Informations

Comment les premières glandes mammaires auraient-elles fonctionné ?


Je suis tombé sur un livre (pas sur la biologie) contenant ce texte :

Une naissance qui a changé la vie s'est produite sur la planète il y a environ 190 millions d'années […], la première petite créature ressemblant à une musaraigne a donné naissance à un bébé et a commencé à allaiter ses petits. [… ] ce petit mammifère à fourrure a incarné un énorme bond dans l'évolution biologique

La description est joliment dramatique, mais cela ne sonne pas vrai pour moi. Bien que je sache que l'évolution n'a probablement pas été aussi progressive que les livres de lycée le représentent, l'idée qu'un non-mammifère ait donné naissance à une fille avec des glandes mammaires pleinement fonctionnelles qui a allaité activement ses petits est un peu trop difficile à avaler pour moi. Pour d'autres systèmes corporels, j'ai lu des histoires sur la façon dont ils ont émergé progressivement, par exemple les espèces les plus anciennes ayant quelques cellules nerveuses, puis les nouvelles ayant tout un "réseau" nerveux avec quelques ganglions, avant que de vrais cerveaux n'émergent. Ou de la même manière, les vers ayant une tache de cellules photosensibles sur la peau ont évolué en animaux avec des yeux. Je sais que les ornithorynques ont des glandes mammaires sans mamelons, mais probablement même elles sont déjà beaucoup plus sophistiquées que les premières glandes mammaires.

Alors, à quoi ressemblent les glandes proto-mammaires ? Ont-ils évolué de novo spécialement pour nourrir les bébés, ou étaient-ils peut-être des glandes sudoripares réutilisées ou quelque chose comme ça ? Comment sont-ils censés avoir fonctionné ?


la production de liquides pour nourrir la progéniture a évolué séparément dans plusieurs lignées, les mammifères l'ont simplement poussée plus loin que tout autre groupe. il est assez facile de voir comment cela pourrait évoluer, tout moyen de fournir même des oligo-éléments ou de la nourriture aux jeunes aura un avantage dans les organismes qui sont déjà engagés dans l'éducation des enfants. cela signifie exposer moins souvent les jeunes aux prédateurs.

Les glandes mammaires sont des glandes sudoripares modifiées.

Les monotrèmes n'ont pas de mamelons, ce qu'ils ont, c'est un groupe de glandes mammaires sur une parcelle de peau. les jeunes doivent sucer le lait d'une touffe de poils.

La séquence exacte de l'évolution de la lactation n'est pas bien connue car la lactation ne laisse aucune preuve fossile.


Sources:

Lefèvre, C.M., Sharp, J.A. et Nicholas, K.R., 2010. Évolution de la lactation : origine ancienne et adaptations extrêmes du système de lactation. Revue annuelle de la génomique et de la génétique humaine, 11, pp.219-238.

Capuco, A.V. et Akers, R.M., 2009. L'origine et l'évolution de la lactation. Journal de biologie, 8(4), p.37.


Voies de signalisation impliquées dans la morphogenèse précoce des glandes mammaires et le cancer du sein

La spécification du devenir des cellules épithéliales mammaires se produit pendant l'embryogenèse lorsque les cellules s'agrègent pour former l'ébauche mammaire. Au sein du bourgeon mammaire embryonnaire, il existe une population de cellules épithéliales qui vont ensuite proliférer pour former un arbre canalaire remplissant le compartiment stromal, et qui peuvent produire du lait lors de la différenciation terminale après la naissance. Par la suite, ces structures peuvent être remodelées et ramenées à un état basal après le sevrage avant de se régénérer lors de futures grossesses. La plasticité de la cellule épithéliale mammaire et sa réactivité aux récepteurs hormonaux facilitent cet incroyable exploit biologique, mais une signalisation aberrante peut également entraîner des conséquences inattendues sous la forme de tumeurs malignes fréquentes. Reflétant cette connexion intime, un nombre considérable de voies de signalisation ont été impliquées à la fois dans la morphogenèse de la glande mammaire et la cancérogenèse.

Citation: Howard B, Ashworth A (2006) Voies de signalisation impliquées dans la morphogenèse précoce des glandes mammaires et le cancer du sein. PLoS Genet 2(8) : e112. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.0020112

Éditeur: Elizabeth M.C. Fisher, University College London, Royaume-Uni

Publié : 25 août 2006

Droits d'auteur: © 2006 Howard et Ashworth. Il s'agit d'un article en libre accès distribué sous les termes de la Creative Commons Attribution License, qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur n'importe quel support, à condition que l'auteur original et la source soient crédités.

Le financement: Le travail dans notre laboratoire est soutenu par le Breakthrough Breast Cancer Research Centre.

Intérêts concurrents : Les auteurs ont déclaré qu'ils n'existaient pas de conflit d'intérêts.


Cellules souches et glande mammaire en développement

La glande mammaire subit des changements dynamiques tout au long de la vie. Chez la souris, ceux-ci commencent par la morphogenèse initiale de la glande dans l'embryon à mi-gestation suivie de changements régulés hormonalement pendant la puberté et plus tard à l'âge adulte. La glande mammaire adulte contient une hiérarchie de types cellulaires avec des potentiels variables d'auto-entretien et de différenciation. Ceux-ci incluent des cellules capables de produire des glandes mammaires complètes et fonctionnelles in vivo et qui contiennent des cellules filles avec le même potentiel de régénération remarquable, ainsi que des cellules ayant une activité clonogénique plus limitée in vitro. Nous examinons ici comment l'application de méthodes in vitro et in vivo pour quantifier ces cellules dans le tissu mammaire adulte aux cellules mammaires fœtales a permis d'identifier les premières cellules répondant aux critères fonctionnels des cellules souches mammaires isolées transplantables quelques jours avant la naissance. Par la suite, le nombre de ces cellules augmente rapidement. Les populations contenant ces cellules souches fœtales présentent des programmes de croissance et d'expression génique qui diffèrent de leurs homologues adultes mais partagent des signatures caractéristiques de certains types de cancer du sein. De telles observations renforcent les preuves croissantes de différences importantes entre les cellules fœtales et adultes spécifiques aux tissus avec des propriétés de cellules souches et soulignent les mérites de l'étude de leur base moléculaire.

Ceci est un aperçu du contenu de l'abonnement, accessible via votre institution.


Résultats

Souris transgéniques cycline E, zygosité et expression du transgène

Les allèles de la cycline E et de la cycline E-T380A hyperstable (ci-après T380A) sont des insertions à locus unique héritées indépendamment du locus p53 situé sur le chromosome 11 de la souris et ne sont pas liées au sexe. Le génotype n'a pas modifié l'âge de la maturité sexuelle ou la taille de la portée. Toutes les lignées de souris rapportées ici étaient soit homozygotes soit nullizygotes au locus du transgène et de type sauvage ou hétérozygotes au locus p53. Ceux-ci ont été désignés comme de type sauvage, CycE, T380A, p53 +/-, p53 +/- CycE et p53 +/- T380A. L'expression des transgènes a été détectée dans les noyaux de l'épithélium mammaire par immunohistochimie mais pas dans les autres tissus examinés (tous les viscères thoraciques et abdominaux, tissu nerveux central et périphérique, tissu hématopoïétique, musculature et données tégumentaires non présentées). Cependant, des niveaux d'expression à l'état de traces de l'allèle T380A étaient détectables dans les poumons et le foie lors de longues expositions d'immunotransfert (≥1000 fois moins d'expression que la glande mammaire à mi-lactation par titrage sur des données d'immunotransfert non présentées).

Nous avons précédemment montré qu'un transgène de la cycline E chez la souris est associé à une hyperplasie de l'épithélium de la glande mammaire concomitante à son expression sous ??-promoteur de lactoglobuline (BLG). Ce phénomène est transitoire, survenant dans l'épithélium au cours du cycle lactogène, se manifestant initialement dans le dernier tiers de la gestation et persistant jusqu'au sevrage de la portée à 4 semaines post-partum. À ce stade, les épithéliums mammaires subissent une involution et les épithéliums hyperplasiques sont inclus dans ce processus (Bortner et Rosenberg, 1997). Par coloration standard à l'hématoxyline et à l'éosine, l'hyperplasie dans l'épithélium de la mi-lactation (2 semaines post-partum) des souris est apparue généralement plus répandue chez les souris transgéniques T380A que celles avec le transgène CycE, mais pas plus sévère. Dans la glande mammaire en milieu de lactation, le transgène T380A était fortement exprimé avec une expression plus faible du transgène CycE (figure 1a). Le titrage du signal T380A par rapport à celui des souris CycE a montré une expression environ 10 fois plus élevée (figure 1b). Concomitamment à l'expression dans la glande mammaire, l'activité de la kinase associée au transgène (cycline E humaine) était fortement élevée chez les souris avec l'allèle T380A (figure 1c). Cependant, les niveaux de kinase associés à l'allèle CycE n'étaient pas significativement élevés au-dessus du bruit de fond intrinsèque du test.

