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Marqueur de laboratoire pour l'étiquetage des plastiques de culture cellulaire ?


Je suis directeur de laboratoire et j'essaie de demander à d'autres biologistes de laboratoire quelle marque/marque de marqueurs leurs laboratoires utilisent pour étiqueter les plastiques de culture tissulaire, qui doivent être essuyés à plusieurs reprises avec de l'éthanol à 70 % pour maintenir la stérilité. (La plupart des marqueurs « permanents » se lavent dans de l'éthanol à 70 %.)

Je cherchais un équivalent au marqueur Sharpie Industrial Extra-Fine, qui ne semble plus être sur le marché. Le marqueur à pointe extra-fine Fisher prétendument résistant aux solvants ne laisse presque aucune trace lorsqu'il est essuyé avec de l'éthanol.

Quelqu'un a-t-il des suggestions?


C'est hardcore va apparaître comme une réponse SPAM, mais j'ai simplement fait une recherche sur Google :

Stylos de marquage de laboratoire de Ted Pella

Statmark Pen™: résistant au formol, éthanol isopropanol et xylène

Marqueur Secureline®: résistant à l'eau; autoclavable; ne convient pas en dessous de 0°C (32°F)

Secureline® II / Superfrost: résistant au xylène, éthanol, acétone et formol; température de service -15°C à 100°C (5°F à 212°F)

Vous pouvez essayer un Pack d'échantillons des 3 pour 8 $ USD pour voir lequel vous préférez.


J'utilise régulièrement de l'éthanol à 70% et/ou de l'IPA pour essuyer les plastiques écrits avec les marqueurs à pointe fine Fisherbrand et je trouve qu'ils ne s'enlèvent pas facilement même après plusieurs pulvérisations. Tant que le marqueur a eu suffisamment de temps pour sécher. Les marqueurs industriels Sharpie "résistants aux solvants" se détachent immédiatement.

J'ai donc ici une bouteille Corning 250mL, et 3 marques de marqueur :

Marqueur à pointe fine Fisherbrand (ci-dessus)

Sharpie Industriel (ci-dessus)

Sakura microperm pointe ultrafine

Les marqueurs Sakura indiquent explicitement qu'ils se lavent avec de l'alcool, mais j'aime les embouts pour tubes à flux et tubes eppendorf. J'ai vaporisé le marqueur avec de l'éthanol à 70%, je l'ai laissé reposer quelques secondes, puis j'ai utilisé une lingette Kim pour le nettoyer. Fisherbrand, pour moi, fonctionne le mieux (excusez mon écriture !).


Votre recherche : marqueurs de laboratoire

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La cellule : une approche moléculaire. 2e édition.

Comme dans toutes les sciences expérimentales, la recherche en biologie cellulaire dépend des méthodes de laboratoire qui peuvent être utilisées pour étudier la structure et la fonction des cellules. De nombreuses avancées importantes dans la compréhension des cellules ont directement suivi le développement de nouvelles méthodes qui ont ouvert de nouvelles voies d'investigation. Une appréciation des outils expérimentaux à la disposition du biologiste cellulaire est donc essentielle pour comprendre à la fois l'état actuel et les orientations futures de ce domaine scientifique en évolution rapide. Certaines des méthodes générales importantes de la biologie cellulaire sont décrites dans les sections qui suivent. D'autres approches expérimentales, y compris les méthodes de biochimie et de biologie moléculaire, seront discutées dans les chapitres suivants.


Contamination microbienne des cultures cellulaires

Les milieux de culture cellulaire et les conditions d'incubation offrent un environnement idéal pour les cellules, ainsi que pour les contaminants bactériens, fongiques et viraux. Pour augmenter l'adhérence diligente à la technique de culture aseptique, les cultures doivent être régulièrement examinées au microscope pour rechercher des preuves d'intrus bactériens et fongiques. Certains contaminants microbiens omniprésents échappent à la détection visuelle, car on estime que jusqu'à 30 % de toutes les cultures sont contaminées par des mycoplasmes. Les réactifs et kits conçus pour la détection des mycoplasmes invisibles sont souvent basés sur l'amplification PCR, qui peut également être utilisée pour détecter les contaminants viraux.


