlasR-mCherry grew only poorly (according to the mCherry signal) and only within the first 7 hours of the assay, digesting the supplemented CAA. Unlike for OD600, the mCherry signal yielded a much more sensible growth trajectory for PAO1-mCherry, characterized by an initial increase (CAA consumption), followed by a lag phase (protease secretion and switch to CAS) and growth resumption (CAS digestion). (C) To further validate that mCherry fluorescence is a good proxy for growth in CAS media, we compared the endpoint measurements of mCherry fluorescence with CFU/mL values, determined by plating the cultures on LB-agar plates. All values are scaled relative to PAO1-mCherry. The two methods yielded similar results and show that the growth of PAO1ΔlasR-mCherry is approximately 25% of the one of PAO1-mCherry. Data are shown as means ± standard errors across eight replicates for the growth curves and eight (PAO1-mCherry) or four (PAO1ΔlasR-mCherry) replicates for the CFU/mL data. The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. CAA, casamino acid medium CAS, casein medium CFU, colony forming units LB, Lysogeny broth OD600, optical density at 600 nm.

S8 Fig. Correlation between endpoint measurements and area under the growth curve (integral) for single drug treatments.

To verify that a single OD600 or mCherry measurement after growth is a good proxy for growth inhibition, we tested the correlation between the area under the growth curve (integral) and endpoint measurements, under single drug treatments in CAA+Tf (UNE) or CAS (B) media. For each antibiotic and antivirulence compound, we picked 9 concentrations that cover the entire drug active range and that were used for the combination assay, shown in Figs 3 and 4. Each concentration was tested in 5-fold replication. Cultures were grown for 48 hours in a Tecan Infinite M-200 plate reader (Tecan Group, Switzerland) and growth was recorded by reading OD600 (in CAA+Tf) or mCherry fluorescence (in CAS) every 15 minutes, after a short shaking event. Growth trajectories were established with a spline fit, and the two parameters (endpoint yield and integral) were extracted using the grofit package in RStudio. In both media, the two growth parameters showed strong linear association patterns (blue lines and R 2 values). For several drugs, growth integral measurements were more sensitive to discover growth inhibitions at low drug concentrations (light gray circles), and that is why cubic data fits (red lines and R 2 values) often explained an even higher proportion of the variance. Nonetheless, these control analyses show that endpoint growth values are reliable proxies for measuring growth inhibition under drug treatment. The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. CAA, casamino acid medium CAS, casein medium OD600, optical density at 600 nm Tf, human apo-transferrin.

S9 Fig. Fluorescence correction for mCherry and pyoverdine measurements in the presence of furanone C-30 and gallium.

The two metals bromine (in furanone C-30) and gallium interfere with the fluorescence measurements of mCherry and pyoverdine in a concentration-dependent manner. To account for this bias, we established calibration curves and used them to correct fluorescent values in all experiments. (UNE) Furanone C-30 is autofluorescent in the mCherry channel (excitation 582 nm, emission 620 nm). We quantified the autofluorescence in function of the concentration of furanone both in CAS and CAA media. Briefly, we incubated each media supplemented with a range of furanone C-30 concentrations (0–390 μM, as used in Fig 2, in 6-fold replication) for 48 hours under static conditions and then measured mCherry fluorescence. The relationship between concentration and fluorescence was explained by a four-parameter logistic function in CAS or by a three-parameter Gompertz function in CAA. In all experiments, we used this calibration curve to subtract, for each furanone concentration, the autofluorescence component from the mCherry measurements. (B) The fluorescent signal of pyoverdine becomes inflated when gallium binds to the siderophore [27,38]. We used the supplementary data from Ross-Gillespie and colleagues [27] to quantify this bias in fluorescence as a function of gallium concentration. They incubated 200 μM pyoverdine in iron-limited CAA+Tf medium, supplemented with gallium concentrations ranging from 0 to 1 mM, and measured pyoverdine-associated fluorescence. When supplemented with more than 50 μM gallium, pyoverdine showed a nearly 2-fold higher fluorescence signal. This signal bias can be explained by a five-parameter log-logistic function. In all our experiments, for each gallium concentration used, we applied correction factors derived from this fitted curve to account for this potential bias. The underlying data for this figure can be found at https://doi.org/10.6084/m9.figshare.12515364. CAA, casamino acid medium CAS, casein medium Tf, human apo-transferrin.