Expression transgénique et activité kinase dépendante du transgène dans les glandes mammaires en milieu de lactation (2 semaines après l'accouchement). (une) Analyse par immunotransfert par PAGE à 15 % d'extraits protéiques de glandes mammaires de type sauvage, cycline E et T380A avec l'anticorps monoclonal HE12 spécifique de la cycline E humaine. (b) Le titrage de l'expression du transgène T380A par rapport à celle des souris cycline E démontre que l'expression à l'état d'équilibre est environ 10 fois plus élevée chez les souris T380A. (c) L'activité kinase dépendante de la cycline E est plus élevée chez les souris T380A. Des extraits de glandes mammaires de milieu de lactation de 2 semaines ont été immunoprécipités avec une IgG spécifique de la cycline E humaine HE172. La phosphorylation de l'histone H1 en présence d'ATP radiomarqué était plus importante chez les souris T380A que chez les souris de type sauvage (sans transgène cycline E humaine), alors que chez les souris cycline E, l'activité kinase dépendante du transgène n'était pas élevée au-dessus du bruit de fond. L'activité kinase chez les souris p53 +/- T380A était comparable à celle des souris T380A. Les contrôles -ve et +ve représentent l'absence de protéine ajoutée et l'extrait recombinant de Cycline/Cdk2 de cellules SF9, respectivement.

Le spectre tumoral chez les souris p53+/− n'est pas affecté par les transgènes de la cycline E

Le spectre des tumeurs observées chez les souris p53 +/- est bien établi. Nous avons observé un spectre tumoral similaire à ceux des rapports publiés (Donehower et al., 1992 Jacks et al., 1994). Chez les souris multipares p53 +/- nous avons observé un taux modéré de carcinome mammaire, 7 % (3/45). Le spectre tumoral chez les souris p53 +/- avec le transgène T380A ou CycE était similaire (tableau 1) à l'exception d'une faible fréquence de lésions bronchiolaires/alvéolaires dans les poumons des souris portant le transgène T380A. Cependant, ces découvertes fortuites étaient de petites (<3 mm) lésions uniques observées lors de l'autopsie à 18 mois. Des sections représentatives de tumeurs non mammaires (y compris les lésions pulmonaires) étaient systématiquement négatives pour l'expression du transgène mais positives pour la cycline E endogène de souris (données non présentées). Ces découvertes démontrent que l'expression de la cycline E sous le contrôle du promoteur BLG ne favorise pas de manière significative la formation de tumeurs non mammaires.

L'hétérozygotie p53 agit en synergie avec l'allèle T380A pour favoriser la tumorigenèse mammaire et diminuer l'espérance de vie

Les souris p53 +/- T380A ont montré une réduction légère, mais significative, de l'espérance de vie par rapport aux souris p53 +/- (Figure 2a P<0.005, test du log-rank). Bien qu'environ 25 % des souris p53 +/- et 70 % des souris T380A étaient sans tumeur à 1,5 an, aucun animal p53 +/- T380A n'atteignait cet âge sans tumeur (tableau 1). Une certaine réduction de l'espérance de vie était attendue en raison de l'augmentation du nombre de tumeurs mammaires. En effet, lorsque l'analyse de la survie était limitée aux souris sans tumeur mammaire, la survie était comparable (P= 0,212 données de test de log-rank non présentées).

L'hétérozygotie p53 est synergique avec l'allèle de la cycline E T380A pour favoriser la tumorigenèse mammaire et diminuer la survie, mais ne diminue pas significativement la latence tumorale. (une) L'allèle de la cycline E T380A diminue la survie (panneau de gauche) qui s'explique par la tumorigenèse mammaire. Souris p53 +/- T380A exprimant le transgène (panneau de droite) ont une diminution légère mais statistiquement significative de la survie (P<0.005 log-rank test) par rapport aux témoins non transgéniques (p53 +/-). La différence est due à des taux accrus de tumorigenèse mammaire (voir texte). (b) Synergie dans la tumorigenèse mammaire chez les souris p53 +/- T380A significativement supérieure à un effet additif des niveaux observés chez les souris p53 +/- et T380A. (c) La latence de la tumorigenèse mammaire est légèrement diminuée chez les souris p53T380A mais n'a pas atteint la signification statistique. Chaque cercle représente l'heure de la mise à mort et les barres verticales représentent les moyennes.

Même si le spectre tumoral n'était pas altéré chez les souris p53 +/-, avec ou sans transgènes cycline E, la fréquence avec laquelle les tumeurs mammaires étaient observées était nettement modifiée en présence du transgène cycline E hyperstable. Chez les souris p53 +/- sans transgène, une tumorigenèse mammaire a été observée chez 7 % (3/45). Chez les souris p53 +/- avec le transgène cycline E de type sauvage, la pénétrance tumorale était inchangée à 6 % (2/32) alors que chez les souris portant l'allèle hyperstable T380A, la pénétrance était augmentée à 54 % (30/56) (figure 2b). Cette augmentation de la pénétrance tumorale était synergique car elle était significativement supérieure à l'addition des fréquences observées dans les lignées témoins (P<0.001 Test exact de Fisher et ?? 2 -test). L'effet synergique était encore plus important si l'on considère que trois des souris p53 +/- T380A ont développé deux tumeurs mammaires indépendantes donnant un rapport normalisé de 7:12:59 (p53 +/- :T380A:p53 +/- T380A). La fréquence des tumeurs mammaires chez les souris transgéniques pour l'allèle hyperstable en l'absence d'une mutation p53 n'était que de 12 % (4/34). La latence des tumeurs mammaires était légèrement diminuée chez les souris p53 +/− T380A mais n'a pas atteint la signification (ANOVA P<0.28 Figure 2c), probablement en raison du petit nombre de tumeurs chez les souris d'autres génotypes.

Toutes les tumeurs mammaires étaient des carcinomes de grade intermédiaire à élevé (Figure 3) avec des taux mitotiques élevés, une atypie nucléaire considérable, une différenciation acinaire médiocre et des zones de nécrose. Une invasion locale de la peau et/ou de la musculature était habituellement observée. Cependant, malgré le comportement biologique malin manifeste, des métastases hématogènes n'ont pas été observées par l'examen histologique de routine des poumons, du foie et de la moelle. Une dissémination lymphatique a été notée dans plusieurs cas mais était une observation généralement peu fréquente. Plus de tumeurs sont apparues dans les glandes mammaires cervicales que prévu étant donné que les glandes mammaires cervicales ne constituent que 2 des 10 glandes mammaires chez la souris. Ces tumeurs mammaires cervicales étaient également associées à une taille moyenne de portée plus petite (données non présentées). De nombreuses tumeurs malignes non mammaires présentaient à la fois une propagation métastatique hématogène et lymphatique en plus d'une invasion locale.

Analyse histologique, immunohistochimique et immunoblot de l'expression du transgène dans les tumeurs mammaires. (une) Expression de T380A dans les noyaux des épithéliums mammaires de mi-lactation (coloration brune DAB). (b) Expression de T380A dans la composante épithéliale d'une tumeur mammaire survenant chez une souris p53 +/- T380A. (c) Absence de coloration dans une tumeur d'une souris p53 +/- T380A mais avec une population cellulaire immunoréactive ablumenale dans l'épithélium canalaire adjacent. ( et e) Forte coloration immunoréactive de certains épithéliums dans les tumeurs mammaires des souris p53 +/- T380A et T380A, respectivement, mais avec une coloration négative dans les zones de différenciation squameuse (flèches). (F) Coloration négative de figures mitotiques (pointes de flèches) au sein d'une tumeur immunopositive généralement transgénique chez une souris p53 +/- T380A. L'encart montre l'agrandissement d'une cellule en métaphase. Le grossissement d'origine pour chaque panneau est indiqué dans le coin inférieur droit. (g) Analyse occidentale des tumeurs mammaires montrant une bonne corrélation avec l'évaluation immunohistochimique de l'expression du transgène. + et - sont respectivement des contrôles positifs et négatifs. ++ coloration forte (≥50 % de la composante épithéliale), + coloration faible <50 % de la composante épithéliale, − coloration négative (avec une partie de la coloration épithéliale canalaire non impliquée positive). Notez une expression plus forte dans certaines tumeurs que dans la glande mammaire en milieu de lactation (dans l'ensemble), bien que des protéines variables du sang, du stroma et du lait avec des variations régionales d'expression empêchent une comparaison absolue.