Protocole de techniques de culture de tissus de cellules de mammifères

Ce qui suit est une directive générale pour la culture de lignées cellulaires. Toute culture cellulaire doit être effectuée dans une enceinte de sécurité microbiologique en utilisant une technique aseptique pour assurer la stérilité.

Contenu

​1) Préparation d'un environnement aseptique

Règlement sur la hotte

Autoclavage

  • (a) Embouts de pipette (ou peuvent être achetés pré-autoclavés, sans DNAse/RNAse)
  • (b) Pipettes Pasteur 9" en verre
  • (c) 70% d'éthanol (Assurez-vous de pulvériser toutes les surfaces)

Tous les milieux, suppléments et réactifs doivent être stériles pour empêcher la croissance microbienne dans la culture cellulaire. Certains réactifs et suppléments nécessiteront une stérilisation par filtre s'ils ne sont pas fournis stériles.

Regardez notre protocole vidéo sur la technique aseptique pour des directives détaillées sur la façon d'éviter la contamination.

2) Préparation du milieu de croissance cellulaire

Avant de commencer le travail, vérifiez les informations fournies avec la lignée cellulaire pour identifier le type de support, les additifs et les recommandations à utiliser.

La plupart des lignées cellulaires peuvent être cultivées en utilisant des milieux de culture DMEM ou des milieux de culture RPMI avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM de glutamine et des antibiotiques peuvent être ajoutés si nécessaire (voir tableau ci-dessous).

Vérifiez quels milieux de culture et quels suppléments de culture la lignée cellulaire que vous utilisez a besoin avant de commencer les cultures. Les milieux de culture et les suppléments doivent être stériles. Achetez des réactifs stériles lorsque cela est possible, utilisez-les uniquement dans des conditions aseptiques dans une hotte de culture pour vous assurer qu'ils restent stériles.

​​Exemple général utilisant un support DMEM

MédiasMesure
DMEM - Retirer 50 ml d'un flacon de 500 ml, ajouter d'autres composants. 450 ml
10% FBS50 ml
2 mM de glutamine5 ml
100 U de pénicilline / 0,1 mg/ml de streptomycine5 ml

3) Créer le bon environnement de culture

La plupart des lignées cellulaires se développeront sur des flacons de culture sans avoir besoin de matrices spéciales, etc. Cependant, certaines cellules, en particulier les cellules primaires, nécessiteront une croissance sur des matrices spéciales telles que le collagène pour favoriser l'attachement cellulaire, la différenciation ou la croissance cellulaire. Nous vous recommandons de consulter la littérature pertinente pour plus d'informations sur les cellules que vous cultivez.

Voici un exemple pour les cellules endothéliales et épithéliales :

Pour les cellules humaines, enrober les flacons de gélatine à 1 %. Alternativement, pour d'autres types de cellules tels que BAEC, les flacons peuvent être recouverts de 1% de fibronectine.

  1. Préparer 10 ml de solution d'enrobage composée de 1% de gélatine ou 1% de fibronectine en diluant avec de l'eau distillée, suivi d'une filtration. Ceci est efficace pour enrober environ 5 flacons.
  2. Pipeter la solution de revêtement dans le flacon. Secouez d'avant en arrière pour répartir uniformément le fond du flacon. Laisser reposer dans un incubateur pendant 15-30 minutes.
  3. Aspirer la solution de revêtement et laver avec du dH stérile2O avant de voir les cellules.

4) Vérification des cellules

Les cellules doivent être vérifiées quotidiennement au microscope pour surveiller la santé, les taux de croissance et la confluence (% de la surface recouverte d'une monocouche cellulaire).

Les cellules adhérentes doivent être principalement attachées au fond du flacon, présenter une morphologie adhérente (dépendant de la lignée cellulaire) et réfracter la lumière autour de leur membrane (voir les images de la fiche technique de la lignée cellulaire Abcam).

Les cellules en suspension doivent présenter une morphologie circulaire et réfracter la lumière autour de leur membrane. Certaines cellules en suspension peuvent s'agglomérer (des réactifs de dissociation tels que Pluronic PF68 pourraient être ajoutés pour favoriser l'élimination des grumeaux).