S10 Fig. Examples of flow cytometry scatterplots from competition experiments between the sensitive WT PAO1 and AtbR clones.

The WT strain PAO1, chromosomally tagged with a constitutively expressed GFP marker, was co-cultured with AtbR clones in a 90:10 ratio in the presence of five different drug treatments. Mono- and mixed cultures were measured with the flow cytometer at the beginning (time, 0 hours) and at the end (time, 24 hours) of the competition experiments. For data analysis, we plotted the size of the cells (forward scatter, FSC) against the GFP fluorescence to distinguish tagged from untagged cells. The shown plots depict an illustrative example, in which ciprofloxacin was used as an antibiotic. (UNE) A monoculture of the untagged AtbR clone does not show GFP fluorescence. This control allows quantifying the background fluorescence of the cells. (B) A monoculture of the tagged PAO1-GFP shows relatively strong GFP fluorescence, with 99.1% of all cells considered as GFP positive. (C) In a 90:10 volumetric mix of WT and AtbR clones, the cells of the two strains can be unambiguously distinguished and their actual ratio (88:12) can be determined. Frequencies of GFP-positive and GFP-negative cells were then quantified after a 24-hour incubation period at 37°C. () The monoculture of the untagged AtbR strain shows that cells do not increase their GFP autofluorescence over time, and 100% of cells fall into the GFP-negative gate. (E) The monoculture of PAO1-GFP shows relatively strong fluorescence also at the end of the competition, with 99.3% of cells being classified as GFP positive. (F) The mix of WT and AtbR clones, when grown in absence of any drug treatment stays at the initial frequency (88.2:11.8). (g) When the mix was grown in the presence of the antibiotic, the fraction of untagged AtbR strain increases to 23.6%, demonstrating their selective advantage. AtbR clones, antibiotic resistant clones GFP, green fluorescent proteins WT, wild-type.

Tableau S1. Statistical analyses (t test and ANOVA) performed on the data presented in Fig 6.

S2 Table. Concentrations of antibiotics and antivirulence drugs used for the combinatorial treatments and the competition assays.


Accelerating Antiretroviral Drug Development

Established in the early years of the HIV/AIDS pandemic, the NIAID-supported National Cooperative Drug Discovery Group Program for the Treatment of AIDS (NCDDG-AIDS) provided a framework for scientists from academia, industry, and government to collaborate on research related to the identification and development of new drugs. NIAID-supported researchers developed cell culture and biochemical test systems that allowed researchers to more easily screen drug candidates, and NIAID also played a key role in the development of animal models for preclinical testing.

In the early 1990s, additional NRTI drugs gained FDA approval. The development of AZT and other NRTIs showed that treating HIV was possible, and these drugs paved the way for discovery and development of new generations of antiretroviral drugs.

While the earliest antiretroviral agents were developed before many HIV diagnostics were available in the clinic, the development of laboratory tests to measure viral load and CD4+ cell count greatly accelerated progress in drug development. Viral load describes the amount of HIV in the blood. Typically, the higher the viral load, the faster the CD4+ cell count—an indicator of how well the immune system is working—will fall. These advances made it possible for researchers to use lab test results, viral load measurements in particular, to assess how well an investigational antiretroviral agent worked. This approach required drug trials to last roughly 6 months, whereas relying solely on clinical indicators, such as progression to AIDS or death, ordinarily required trials to last years before a result was available.


Doubling Down on Headache Pain: Effective Combo of Common Drugs

It’s not uncommon for people who experience a concussion to have moderate to severe headaches in the weeks after the injury. A new study has found a combination of two drugs, both common anti-nausea medications, given intravenously in the emergency room may relieve those headaches better than a placebo. The study is published in Neurology®, the medical journal of the American Academy of Neurology.