Les tumeurs mammaires, en particulier chez les souris p53 +/- T380A, étaient des lésions agressives à croissance rapide. Typiquement, une taille de 1 cm a été atteinte dans les 2 à 8 jours suivant la première détection de la lésion. De plus, plusieurs des lésions p53 +/− T380A présentaient des indices mitotiques extraordinairement élevés, 20-30 figures mitotiques par × 40 champ objectif, avec de fréquentes zones de nécrose. En revanche, les lésions des souris T380A ou p53 +/- étaient caractérisées par des taux mitotiques plus modérés de 4 à 20 chiffres par × 40 champ objectif (tableau 2). Bien que plusieurs souris présentaient de multiples lésions primaires dans différents tissus, de multiples lésions mammaires ne se sont développées que chez les souris p53 +/− T380A (3/56 chaque souris, cependant, a été comptée comme un seul point de données pour l'analyse de pénétrance). Chez les quelques souris p53 +/- T380A de génération F1, où chaque souris est hétérozygote au locus d'insertion du transgène, une tumorigenèse mammaire a été observée à un taux équivalent de 60% (3/5) indiquant que l'hémizygotie au locus du transgène peut être suffisante pour une pleine pénétration.

Histologiquement, la plupart des tumeurs mammaires étaient composées de feuillets denses ou de nids de cellules néoplasiques, généralement entrecoupés d'une fine composante stromale (Figure 3). La grande majorité des lésions mammaires étaient des adénocarcinomes acinaires bien que beaucoup présentaient des zones de métaplasie squameuse avec divers degrés de dépôt de kératine. Un diagnostic de carcinome épidermoïde en l'absence de toute différenciation acinaire manifeste était peu fréquent mais a été enregistré une fois dans chacun des génotypes p53 +/-, p53 +/- T380A et T380A. Une seule lésion acinaire (p53 +/- T380A) et deux des carcinomes épidermoïdes (1 p53 +/- et 1 T380A) ont été classés de grade intermédiaire. Toutes les lésions restantes ont été classées comme de haut grade. Deux cas de carcinome in situ (tous deux de haut grade) ont été observés chez des souris p53 +/- T380A à l'autopsie. Ceux-ci n'ont pas été observés dans les autres génotypes.

Seules quatre souris p53 +/- T380A ont dû être sacrifiées avant l'âge auquel la première tumeur mammaire a été constatée. Cependant, ces souris offraient l'opportunité de rechercher des lésions mammaires prénéoplasiques dans la période entre la dernière grossesse et la latence relativement longue avant la formation de tumeurs palpables. Sur ces quatre souris, deux ont développé un lymphome thymique à l'âge de 6,8 et 9,8 mois, une a développé un ostéosarcome et la quatrième a été tuée en raison d'une dermatite sévère. L'immunohistochimie a révélé la présence de quelques cellules immunoréactives à la cycline E humaine situées dans l'abluménal des canaux des quatre souris (voir ci-dessous). Chez l'une des souris atteintes d'un lymphome, un foyer d'hyperplasie alvéolaire a été noté dans lequel l'épithélium était positif pour l'expression du transgène T380A (figure 3c).

Représenter l'incidence des tumeurs chez les souris sensibles aux lésions néoplasiques dans plusieurs systèmes d'organes peut être problématique pour s'assurer que les conclusions appropriées sont tirées. Il est donc important de clarifier deux observations qui ne portent pas significativement sur nos conclusions. Tout d'abord, l'incidence d'ostéosarcome chez les souris p53 +/- T380A apparaît diminuée par rapport aux autres génotypes porteurs de p53 +/- (tableau 1). Ceci est le résultat de la présentation plus précoce des lésions mammaires et représente donc une mise en évidence de l'incidence de l'ostéosarcome en raison de la latence plus longue de ces lésions. Deuxièmement, de façon similaire les courbes de survie indiquent que les souris p53 +/- T380A avaient une espérance de vie significativement diminuée par rapport aux souris p53 +/- ne portant pas de transgène. Cependant, bien que cela soit presque entièrement dû à l'incidence accrue de lésions mammaires néoplasiques, la courbe de survie similaire des souris p53 +/− CycE était presque entièrement due à des néoplasmes non mammaires et n'a pas atteint la signification par rapport au p53 + /− génotype.

Les tumeurs mammaires montrent une perte fréquente d'hétérozygotie p53 et une expression constitutive du transgène cycline E

Contrairement à certains rapports sur la rétention de l'allèle de type sauvage dans 50 % des tumeurs survenant chez des souris p53 +/- de moins de 18 mois (Venkatachalam et al., 1998), nous avons évalué p53 LOH comme un événement plus fréquent. La perte d'hétérozygotie p53 a été déterminée dans des extraits tumoraux par analyse Southern (figure 4) et une suite de réactions PCR multiplex. Une LOH p53 sans équivoque (diminution du signal d'exon IV 50 %, voir Procédures expérimentales) a été observée chez 100 % (3/3) des souris p53 +/-, 100 % (2/2) des souris p53 +/- CycE et 93 % ( 26/28) de souris p53 +/- T380A (tableau 2). Sur les quatre souris T380A qui ont développé des tumeurs mammaires, les deux allèles p53 de type sauvage étaient indétectables dans deux cas (50 % 2/4) comme déterminé par analyse Southern. Il y avait une perte équivoque dans un autre cas (environ 50 % qui représente probablement la perte d'un allèle) mais le quatrième cas présentait une rétention sans équivoque de p53 par Southern blot. En effet, dans ce dernier cas, l'allèle de type sauvage était apparemment retenu même après des passages en série de cellules cultivées à partir de la tumeur (figure 4b). Cependant, l'exposition à des rayonnements ionisants de 5 Gy, qui induit de manière robuste l'expression de p21 dans 10T1/2 les cellules n'ont pas réussi à induire l'expression de p21 dans ces cellules (données non présentées), ce qui suggère que p53 est fonctionnellement inactivé par un autre mécanisme que la perte génomique du TRP53 lieu. L'allèle p53 de type sauvage était invariablement absent dans les cellules dérivées de lésions mammaires chez les souris hétérozygotes p53. Dans les tumeurs conservant l'allèle p53 de type sauvage, nous ne pouvons pas exclure l'inactivation ou le gain de fonction de p53 par de petites lésions génétiques, telles que des mutations ponctuelles, bien que ces données suggèrent que l'inactivation fonctionnelle dans la grande majorité des lésions mammaires était due à la perte d'un région chromosomique significative ou un chromosome entier.

LOH de p53 Analyse Southern et PCR. (une) Analyse Southern représentative d'échantillons de tumeurs avec sonde exon IV commune au mutant (mut), de type sauvage (wt) et de pseudogène (Ψ), et quantification densitométrique. Notez que la plupart des tumeurs présentent une perte sans équivoque d'hétérozygotie avec un allèle de type sauvage indétectable. Les pistes 1 et 7 contiennent de l'ADN témoin p53 +/- extrait de foies sains post mortem. Les pistes 3, 6 et 12 présentent une LOH plus équivoque mais toujours significativement inférieure à celle de l'allèle mutant. (b) Analyse Southern représentative de lignées cellulaires dérivées de tumeurs montrant une p53 LOH claire dans toutes les lignées testées dérivées de souris p53 +/- T380A tandis que les deux copies semblent être conservées dans une lignée dérivée d'une souris T380A (piste 4). (c) Réaction PCR multiplex représentative couvrant la région de délétion. Notez p53 LOH fréquente avec rétention sans équivoque de l'allèle de type sauvage dans seulement deux tumeurs de souris p53 +/- T380A (pistes 5 et 6) et perte équivoque dans une (piste 29 qui est également mieux différenciée). () Immunohistochimie de la cycline E humaine d'une tumeur avec un contenu stromal relativement élevé (correspondant à la piste 6 dans le panneau a et à la piste 29 dans le panneau c). Grossissement d'origine × 400.

Nous avions précédemment observé une expression élevée du transgène de la cycline E humaine de type sauvage dans des tumeurs survenant chez des souris transgéniques fondatrices (Bortner et Rosenberg, 1997). Nous avons donc analysé les tumeurs mammaires pour l'expression du transgène par immunohistochimie et par analyse immunoblot. La plupart des tumeurs dérivées de lignées transgéniques étaient positives pour l'expression du transgène (tableau 2 et figure 3). C'était quelque peu inattendu car ces souris n'étaient ni gravides ni allaitantes. Le classement de la coloration immunohistochimique (figure 3g) était bien corrélé avec l'analyse immunoblot plus quantitative. Dans la grande majorité des tumeurs apparaissant dans les lignées portant l'allèle T380A, plus de 50 % du composant épithélial tumoral était immunoréactif à la cycline E humaine (classée ++). Dans les tumeurs où entre 10 et 50 % de la composante épithéliale s'est révélée positive (cote +), une variété de motifs de coloration a été observée bien que l'immunoréactivité soit faible ou absente dans les cellules présentant une métaplasie squameuse, en mitose ou adjacentes aux zones de nécrose. Les tumeurs pour lesquelles un diagnostic morphologique de carcinome épidermoïde a été attribué se sont révélées négatives.