Les supports qui contiennent du rouge de phénol doivent être de couleur rose/orange (la couleur du support peut changer en fonction du CO2 environnement). Pour les applications d'imagerie, des supports sans rouge de phénol peuvent être utilisés et éviteront les interférences avec l'acquisition d'imagerie. Une couleur jaune pâle du milieu indiquerait une acidité et une diminution du pH qui sont souvent associées à une contamination ou à des cellules malsaines.

  • Ils se détachent en grand nombre (lignes attachées) et/ou semblent ratatinés et granuleux/de couleur foncée.
  • Ils sont au repos (ne semblent pas grandir du tout).

5) Sous-culture

Également appelé division cellulaire et passage cellulaire.

Des ratios de fractionnement ou des densités d'ensemencement peuvent être utilisés pour garantir que les cellules sont prêtes pour une expérience un jour particulier ou pour maintenir des cultures cellulaires pour une utilisation future ou comme sauvegarde. Les lignées cellulaires en suspension sont ensemencées en fonction du volume, de sorte que les densités d'ensemencement seront calculées en cellules/mL, tandis que les lignées cellulaires adhérentes sont ensemencées en fonction de la surface du flacon et seront donc calculées en cellules/cm 2 . Les lignées cellulaires nécessitent souvent des densités d'ensemencement spécifiques, alors vérifiez toujours les directives pour la lignée cellulaire utilisée. Les cellules à croissance lente peuvent ne pas croître si un rapport de division élevé est utilisé. Les cellules à croissance rapide peuvent nécessiter un rapport de division élevé pour s'assurer qu'elles ne prolifèrent pas.

Les lignées cellulaires adhérentes peuvent être divisées en utilisant des ratios de division spécifiques à la lignée cellulaire ou des densités d'ensemencement (cellules/cm 2 ) :

  • La division 1:2 doit être confluente à 70-80% et prête pour une expérience en 1 à 2 jours
  • La division 1:5 doit être confluente à 70-80% et prête pour une expérience en 2 à 4 jours
  • La division 1:10 doit être confluente à 70-80% et prête pour la sous-culture ou l'ensemencement en 4 à 6 jours.

Les ratios de fractionnement sont basés sur la surface du flacon, par exemple :

1 flacon de 25 cm 2 Split 1:3 donnerait 3 flacons de 25 cm 2 ou 1 x 75 cm 2

Les lignées cellulaires en suspension doivent être maintenues en utilisant des densités d'ensemencement spécifiques à la lignée cellulaire (cellules/mL) :

  • 2e5 devrait être prêt pour une expérience dans 3-4 jours
  • 1e6 devrait être prêt pour une expérience dans 1-2 jours

Si les cellules doivent être laissées sans surveillance pendant de longues périodes (c.

​6) Protocole de sous-culture adhérent (à l'aide d'un réactif de dissociation)

Lorsque les cellules sont à environ 80 % confluentes (80 % de la surface du flacon est recouverte d'une monocouche cellulaire), les cellules doivent encore être dans leur phase logarithmique de croissance et nécessitent une sous-culture. Il n'est pas recommandé de laisser les cellules devenir trop confluentes car cela peut affecter négativement l'expression des gènes et la viabilité cellulaire.

  1. Retirer les milieux de culture cellulaire et le réactif de dissociation du réfrigérateur et les placer dans un incubateur à 37 o C et laisser revenir à tempérer 37 o C.
    - Ne laissez pas le média dans l'incubateur plus longtemps que nécessaire car les composants du média se dégraderont avec le temps.
  2. Allumez et effectuez un nettoyage de base de votre enceinte de sécurité biologique.
    - Vaporisez tous les flacons de milieu, pipettes et tubes à centrifuger avec de l'éthanol avant de les placer dans l'enceinte de sécurité biologique.
  3. Sous l'enceinte de sécurité biologique, retirez le milieu conditionné et lavez doucement la monocouche cellulaire avec du DPBS à température ambiante.
    - Ajouter délicatement du DPBS sur le côté du flacon afin de ne pas déloger avec force les cellules adhérentes.
  4. Retirer le DPBS à l'aide d'une pipette sérologique stérile et ajouter le réactif de dissociation préchauffé (Trypsine-EDTA) dans le flacon et placer dans un incubateur pour