Metoclopramide is an anti-nausea medicine sometimes used to treat migraine. Diphenhydramine is a common antihistamine that when used in its injected form can treat motion sickness. Higher doses of metoclopramide given intravenously can cause restlessness, so this study combined diphenhydramine with metoclopramide to prevent those symptoms.

“The headaches you get after a trauma like a fall, an assault or car accident can linger for months or even years and lead to a reduced quality of life, so the results of our study are promising,” said study author Benjamin W. Friedman, M.D., of Albert Einstein College of Medicine, Bronx, N.Y.

The study involved 160 people who experienced a head trauma and then visited an emergency room because of a headache within 10 days. They were randomly assigned to two groups: 81 people were given 20 milligrams (mg) of metoclopramide and 25 mg of diphenhydramine intravenously. The remaining 79 people were given an injection of saline solution as a placebo.

Researchers asked people to rate the intensity of their pain on a scale of zero to 10 one hour after the medication was administered. On this scale, zero means no pain and 10 means the worst pain imaginable.

The study found that the drug combination reduced the average person’s pain level by more than five points one hour later. People in the group given the combination of metoclopramide and diphenhydramine said they improved, on average, by 5.2 points on the pain scale. People in the group given a placebo, on average, said their pain improved by 3.8 points on the pain scale.

In the group given the drug combination, 43% experienced side effects like drowsiness, restlessness, or diarrhea. In the group given the placebo, 28% of the people reported those kinds of side effects.

“More research is needed to determine the most effective dose of metoclopramide, and how long to administer it, to see if people can get longer-term relief after they leave the emergency room,” Friedman said. “Also, future work may be able to determine whether early treatment with this medication can target other disruptive symptoms you may get after a head injury, like depression, sleep disorders, and anxiety.”

A limitation of the study is that the study participants came from high poverty areas of the country, and may have had less access to care. Because successful headache treatment may be associated with access to care, these results may not apply to the general population.

Reference: “Randomized Study of Metoclopramide Plus Diphenhydramine for Acute Posttraumatic Headache” by Benjamin W. Friedman, Eddie Irizarry, Darnell Cain, Arianna Caradonna, Mia T. Minen, Clemencia Solorzano, Eleftheria Zias, David Zybert, Michael McGregor, Polly E. Bijur and E. John Gallagher, 24 March 2021, Neurologie.
DOI: 10.1212/WNL.0000000000011822

The study received support from the Harold and Muriel Block Institute for Clinical and Translational Research at Einstein and Montefiore.


The most common side effects of antidepressants are drowsiness and fatigue, gastrointestinal side effects such as nausea, sexual dysfunction, weight gain, and risk of suicide.

Drowsiness and Fatigue

Drowsiness and dizziness are more common with tricyclic antidepressants (TCAs) or monoamine oxidase inhibitors (MAOIs) than selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs). Most people become tolerant to this effect. Some antidepressants can cause insomnia.

Gastrointestinal side effects

Most people feel a bit nauseous when they first start taking an antidepressant, but this usually goes away after a few weeks. Constipation, diarrhea, and a dry mouth may also occur, usually temporarily.

Antidepressants may reduce your sex drive (libido) or your ability to obtain or keep an erection if you are a man or reach orgasm (both male and female).

Once your symptoms of depression have resolved, your appetite usually improves. This may be the reason behind weight gain with antidepressants, or it could be due to fluid retention. Some antidepressants are more likely to cause weight gain than others.

All antidepressants have been associated with an increased risk of suicidal thoughts and behaviors, particularly in children and adolescents under the age of 25 years. This is more common within the first few weeks of starting an antidepressant. You should tell your doctor if you feel like your mood has gotten worse or if you are having suicidal thoughts.

Antidepressants are used for several mood-related disorders, not only depression, usually in combination with other treatments, such as talk therapy.

They are thought to work by altering the balance of chemicals in the brain called neurotransmitters, such as serotonin, norepinephrine, and/or dopamine. While altering these chemicals relieves symptoms of depression such as low mood, irritability, feelings of worthlessness, anxiety, and difficulty in sleeping, it does mean they can cause a range of side effects.


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