L'incidence des tumeurs mammaires est liée à la parité chez les souris transgéniques cycline E

D'autres preuves liant la dérégulation de la cycline E et la tumorigenèse sont observées dans la relation entre la pénétrance tumorale et le nombre de grossesses subies par chaque femme (et donc des poussées d'induction transgénique). Bien que des efforts aient été faits pour limiter chaque femelle à deux grossesses, une troisième grossesse résultant de la copulation pendant l'oestrus post-partum était relativement courante. Par conséquent, plusieurs souris de chaque génotype ont en fait eu trois portées et dans deux cas quatre portées. Nous avons pu combiner ces données avec les taux de tumorigenèse chez les quelques femelles exclues de l'analyse originale car elles n'avaient qu'une seule portée pour étudier une relation putative entre la parité et la pénétrance tumorale. Nous avons anticipé que si au cours de chaque grossesse, de nouvelles lésions génétiques étaient induites dans des cellules capables de persister par involution, elles pourraient conduire à une corrélation entre le nombre de portées et l'incidence des tumeurs. Comme cette analyse n'était pas un objectif principal de l'étude, une analyse statistiquement rigoureuse du nombre relativement petit de souris avec une grossesse et du nombre relativement petit de catégories n'a pas été possible. Cependant, il y avait une tendance entre la parité et la pénétrance des tumeurs mammaires dans chacun des trois génotypes transgéniques qui ont ensuite développé des tumeurs mammaires avec l'incidence la plus élevée observée dans le groupe de souris ayant eu le plus grand nombre de grossesses (Figure 5). De plus, cette tendance n'a pas été observée chez les souris p53 +/- sans transgène. Bien que la parité semble réduire le risque de carcinome mammaire chez les souris p53 +/− sans transgène, en accord avec les attentes des études chez les rongeurs et les humains (Moon, 1969 Swanson et al., 1995 Thordarson et al., 1995 Hamilton et Mack , 2003), cette protection a été annulée chez les souris T380A et considérablement inversée chez les souris p53 +/- T380A.

La tumorigenèse mammaire est en corrélation avec la parité chez les souris transgéniques. (une) La parité confère une résistance à la tumorigenèse mammaire chez les souris p53 +/- qui est niée chez les souris T380A et inversée chez les souris p53 +/- T380A. m représente le nombre de souris dans chaque catégorie. (b) La tumorigenèse mammaire augmente avec la parité dans chacune des lignées transgéniques mais pas avec les souris p53 +/- dépourvues d'un transgène cycline E.

Les cellules épithéliales mammaires positives du transgène persistent par involution

L'analyse immunohistochimique des tumeurs a révélé que certains épithéliums mammaires non impliqués étaient immunopositifs pour la cycline E humaine, ce qui suggère que soit le transgène était activé tard dans la vie, peut-être par une influence hormonale dans la sénescence reproductive, soit que l'expression persistante du transgène se produit dans les cellules survivant après la mort. involution de la lactation. Pour tester cette hypothèse, nous avons examiné l'expression du transgène par immunohistochimie chez des souris de 6 semaines (2 semaines après la lactation) et de 8 semaines post-partum (au moment où l'involution est terminée) et dans l'épithélium mammaire de souris tuées prématurément en raison de non- néoplasmes mammaires ou causes non néoplasiques. Au cours du processus d'involution à 6 semaines post-partum, de nombreuses alvéoles positives étaient encore présentes bien qu'une sous-population de cellules immunoréactives ablumenales ait été observée dans certains canaux (Figure 6a). À 8 semaines après l'accouchement, l'involution était complète, comme déterminé par l'histologie et l'analyse de la monture entière. Cependant, quelques cellules épithéliales étaient encore immunoréactives et une sous-population de cellules immunoréactives ablumenales a été observée même dans les canaux plus petits (figure 6c). Cette sous-population était évidente chez toutes les souris porteuses de T380A post-lactationnelles et indique que certaines cellules dans lesquelles des lésions génétiques ont pu se produire persistent par involution. L'emplacement ablumenal de ces cellules suggère qu'elles pourraient représenter un type de cellules progénitrices épithéliales multipotentes (cellules basales) bien que, d'après une analyse préliminaire (données non présentées), elles ne semblent pas représenter le côté positif de l'antigène des cellules souches (SCA-1). (Welm et al., 2002). De plus, la population du côté abluménal est positive pour le transgène de la cycline E même chez les souris vierges âgées. Les glandes mammaires de souris transgéniques vierges âgées contiennent également des cellules épithéliales luminales à coloration positive, bien que moins nombreuses que chez les souris pares. Par conséquent, il semble probable que le promoteur BLG ovin utilisé dans ces études, et ceux d'autres, puisse manquer des éléments requis pour réprimer l'expression de BLG dans les cellules progénitrices épithéliales mammaires de souris.

Expression du transgène dans la glande mammaire post-lactationnelle. (une et b) 6 semaines après l'accouchement (2 semaines après la lactation) immunohistochimie de la cycline E et analyse de la monture entière. L'involution est presque complète avec la présence d'un petit infiltrat de cellules inflammatoires (flèches) mais déjà une sous-population de cellules basales immunoréactives est présente autour de certains canaux plus gros (têtes de flèches). Notez que HE12 est un anticorps monoclonal de souris et que l'utilisation d'un anti-souris secondaire sur des tissus de souris donne lieu à une coloration de fond dans le lait riche en immunoglobulines, le sérum sanguin et certains lymphocytes. (c et ) 8 semaines après l'accouchement (4 semaines après la lactation) immunohistochimie de la cycline E et analyse de la monture entière. L'involution est complète avec une pénurie de cellules inflammatoires mais il reste une sous-population de cellules basales immunoréactives (pointes de flèches) avec quelques cellules épithéliales alvéolaires immunoréactives. (e) Mi-lactation T380A immunohistochimie (2 semaines post-partum) pour comparaison. (F) Une zone immunoréactive d'hyperplasie alvéolaire focale chez une souris p53 +/- T380A tuée à 9,8 mois avec un lymphome. Le grossissement d'origine pour chaque panneau est indiqué dans le coin inférieur droit.

La perte précoce de p53 est augmentée chez les souris avec l'allèle T380A

Comme la latence de la tumorigenèse mammaire était encore importante et pour discriminer entre p53 LOH précoce et tardive, nous avons déterminé le taux d'inactivation de p53 dans les glandes mammaires de mi-lactation de souris primipares wild-tpye, p53, T380A et p53 T380A par une lecture indirecte de cycline Déréglementation B1. Cette approche a été adoptée, car la détermination directe de p53 LOH par in situ l'hybridation pour l'ARNm de p53 ou l'immunohistochimie était problématique pour un certain nombre de raisons. Premièrement, la mesure directe de p53 par immunohistochimie est techniquement difficile car les niveaux d'expression sont normalement extrêmement faibles. Deuxièmement, la détermination de TRP53 Le locus LOH nécessiterait une approche statistique dans laquelle un événement supposé être extrêmement peu fréquent serait masqué par un arrière-plan de cellules faussement négatives. En outre, le ciblage d'une région relativement petite de l'ADN supprimé dans le mutant (environ 350 pb) dans le bruit de fond du signal de la copie mutante serait difficile. Enfin, la mesure directe de l'ARNm in situ nécessiterait la détection d'un fragment de 106 pb de l'exon 5 délété dans la souche mutante, mais serait également confondue par l'existence d'un pseudogène traité. L'immunohistochimie et in situ l'hybridation de l'ARNm de p53 a été tentée sans succès.