7) Sous-culture de lignées cellulaires faiblement attachées nécessitant un grattage cellulaire pour la sous-culture

  1. Lorsque vous êtes prêt, versez soigneusement le milieu du flacon des cellules requises dans le pot à déchets (contenant environ 100 ml d'hypochlorite de sodium à 10 %) en prenant soin de ne pas augmenter le risque de contamination avec des gouttes.
  2. Remplacez-le immédiatement en versant soigneusement un volume égal de milieu de culture frais préchauffé dans le flacon.
  3. À l'aide d'un grattoir à cellules, grattez doucement les cellules du fond du flacon dans le milieu. Vérifiez que toutes les cellules se sont détachées en inspectant la base du flacon avant de continuer.
  4. Sortez la quantité requise de suspension cellulaire pour le rapport de fractionnement requis à l'aide d'une pipette sérologique.
    par exemple. pour 1:2 fractionné à partir de 100 ml prendre 50 ml dans un nouveau flacon
    1:5 divisé à partir de 100 ml prendre 20 ml dans un nouveau flacon
    1:10 divisé de 100 ml prendre 10 ml dans un nouveau flacon
  5. Remplissez les nouveaux flacons jusqu'au volume requis (en tenant compte du ratio de division) avec des milieux de culture frais préchauffés
    par exemple. dans un flacon de 25 cm 2 environ 5-10 ml
    Flacon de 75 cm 2 environ 10-30 ml
    Flacon de 175 cm 2 environ 40-150 ml

8) Sous-culture de lignées cellulaires attachées nécessitant de la trypsine

Remarque - toutes les cellules ne nécessitent pas de trypsinisation, et pour certaines cellules, cela peut être toxique. Il peut également induire une internalisation temporaire de certaines protéines membranaires, ce qui doit être pris en compte lors de la planification des expériences. D'autres méthodes telles que le grattage doux des cellules ou l'utilisation d'un détergent très doux peuvent souvent être utilisées comme substitut dans ces circonstances.

  1. Lorsque vous êtes prêt, versez soigneusement le milieu du flacon des cellules requises dans le pot à déchets (contenant environ 100 ml d'hypochlorite de sodium à 10 %) en prenant soin de ne pas augmenter le risque de contamination avec des gouttes.
  2. En utilisant une technique aseptique, verser / pipeter suffisamment de PBS stérile dans le flacon pour laver les cellules et éliminer tout FBS dans les milieux de culture résiduels. Astuce flacon doucement quelques fois pour rincer les cellules et soigneusement versez/pipettez le PBS dans le pot à déchets.

Cela peut être répété une ou deux fois si nécessaire (certaines lignées cellulaires mettent beaucoup de temps à trypsiniser et celles-ci auront besoin de plus de lavages pour se débarrasser de tout FBS résiduel pour aider à la trypsinisation)

9) ​Sous-culture de lignées cellulaires en suspension​

  1. Consultez les directives pour la lignée cellulaire pour le rapport de division recommandé ou les densités cellulaires de sous-culture.
  2. Retirez la quantité requise de suspension cellulaire du flacon à l'aide d'une pipette et placez-la dans un nouveau flacon.
    Par exemple, pour une division 1:2 de 100 ml de suspension cellulaire, prélevez 50 ml
    ​Pour diviser 1:5 à partir de 100 ml de suspension cellulaire, prélever 20 ml
  3. Ajouter la quantité requise de milieux de culture cellulaire préchauffés dans un flacon frais.
    par exemple. Pour une division 1:2 de 100 ml, ajoutez 50 ml de milieu frais à 50 ml de suspension cellulaire
    Pour une division 1:5 de 100 ml, ajoutez 80 ml de milieu frais à 20 ml de suspension cellulaire

10) Changer de média

Si les cellules se sont bien développées pendant quelques jours mais ne sont pas encore confluentes, elles auront besoin d'un changement de milieu pour reconstituer les nutriments et maintenir un pH correct. Les cellules produisent des facteurs favorisant la croissance positifs qui sont sécrétés dans leur milieu, il peut donc être bénéfique d'effectuer un demi-changement de milieu pour reconstituer les nutriments fournis par le milieu et également maintenir ces facteurs de croissance positifs.

Pour changer de milieu, réchauffer le milieu de culture à 37°C à l'aide d'un bain-marie ou d'un incubateur pendant au moins 30 min. Aspirer les vieux médias du flacon et remplacer les médias par le volume nécessaire de milieux de culture frais préchauffés et remettre dans l'incubateur.

11) Numéro de passage

Le nombre de passages est le nombre de sous-cultures que les cellules ont subies. Le numéro de passage doit être enregistré et ne pas être trop élevé. Ceci afin d'éviter l'utilisation de cellules subissant une dérive génétique et d'autres variations.


Biotechnologie médicale et soins de santé

5.12.4.4 Culture cellulaire à micro-échelle

La culture cellulaire est généralement considérée comme une technique par laquelle les cellules sont cultivées en dehors d'un organisme vivant dans des conditions contrôlées (par exemple, la température, le pH, les nutriments et les niveaux de déchets). Il a une longue histoire d'utilisation dans une variété d'applications biologiques telles que l'étude de la biologie/physiologie cellulaire, le criblage de médicaments, les tests de toxines ou d'autres tests cellulaires. La pratique de culture cellulaire la plus largement utilisée de nos jours consiste à cultiver des cellules en utilisant des microplaques multipuits ou des boîtes de Pétri comme récipients de culture. La culture cellulaire basée sur cela peut entraîner des problèmes d'échelle et des conditions de culture mal définies. Ce dernier est attribué au format de culture cellulaire statique typique et aux gradients chimiques existant dans le système de culture. Ceux-ci pourraient non seulement consommer plus de ressources expérimentales (par exemple, milieu de culture, réactifs ou cellules), mais surtout pourraient entraver l'étude précise du lien quantitatif entre les réponses cellulaires aux conditions extracellulaires.

Grâce aux récents progrès de la microfabrication et de la technologie microfluidique, un système de culture cellulaire peut être miniaturisé en un dispositif à micro-échelle. Avec cette échelle de taille, les dispositifs microfluidiques sont particulièrement adaptés aux applications biologiques, en particulier au niveau cellulaire, car l'échelle des microcanaux correspond bien au microenvironnement cellulaire natif. Cela ouvre la voie à la création d'une plus in vivo-comme un microenvironnement cellulaire in vitro. En raison des petites dimensions des systèmes microfluidiques, la culture cellulaire à base de microfluidique consomme moins de ressources. Ceci est particulièrement significatif pour certaines applications dans lesquelles les ressources sont limitées (par exemple, les tests/dépistages de drogues). De plus, un système de culture cellulaire à base de microfluidique fonctionne normalement dans des conditions de perfusion, fournissant un environnement de culture relativement stable en raison de l'apport continu de nutriments et de l'élimination des déchets. De plus, en raison de l'échelle de culture cellulaire miniaturisée, les phénomènes de gradient chimique existant dans les environnements de culture ou les constructions cultivées peuvent être largement minimisés, offrant un meilleur contrôle du microenvironnement de la cellule. On pense que la pratique de la culture cellulaire microfluidique fournit une culture bien définie et homogène, permettant l'étude de la relation entre les réponses cellulaires et les conditions de culture d'une manière plus précise et moins coûteuse.