Il a été établi dans les tumeurs humaines que la dérégulation de la cycline B1 est corrélée, au moins de manière aiguë, avec un statut p53 négatif (Innocente et al., 1999 Cui et Donehower, 2000 Krause et al., 2000 Park et al., 2000 Yin et al. ., 2001 Yu et al., 2002). Dans ces tumeurs, la cycline B1 est à la fois dérégulée par rapport au cycle cellulaire et est massivement surexprimée, même au point où la protéine mal repliée est traitée et présentée à la surface cellulaire pour déclencher une réponse immunitaire (Covini et al., 1997 Yu et al. , 2002). En conséquence, l'ajout de p53 fonctionnel restaure une régulation appropriée de la cycline B1 (Yu et al., 2002). Nous avons réalisé l'expérience complémentaire d'ablation partielle de la fonction p53 dans des fibroblastes embryonnaires de souris de type sauvage par expression rétrovirale du papillomavirus humain E6 (figure 7c). After 3-days growth with repeated daily infection, western analysis demonstrated increased levels of cyclin B1 in the E6-infected cells when compared to those infected with the empty vector. Cyclin A levels were comparable between the cultures indicating that this was not due to significant perturbation of the cell cycle. Furthermore, immunofluorescence microscopy demonstrated that this was the case throughout the cell cycle (Figure 7d). Thus even with only partial knockdown of p53 function typical of HPV E6 expression, there is a significant deregulation of cyclin B1 expression. Analysis of midlactation mammary glands by cyclin B1 immunohistochemistry revealed occasional intensely staining cells individually or in clusters (Figure 7a). This staining is distinct from cyclin B1 immunopositivity associated with cell proliferation, as similar analysis of rapidly proliferating tissues by the same technique revealed much lower staining intensities (data not shown). Staining in the tumors of the present study showed little or no expression except in occasional isolated foci of cells with low staining intensities in comparison to the midlactation studies. We interpret this as a transient and acute phenomenon that may be selected against with further tumor growth as cyclin B1 may act as a tumor antigen (Yu et al., 2002).

Indirect assessment of p53 loss by cyclin B1 immunohistochemistry. (une) Cyclin B1 immunohistochemistry in 2-week post-partum midlactation mammary glands showing isolated (arrows) strong staining in glands from T380A and multicellular clusters staining positive in p53 +/− T380A mice. (b) The number of cyclin B1-positive cells was increased in the glands of p53 +/− T380A mice. Data represent the normalized means of 2–4 mice from each genotype five sections per primiparous mouse corresponding to the five glands from the right side of each animal. (c et ) Increased cyclin B1 expression in mouse embryonic fibroblasts with E6 at all stages of the cell cycle correlating B1 overexpression with p53 inactivation (c) by Western blot (WB), and immunofluorescence (IF), and () quantitation of IF cyclin B1 staining intensity. * P<0.001 by ANOVA.

Assessing p53 loss of function by cyclin B1 immunopositivity in midlactation mammary glands provided a number of important mechanistic insights. First, the frequencies of cyclin B1 immunopositive (presumably p53 null) cells associated with the different genotypes mirrored to a striking extent the relative frequencies of mammary tumorigenesis (compare Figure 7b to 2b). The frequency of strongly cyclin B1 immunopositive cells in the p53 +/− T380A mammary glands vastly exceeded combined frequency associated with the p53 +/− and T380A glands. These data suggest, therefore, that the number of p53 null cells generated underlies the probability of developing a mammary tumor. These data are consistent with deregulation of cyclin E driving LOH. Of course, a caveat inherent in these interpretations is that the assumption that cyclin B1 immunoreactivity is always equivalent to p53 nullizygosity cannot be proven. However, the remarkable parallel between cyclin B1 immunoreactivity and mammary tumor frequency strongly supports the validity of this assumption.


Résultats

A population of freshly isolated mouse mammary gland cells forms mammospheres. Based on the established culture condition for human mammospheres ( 10), we tested various conditions for growing mouse mammospheres and opted to use the optimized medium containing 20 ng/mL EGF and 20 ng/mL bFGF. After 7 days of culture in this medium in a low-attachment culture plate, about 6 mammospheres with diameters >40 μm were formed per 10,000 freshly isolated mammary epithelial cells ( Fig. 1 Table 1, Experiment 1). The mammospheres contained an average of ∼250 cells, and similar numbers of sphere-forming cells were observed using cells isolated from C57BL/6J and FVB mice.

We attempted to use immunostaining and FACS to identify the fraction of mouse mammary gland cells that could form mammospheres. The tested antigens for immunostaining included CD24, a marker whose absence or expression at low levels characterizes human tumorigenic breast cancer cells ( 4) PrP and endoglin, both surface markers for mouse HSCs ( 12, 13, 17) and CD49f, a marker for in vivo repopulating mammary gland epithelial stem cells ( 7). The surface expression of these antigens in freshly isolated cells was analyzed by flow cytometry ( Fig. 1).

A representative FACS plot showed that 39.9% of total cells were negative for CD24 staining (CD24 − Fig. 1, CD24). Cells staining positively for CD24 (CD24 + ) could be further fractionated into CD24 med (4.2% of total cells) and CD24 high (54.0% of total cells) based on the relative levels of CD24 surface expression. The whole-cell population could also be fractionated into PrP − (92.5% of total cells), PrP med (5.1% of total cells), and PrP high (1.8% of total cells) based on PrP staining ( Fig. 1, PrP). Use of endoglin as a marker allowed fractionation into endoglin − (93.4%) and endoglin + (5.1%) subpopulations ( Fig. 1, Endoglin) similarly, scoring for the CD49f marker allowed fractionation into CD49f − (94.8%) and CD49f + (4.7%) subpopulations ( Fig. 1, CD49f). We also obtained the profiles of cells stained for CD24, PrP, endoglin, and CD49f in combination. We found that 4.2% of total mammary epithelial cells were CD24 + CD49f + , of which 8.4% and 20.7% were PrP + endoglin + and PrP + endoglin − , respectively ( Fig. 1, CD24 PrP Endoglin CD49f).

To identify the subpopulations of cells in the mouse mammary glands that were capable of forming mammospheres, we first plated freshly isolated CD24 − , CD24 med , and CD24 high cells in sphere-forming conditions. Only CD24 + cells, including both CD24 med and CD24 high cells, grew into typical mammospheres ( Fig. 1, droit Table 1). The majority of sphere-forming ability resided in the CD24 high cells. In one of our experiments ( Table 1, Experiment 1), 10,000 CD24 high or CD24 med cells generated an average of 9.2 or 1.2 spheres, respectively, whereas the same numbers of CD24 − cells formed no spheres. Hence, freshly isolated mammosphere-initiating cells expressed CD24 at readily detectable levels.

We also tested the mammosphere-forming abilities of cells fractionated based on their cell surface expression of either PrP or endoglin. Whereas cells with no or high PrP staining formed none or few spheres, respectively ( Table 1), PrP med cells were capable of generating far more spheres, yielding ∼8.5 mammospheres per 10,000 cells in a representative experiment ( Fig. 1 Table 1, Experiment 1). Sphere-forming cells also resided in the endoglin + fraction (8.2 ± 1.6 spheres/10,000 cells) but very few in the endoglin − fraction (0 sphere/10,000 cells Fig. 1 Table 1, Experiment 1) as well as in the CD49f + fraction (4.2 ± 1.5 spheres/10,000 cells Table 1, Experiment 1) conversely, almost no mammosphere-forming cells were present in the CD49f − population (0.7 ± 0.2 sphere/10,000 cells Fig. 1 Table 1, Experiment 1). We repeated the mammosphere-forming experiment and observed the same trend ( Table 1, Experiment 2).

When we fractionated cells based on their cell surface expression of the CD24, PrP, endoglin, and CD49f markers, 10,000 CD24 + PrP + endoglin + CD49f + cells were capable of forming an average of 19.2 spheres ( Table 1, Experiment 1). This sphere-initiating activity is higher than that of CD24 high , PrP med , or endoglin + cells. We noticed that the CD24 + endoglin + CD49f + fraction contains largely PrP med cells ( Fig. 1). Overall, this indicated that CD24 + PrP med endoglin + CD49f + mouse mammary epithelial cells are enriched for mammosphere-initiating cells.

Cultured mammary gland cells have altered surface phenotype of mammosphere-initiating cells. We next tested whether in vitro culture of the mouse mammary gland cells could affect their display of critical cell surface markers as well as sphere-forming activity. To this end, mouse mammary glands were isolated and organoids were cultured for 6 days before immunostaining. The surface expression of CD24, PrP, endoglin, CD49f, and CD44 in cells from cultured organoids was then analyzed, as before, by flow cytometry ( Fig. 2UNE).

A representative FACS plot of such precultured mammary gland cells revealed that 12% of total cells were CD24 − ( Fig. 2A, plot 1). In either the CD24 − or the CD24 + fraction, about two thirds of the cells were PrP + (plot 1). PrP + and PrP − cells could be further fractionated by endoglin staining (plot 2). In addition, we also examined the surface coexpression of CD44 or CD49f with CD24, PrP, and endoglin. Two thirds of CD44 + cells were CD24 − (plot 3). Half of CD49f + cells were also endoglin + (plot 4). Hence, such in vitro culture resulted in an increase in those cells expressing certain markers, such as CD24, PrP, endoglin, and CD49f.

We undertook to investigate the effects of this in vitro culture on the subsequent ability of the mammary cells to generate spheres in vitro. In these experiments, we chose to focus on CD24, PrP, and endoglin as cell surface markers. Using the same sphere-forming conditions as in Fig. 1 and Table 1, we observed that precultured cells formed numbers of mammospheres comparable with those arising from freshly isolated cells. Thus, whereas 10,000 freshly isolated mammary epithelial cells yielded an average of 6.1 spheres, an average of 4.1 mammospheres were generated from 10,000 precultured mammary gland cells ( Fig. 2B, left). This indicated that propagation of mouse mammary epithelial cells in monolayer cultures did not yield a significant change in the proportion of sphere-forming cells. The mammospheres formed by precultured cells had an average diameter of 100 μm ( Fig. 2B, left).

We then examined which subpopulations of precultured cells could form mammospheres. When we plated precultured CD24 + and CD24 − cells in sphere-forming conditions, to our surprise, only CD24 − cells grew into mammospheres ( Fig. 2B, right). CD24 − cells (10,000) generated an average of 16.7 spheres with a diameter of 162 μm. In contrast, CD24 + cells formed only small irregular aggregates composed of several cells ( Fig. 2B, middle). Hence, after preculturing (6 days of in vitro growth of organoids before mammosphere culture), mammosphere-initiating cells resided exclusively in the CD24 − fraction. This was in contrast to the behavior of freshly isolated mammary epithelial cells, in which the sphere-initiating activity resided in the CD24 + fraction.

We further subfractionated the CD24 − fraction of precultured cells into PrP + and PrP − populations and tested the sphere-initiating capability of each of these subpopulations. Whereas CD24 − PrP − cells were capable of growing into larger spheres, CD24 − PrP + cells produced smaller spheres. In a representative experiment ( Fig. 2C), 400 precultured CD24 − PrP − cells generated 1 sphere with an average diameter of 201 μm, whereas the same number of precultured CD24 − PrP + cells generated spheres with an average diameter of 146 μm. When we plated 200, 100, or 50 cells from these CD24 − PrP + and CD24 − PrP − fractions, they all generated a single sphere. In addition, in all cases, CD24 − PrP − cells formed larger spheres ( Fig. 2C). Therefore, in contrast to freshly isolated cells, in which the sphere-initiating cells are enriched in the PrP med fraction, precultured cells contain PrP − cells as their major sphere-initiating population.

When we fractionated precultured cells based on their cell surface expression of CD24, PrP, and endoglin, the CD24 − PrP − endoglin + cells formed the greatest numbers of mammospheres these were also the largest in size. Table 2 summarizes the results of mammosphere formation by these various cell populations in a representative experiment. For example, 2,000 of CD24 − PrP − endoglin + cells generated an average of 1 sphere with an average diameter of 138 μm. The same number of CD24 − PrP − endoglin − cells produced 1 sphere with a diameter of 70 μm. As expected, CD24 − PrP + endoglin + and CD24 − PrP + endoglin − cells produced smaller spheres at lower frequencies than CD24 − PrP − endoglin + cells. Therefore, the CD24 − PrP − endoglin + fraction of the precultured cells is enriched for sphere-initiating cells.

In summary, the surface phenotype of mammosphere-initiating cells changes dramatically following in vitro culture. For freshly isolated cells, CD24 + PrP med endoglin + cells are enriched for sphere-initiating cells following culture, sphere-initiating cells are enriched in the CD24 − PrP − endoglin + population.

Table 2 also shows that, as we progressively reduced the number of cells introduced into the sphere culture, we observed fewer and smaller spheres. Nevertheless, a sphere could be generated by as few as five plated precultured CD24 − PrP − cells ( Table 2), indicating that this cell population is highly enriched for sphere-forming cells. We were therefore intrigued to know whether a mammosphere can be formed from a single initiating cell introduced into the sphere culture.

Two approaches were adopted to address this possibility. In the first, mammary gland cells isolated from GFP + and control non–GFP-expressing mice were mixed in a ratio of 1:10 and plated for sphere formation. If the sphere is initiated from a single cell, then ∼10% of finally formed spheres should be formed exclusively by GFP + cells. However, as the result showed, 9% of spheres were composed largely of GFP + cells, and 10% of these were formed exclusively from GFP + cells ( Fig. 3UNE), whereas the remainder was a mix of GFP + and GFP − cells. Therefore, only 0.9% of spheres contained exclusive GFP + cells. This suggests that the majority of spheres were formed by more than a single initiating cell.

In the second approach, we isolated cells from the primary mammospheres and plated individual cells into each well of a 96-well plate by serial dilution. We observed that 5% of the wells inoculated with single cells formed sphere-like structures ( Fig. 3B). However, these sphere-like structures were generally smaller in size compared with the mammospheres that we typically observed. Because of the positive correlation of the size of the sphere structure and the introduced cell number ( Table 2 data not shown), we propose that single cells generally tend to form smaller spheres or sphere-like structures and that accessory cells may help to form the larger mammospheres that we typically observed. Alternatively, smaller sphere-like structures may adhere to one another and grow into larger mammospheres.

Mammospheres contain mammary gland–repopulating cells. We sought to determine whether the cells present in mammospheres could repopulate the entire mammary gland following engraftment into cleared mammary fat pads. To this end, we isolated mammospheres formed by precultured GFP + CD24 − PrP − cells and also collected all the precultured GFP + CD24 − PrP + cells, which only formed the amorphous nonsphere cell aggregates. We then trypsinized these various cells and transplanted 2,000 of each of these dissociated cell populations into cleared fat pads of recipients. Whereas 2,000 cells from mammospheres derived from the CD24 − PrP − fraction generated entire mammary ductal trees, 2,000 of the cultured CD24 − PrP + cells failed to do so ( Fig. 4UNE). This suggests that some mammospheres contain stem cells that have the in vivo repopulating activity.

In other studies, Mani et al. (ref. 18 and footnote 5 ) suggested that there is a link between the property of MGSCs and epithelial-mesenchymal transition (EMT). It was shown that freshly isolated MGSCs reduced expression of E-cadherin and increased expression of N-cadherin and Smad-interacting protein 1 (SIP1 ref. 18 and footnote 5 ). We therefore examined the expression of relevant genes in cultured sphere-forming cells. As Fig. 4B shows, when compared with freshly isolated nonstem cells, cultured sphere-forming cells had increased expression of EMT markers N-cadherin, vimentin, and SIP1 but decreased levels of epithelial-specific transcription factors, such as E-cadherin, cytokeratin 14, and cytokeratin 18. This further suggests that cultured sphere-forming cells shared the similar molecular machinery as freshly isolated stem cells.

Cytogenetic analysis of mammosphere-forming cells. To get insight into karyotype constitution of mouse mammary cells after culture, we sought to conduct spectral karyotyping of freshly and precultured mammosphere-forming cells. Due to the very small numbers and very slow proliferation of these cells, it was practically impossible to undertake cytogenetic analysis immediately after the FACS. Accordingly, we expanded both FACS-fractionated freshly isolated and precultured mammosphere-forming cells by additionally culturing them until we could obtain minimal numbers of mitotic cells for harvest and analysis. After ∼3 weeks in culture, we were able to obtain a few metaphase spreads from both cell types. All available metaphases were counted for chromosome number, whereas a limited number of metaphases with less contracted chromosomes were hybridized for SKY analysis. Under those experimental conditions, both originally freshly isolated and precultured cells exhibited aneuploidy (Supplementary Fig. S1) with chromosome numbers ranging from hypodiploid (35) to hypertetraploid (88). Yet, both samples contained a distinct fraction of true diploid and tetraploid cells.

The SKY analysis provided an insight, albeit limited in size and scope, into structural karyotypic features of freshly isolated and precultured mouse mammary cells. None of the karyotypes from freshly isolated cells (Supplementary Fig. S2UNE et B), regardless of their ploidy status, contained structurally rearranged chromosomes, such as derivatives resulting from deletions or translocations. Precultured cells, on the other side, in addition to diploid or near-diploid karyotypes without structural rearrangements (Supplementary Fig. S2C), exhibited sporadic, nonrecurrent structural chromosomal rearrangements (Supplementary Fig. S2 et E), such as translocations t(619), t(612), and t(78).


Discussion

In the present study, we analyzed development of mammary tumors in a conditional mouse model with the p53.R270H missense mutation, equivalent to human R273H, targeted into the genome of the mouse. Importantly, the wild-type and mutant p53 proteins are expressed at physiologic levels ( 19). hétérozygote p53 R270H/+ mice developed a high frequency of spontaneous mammary tumors after tissue-specific expression of the p53.R270H mutation using WAPCre souris. The mean latency time for tumor development in p53 R270H/+ WAPCre mice was strongly reduced when compared with previous studies with tissue-specific transplantation models ( 16), even though the BALB/c mouse strain used in the earlier studies is much more sensitive for mammary tumor development than C57BL/6 / 129 mice ( 11, 36), the genetic background of mice used here.