Les systèmes de culture cellulaire microfluidiques fabriqués en PDMS à l'aide de techniques de lithographie douce bien développées ont attiré l'intérêt des biologistes principalement en raison de la simplicité de fabrication et parce que la nature inhérente du PDMS convient aux systèmes cellulaires. La pertinence de l'utilisation du PDMS pour un système de culture cellulaire à base de microfluidique peut être résumée comme suit : (1) biocompatible et non toxique, (2) hautement perméable à l'oxygène et (3) optiquement transparent, ce qui facilite l'observation microscopique. Plus récemment, divers systèmes de culture cellulaire à base de microfluidique ont été activement recherchés pour diverses applications telles que le test/le criblage de médicaments ou de toxines ou les essais biologiques à base de cellules. Par exemple, une plate-forme de culture cellulaire de perfusion micro-3D) pour le dépistage de drogues a été réalisée à l'aide de technologies microfluidiques ( Figure 16 (une)) [19] . Les caractéristiques de cette plate-forme de culture cellulaire incluent le maintien d'environnements de culture homogènes et stables, des mécanismes de pompage de milieu efficaces et un chargement de cellules/échafaudages, permettant des tests basés sur la culture cellulaire plus précis et à haut débit. En outre, un dispositif microfluidique intégré composé de plusieurs générateurs de gradient de médicament et de chambres de culture cellulaire parallèles a été fabriqué pour les tests de drogue à haut débit, dans lesquels des mesures multiparamétriques des réponses cellulaires aux conditions médicamenteuses peuvent être effectuées dans un seul appareil ( Figure 16 (b)) [21] . Bien que les systèmes de culture cellulaire microfluidiques soient très prometteurs en tant que plates-formes pour diverses applications, l'utilisation de ces outils émergents n'a pas encore déclenché un changement évolutif par rapport aux méthodes conventionnelles de culture cellulaire. Il reste encore de nombreux obstacles à surmonter avant de pouvoir passer d'un outil de démonstration à des applications pratiques. Les défis comprennent principalement plusieurs problèmes techniques concernant la prévention de l'évaporation de liquide dans le système microfluidique et des schémas de détection capables de lire les résultats d'un essai cellulaire de manière efficace et à haut débit.

Figure 16 . (a) (I) Photographies d'une plate-forme de culture cellulaire micro-, 3D basée sur la perfusion et (II) l'ensemble de la configuration expérimentale (la plate-forme est intégrée à un contrôleur portatif) (b) Schéma du dispositif microfluidique pour le criblage cellulaire à haut débit, dans lequel un générateur de gradient de concentration en amont et des chambres de culture cellulaire parallèles en aval sont intégrés

(a) Reproduit de Wu MH, Huang SB, Cui ZF, et al. (2008) Développement d'une plate-forme de culture cellulaire micro 3-D basée sur la perfusion et son application pour le dépistage de médicaments à haut débit. Capteurs et actionneurs B : Chimique 129 : 231-240, avec la permission d'Elsevier. (b) Reproduit de Ye N, Qin J, Shi W, et al. (2007) Dépistage cellulaire à haut contenu à l'aide d'un dispositif microfluidique intégré. Laboratoire sur puce 7: 1696–1704 .


Tubes

Les tubes sont utilisés pour la collecte, le transport, le stockage et les tests d'échantillons solides ou liquides. Alors que certains tubes sont conçus pour un usage général, les tubes spécifiques à une application, notamment les tubes à essai, les tubes de culture, les tubes à centrifuger, les tubes à microcentrifugation, les tubes PCR et les cryotubes, sont conçus pour répondre à des exigences spécifiques de température, de force, de stérilité et de compatibilité chimique. Plusieurs types de matériaux de tubes en verre et en plastique peuvent être sélectionnés en fonction de leur durabilité, de leur inertie et d'autres caractéristiques. Les tubes à fond rond et à fond conique peuvent augmenter la récupération des échantillons. Des tubes jetables et réutilisables sont disponibles en fonction des besoins de commodité et de sécurité. Les bouchons à vis offrent une sécurité supplémentaire en empêchant les fuites et les déversements. Les fermetures à bouchon et les fermetures à pression facilitent la manipulation des tubes.


Bouteilles à rouleaux pour culture cellulaire

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Schaeffer, W.I. Utilisation de la terminologie des vertébrés, des invertébrés et des cellules végétales, des tissus et des cultures d'organes. In vitro 20, 19–24 (1984).

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Voir la vidéo: Systèmes Geset u0026 Markoprint effectuent létiquetage et le marquage des produits AdBlue (Janvier 2022).