We here show that heterozygous loss of p53 in p53 F2−10/+ WAPCre mice does not predispose for spontaneous mammary tumors up to 48 weeks after Cré expression, whereas, at this time point, 64% of p53 R270H/+ WAPCre mice had developed one or more mammary gland tumors ( Fig. 3UNE). These observations clearly show that the p53.R270H mutation may have dominant-negative properties. In addition, comparison of mammary tumor development in p53 R270H/+ WAPCre mice with p53 R270H/F2−10 et p53 F2−10/F2−10 mice 5 reveals that latency times are not significantly different between the three genotypes (P = 0.86). These results point towards a lack of gain of function mechanisms of the p53.R270H mutant in the mammary gland. Interestingly, because in a previous study Olive et al. ( 19) did show gain of function properties of this p53 mutant allele mainly in the lung using the same mouse model, gain of function properties of p53 apparently are tissue specific. In summary, mammary tumor development in p53 R270H/+ WAPCre mice is evidently not simply caused by functional inactivation of one p53 allele, but rather shows functional inactivation of both alleles through dominant-negative action of mutant p53, as also described previously for these mice ( 19). Further indication for this was provided by LOH analysis of spontaneous p53 R270H/+ WAPCre tumeurs. Although we observed the majority of mammary tumors (partly) losing the wild-type p53 allele, the wild-type fragment could still be detected, indicating that a proportion of tumor cells retained the wild-type p53 allèle. We therefore hypothesize that the p53.R270H mutation has a dominant-negative effect in early stages of mammary tumorigenesis, resulting in overall genome instability, followed by LOH later in tumor development. However, to address this, further studies are needed in analyzing LOH in preneoplastic stages of mammary gland development in p53 R270H/+ WAPCre souris.

Tumor types found were adenocarcinomas and (carcino)sarcomas, the former also frequently found in human breast cancer patients, the latter uncommon in mammary glands of mice and man. In general, sarcomas are often found in p53 +/− mice ( 8) and Li-Fraumeni syndrome patients ( 9), but no sarcomas of the mammary gland were reported thus far. However, (carcino)sarcomas of the mammary gland were found recently in conditional p53 F2−10/F2−10 K14Cre mice, with homozygous p53 deletion of exons 2 to 10 in epithelia, 6 pointing towards a role for defective p53 in mammary sarcoma development.

Apart from mammary gland tumors, some untreated p53.R270H mutant mice developed additional tumors. Expression of the p53.R270H mutation seemed to be not exclusively restricted to the mammary gland, but was also visible in some tumors and kidneys of older mice. This is most likely caused by some Cré expression in other tissues than the mammary gland, as was also described by others ( 18, 27). Another possibility is minor leakiness of the stop cassette, resulting in low levels of transcription of the mutant p53 allele in some tissues when mice age.

Steroid status is one of the main differentiating characteristics of human breast cancer. About 70% of human breast tumors are estrogen receptor α positive and estrogen receptor dependent however, mouse models rarely produce estrogen receptor α–positive mammary tumors ( 32). Therefore, it would be highly valuable to have mouse models developing estrogen receptor α–positive as well as estrogen receptor α–negative mammary tumors to study the factors that control estrogen receptor α expression and the effect of therapeutics. In the present study, mammary tumors of both estrogen receptor types were found in p53 R270H/+ WAPCre mice, with the pattern of estrogen receptor α expression (groups of contiguous cells) similar to that found in human breast carcinomas ( 37). These results resemble those reported recently ( 18), where homozygous conditional deletion of mouse p53 in mammary epithelial cells by WAPCre also led to estrogen receptor α–positive mammary tumors in mice. Apparently, inactivation of p53 induced by WAPCre expression, either through complete loss of both alleles or expression of mutant variants, directs estrogen receptor α–positive tumor development.

It is generally agreed that environmental factors and somatic genetic events are the predominant contributors to the development of sporadic cancer. Whether exposure to environmental compounds also has a significant effect on cancer development in the presence of an inherited, dominant mutant p53 allele was examined by exposing p53 R270H/+ WAPCre mice to the mammary carcinogen DMBA. Others have shown cooperation of DMBA with p53 mutation or p53 deficiency in several studies ( 11, 16). Here, latency time of DMBA-induced mammary tumors in p53 R270H/+ WAPCre mice was shortened compared with untreated mice when mice were treated at a very young age (28-70 days), a period encompassing mammary gland development and terminal end bud proliferation and maturation. Interestingly, the latency time for mammary tumor development in older (98-140 days) DMBA-treated p53 R270H/+ WAPCre mice is similar to untreated p53 R270H/+ WAPCre mice (data not shown), indicating that age at the time of exposure is a significant factor in mammary tumor development. No histologic differences were observed between spontaneous and DMBA-induced mammary tumors, with estrogen receptor α–positive and –negative tumors found in all groups. A small difference was found in the grade of estrogen receptor α positivity: DMBA-induced tumors stained slightly more positive (data not shown).

Expression profiles of specific genes seemed to change during mammary tumor development in both DMBA-treated as well as untreated mice. Interestingly, the breast tumor–related oncogene cyclin D1 is specifically induced in DMBA-treated tumors, in line with previous results obtained with DMBA-treated rats ( 38, 39). In contrast, other cyclins are down-regulated, which was unexpected because expression levels of these genes are frequently induced in mouse mammary tumors ( 40). The clearest example for this is cyclin G. Presumably, this reflects the p53 dependence of this gene because we showed before that p53.R270H embryonic stem cells display diminished activation of cyclin G after γ-irradiation compared with wild-type cells ( 26). As a result, in mammary gland tumors solely consisting of p53 mutant cells, levels of cyclin G will be much lower compared with noncancerous mammary glands also containing cells that do not express the R270H mutant protein. Indeed, comparing expression profiles of p53-mutant mammary glands with those of wild-type littermates reveals cyclin G and other genes differentially expressed, underscoring the p53 dependency of these genes and the disturbance of RNA expression levels in R270H mutant mammary glands.

Differences exist in gene expression profiles in tumors obtained from untreated and DMBA-treated p53 R270H/+ WAPCre mice, limited to a few selected genes like GADD45, cyclin D1 et cyclin D3, Ki67, et Noxa. Les niveaux de GADD45, a well-known DNA damage and p53 responsive gene, were slightly induced in untreated tumors, whereas in DMBA-induced tumors levels were decreased. This difference may well be explained by the role GADD45 is playing in nucleotide excision repair, a repair system recognizing DMBA-induced adducts ( 41). Niveaux de GADD45 in normal mammary glands might be higher in DMBA-treated than in untreated mice to facilitate DNA repair in response to the introduction of DNA damage. Indeed, expression levels of GADD45 are twice higher in mammary glands of DMBA-treated mice compared with those of untreated p53 R270H/+ WAPCre mice (data not shown), explaining the relative difference of GADD45 levels in tumors. Another explanation could be the selective proliferation of cells with low repair capacity into preneoplastic lesions. Clearly, these primary expression analyses reveal unique signatures for p53 mutant and carcinogen-induced mammary tumors. In addition, we found some human relevant breast cancer genes up-regulated in mammary tumors of p53 R270H/+ WAPCre mice (i.e., cyclin D1, a breast tumor related oncogene found up-regulated in 35% of human breast cancers, and Ki67, frequently coexpressed with estrogen receptor α in estrogen receptor α–positive human tumors). These results, although the number of genes analyzed is low, are interesting, in that they show that molecular events underlying mammary gland tumor development in the p53 R270H/+ WAPCre mouse model may be, at least to some extent, similar to those occurring in human breast cancer development. However, to identify the cooperating oncogenic events in the development of mammary tumors in p53 R270H/+ WAPCre mice, a genome-wide analysis of both spontaneous and DMBA-induced tumors needs to be done.

In conclusion, conditional knock-in mouse models (as the p53.R270H mutant), with mutations equivalent to those found in humans targeted into the mouse genome, show tumor responses and tumor types highly comparable to human cancer. As such, these models are very suitable to establish precise genotype-phenotype relationships between p53 hotspot mutations found in humans and tumorigenesis in specific tissues like the breast. Ultimately, these highly human relevant mouse models can be used to study the effectiveness of novel cancer therapies.


Résumé

Insulin-like growth factor I (IGF-I) is known to regulate mammary gland development. This regulation occurs through effects on both cell cycle progression and apoptosis. Our laboratory has studied the IGF-I-dependent regulation of these processes by using transgenic and knockout mouse models that exhibit alterations in the IGF-I axis. Our studies of transgenic mice that overexpress IGF-I during pregnancy and lactation have demonstrated that this growth factor slows the apoptotic loss of mammary epithelial cells during the declining phase of lactation but has minimal effects during early lactation on milk composition or lactational capacity. In contrast, our analysis of early developmental processes in mammary tissue from mice carrying a targeted mutation in the IGF-I receptor gene suggests that IGF-dependent stimulation of cell cycle progression is more important to early mammary gland development than potential anti-apoptotic effects. With both models, the effects of perturbing the IGF-I axis are dependent on the physiological state of the animal. The diminished ductal development that occurs in response to loss of the IGF-I receptor is dramatically restored during pregnancy, whereas the ability of overexpressed IGF-I to protect mammary cells from apoptosis does not occur if the mammary gland is induced to undergo forced involution. Data from our laboratory on the expression of IGF-signaling molecules in the mammary gland suggest that this effect of physiological context may be related to the expression of members of the insulin receptor substrate family.


Download gratis en vrijblijvend de informatiebrochure

Top 10 meest aangevraagd

Ontdek 90.454 producten om je volledige potentieel mee te bereiken. Bekijk de top 10 gerelateerd aan Biologie:

Lactation Biology

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Coursera (CC)

Proefdierkunde Hbo Biotechnicus

  • BTW: Vrij van BTW
  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
  • Extra informatie:Het minimum aantal deelnemers is drie. Meer informatie lees je bij Overige informatie – Kosten.
Hogeschool Utrecht

Leraar Biologie tweedegraads

  • BTW: Vrij van BTW
  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
  • Extra informatie:Bereken welk tarief voor jou geldt Bekijk de financieringsmogelijkheden van de Lerarenbeurs
Hogeschool Utrecht

Master Leraar Biologie

  • BTW: Vrij van BTW
  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
  • Extra informatie:Dit is het minimale collegegeldtarief per jaar. Bereken welk tarief voor jou geldt Bekijk de financieringsmogelijkheden van de Lerarenbeurs
Hogeschool Utrecht

Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek (Life Sciences)

  • BTW: Vrij van BTW
  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
  • Extra informatie:Dit is het minimale collegegeldtarief per jaar. Bereken welk tarief voor jou geldt. Bekijk de mogelijkheden voor een tegemoetkoming in de studiekosten.
Hogeschool Utrecht

Biology: Animal development: We're just tubes

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Académie Khan

Biology: Natural Selection

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Académie Khan

Biology: Ape clarification

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Académie Khan

Biology: Speciation: Of ligers & men

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Académie Khan

Biology: Variation in a species

  • Volledigheid prijs: Deze prijs is volledig. Er zijn geen verborgen bijkomende kosten.
Académie Khan

Verder leren? Het begint op Springest.nl

  • Meer dan 90.000 cursussen, opleidingen, trainers, coaches, e-learning en incompany trainingen.
  • Ruim 115.000 onafhankelijke ervaringen helpen je kiezen voor de beste opleiders.
  • Hulp bij het zoeken en inschrijven
  • Gratis informatie aanvragen
  • Klaar om te gaan leren? Schrijf je direct in, gratis annuleren is mogelijk!
  • Ook voor leren in je organisatie.

Kies de richting van je persoonlijke ontwikkeling

Over Springest

Springest is dé site waar je alles vindt voor je persoonlijke ontwikkeling. Zoek, vergelijk en kies uit 88.000 producten, zoals trainingen, cursussen, opleidingen, webinars, coaches, e-books, incompany trainingen, evenementen en behandelingen van meer dan 8.100 verschillende aanbieders. Bekijk ook onze NL Leert Door pagina, Springest helpt Nederland ook in de coronacrisis met leren.

Ons rapportcijfer Onze bezoekers geven ons een Star8,8 in 711 reviews op The Feedback Company. Leren & corona: klassikaal met 1,5m maatregelen. Thuis met:computer 15.000 e-learnings

Discussion

Although several reports have suggested that increased Lcn2 expression in breast cancer may be detrimental (8, 11, 26), the precise in vivo role of Lcn2 in breast cancer initiation and progression has been challenging to define. In this study, we have shown that Lcn2 is important for PyMT-induced mammary tumor initiation and growth. Previous studies employed xenograft models to elucidate the role of Lcn2 in breast cancer, a methodology that cannot emulate the multistage nature of human breast cancer progression. We have used the well-characterized MMTV-PyMT mouse model (12) to show that genetic ablation of Lcn2 leads to a significant reduction in palpable mammary tumors in both the 129/Ola and C57/B6 backgrounds. Interestingly, the development of multifocal dysplastic lesions, the earliest event in PyMT-induced mammary cancer initiation, was not affected by a lack of Lcn2. These results point to the involvement of Lcn2 only in the later stages of primary mammary tumor progression.

The most striking result arising from our study was the dramatic drop in mammary tumor burden in virgin female Lcn2-deficient mice at ∼20 weeks of age. Although almost all Lcn2 +/+ PyMT mice had reached the maximum permitted tumor burden by this age, no Lcn2 −/− PyMT mouse had accumulated sufficient tumors to warrant sacrifice. These data point to a role for Lcn2 in primary tumor development that is consistent with published reports, and confirm Lcn2 as an important oncogenic factor in PyMT-induced mammary tumorigenesis.

Lcn2 reportedly forms a complex with MMP-9 that prevents autodegradation of this enzyme and thus sustains its activity. MMP-9 promotes cancer progression by perforating cellular basement membranes, degrading the ECM, and liberating vascular endothelial growth factor. Angiogenesis, invasion, and metastasis are thus all indirectly enabled by Lcn2. In our study, we detected a statistically significant but slight reduction in MMP-9 activity in the plasma of tumor-bearing Lcn2 −/− PyMT B6 mice compared with Lcn2 +/+ PyMT B6 mice. However, this reduction represents only a small decrease in total MMP-9 activity and likely does not explain the markedly decreased tumor burden in Lcn2-deficient mice. Indeed, Martin et al. showed that MMP-9 −/− MMTV-PyMT mice do not show any difference in primary mammary tumor burden compared to MMP-9 +/+ MMTV-PyMT controls (20), indicating that MMP-9 is not critical for PyMT-induced mammary tumor formation. Consequently, Lcn2’s oncogenic role is at best only partly dependent on its ability to stabilize MMP-9. Intriguingly, MMP-9 −/− MMTV-PyMT mice do show a decrease in mammary tumor-derived lung metastases but only in mice of the C57BL/6 background (20). In our study, we were unable to detect a statistical difference in metastasis formation in the absence of Lcn2, regardless of genetic background. These findings reinforce the notion that Lcn2 acts as an oncogene independently of MMP-9.

Several groups have advanced other hypotheses as to how Lcn2 might exert its oncogenic function. These theories include induction of the epithelial-to-mesenchymal transition (11) and inhibition of the PI3K/Akt pathway (19). We are currently investigating these potential mechanisms in our Lcn2 −/− PyMT mice.

In conclusion, our in vivo analyses of genetically modified tumor-prone mice have identified Lcn2 as an oncogene important for the later stages of primary mammary tumor development but not for the formation of lung metastases. The precise mechanism underlying this oncogenic function of Lcn2 appears to differ from its bacteriostatic function but remains to be fully elucidated. Future studies may pinpoint Lcn2 as a candidate therapeutic target for human breast cancer.


Matériel électronique supplémentaire

Differentially expressed between time points 1 h and 24 h in un-inoculated control cells

Fichier supplémentaire 1 : . Lists of differentially expressed genes between time points 1 h and 24 h of un-inoculated control cells. Gene symbol, log2 fold changes as well as Entrez gene names are provided for each of the two paternally inherited SCS-BTA18-QTL alleles. Genes were selected on the basis of FDR adjusted p-values of q ≤ 0.05. (XLS 55 KB)

List of genes showing a significant co-expression in time-course after inoculation with heat inactivated

Additional file 2: E. coli et S. aureus in SCS-BTA18-Q and SCS-BTA18-q cells, respectively. Significantly co-expressed genes in S. aureus et E. coli inoculated SCS-BTA18-Q and SCS-BTA18-q cells identified using the clustering algorithm implemented in the short time-series expression miner STEM [28, 29] (version 1.3.6). Only genes with a fold change of log2 fc ≥ 0.75 in time-course were considered. Significance was assessed based on the non-random co-expression of genes by comparing the number of genes assigned to a specific co-expression profile model to the expected number of genes assigned to the co-expression profile model quantified by permutation. The number of the profile, the human gene symbol and the log fold changes for time points 0 h, 1 h, 6 h and 24 h are shown. (XLS 134 KB)