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Comment les protéines de liaison simple brin sont-elles éliminées du brin retardé lors de la réplication de l'ADN ?


Le brin retardé, en aval du fragment d'Okazaki, est recouvert de protéines de liaison simple brin (SSBP) lors de la réplication de l'ADN. Quel est le mécanisme qui garantit que les SSBP sont supprimées du brin retardé pour permettre la liaison du prochain fragment d'Okazaki ?


En fait, il a été prouvé que les SSBP gardent les bases tournées vers l'extérieur afin que l'ADN polymérase puisse toujours répliquer le brin retardé avec les SSBP dessus. Il y a également eu d'autres preuves qu'ils peuvent apparaître spontanément.

Vous pouvez en savoir plus à ce sujet en regardant les conférences sur https://www.edx.org/course/molecular-biology-part-1-dna-replication-and-repair


Transfert d'amorce d'ARN dans la réplication de l'ADN du bactériophage T4 : le rôle de la protéine de liaison à l'ADN simple brin et des protéines accessoires de la polymérase

Dans le phage T4, la synthèse coordonnée de l'ADN des brins principaux et retardés est réalisée par un complexe à huit protéines appelé réplisome. Le contrôle de la synthèse d'ADN à brins en retard dépend d'un réplisome hautement dynamique avec plusieurs protéines entrant et sortant pendant la réplication de l'ADN. Ici, nous examinons le rôle de la protéine de liaison simple brin (gp32) dans les cycles répétitifs de la synthèse des brins en retard. L'élimination du domaine interagissant avec les protéines de gp32 entraîne une réduction du nombre d'amorces synthétisées et de l'efficacité du transfert d'amorce vers la polymérase. Nous constatons que la protéine primase est modérément processive, et cette processivité dépend de la présence de gp32 pleine longueur à la fourche de réplication. Étonnamment, nous constatons qu'une augmentation de l'efficacité du transfert d'amorce à la protéine clamp est en corrélation avec une diminution du taux de dissociation de la primase du réplisome. Ces découvertes aboutissent à un modèle révisé de synthèse d'ADN à brins en retard où la primase reste dans le cadre du réplisome après chaque cycle réussi de synthèse de fragments d'Okazaki. Un retard dans le transfert de l'amorce entraîne une probabilité accrue de dissociation de la primase de la fourche de réplication. L'interaction entre gp32, primase, clamp et clamp loader dicte la vitesse et l'efficacité de la synthèse des amorces, du recyclage de la polymérase et du transfert des amorces vers la polymérase.


Biologie 171

À la fin de cette section, vous serez en mesure d'effectuer les opérations suivantes :

  • Expliquer le processus de réplication de l'ADN chez les procaryotes
  • Discuter du rôle des différentes enzymes et protéines dans le soutien de ce processus

La réplication de l'ADN a été bien étudiée chez les procaryotes principalement en raison de la petite taille du génome et de la grande variété de mutants disponibles. E. coli a 4,6 millions de paires de bases dans un seul chromosome circulaire et tout est répliqué en environ 42 minutes, en partant d'un seul site le long du chromosome et en continuant autour du cercle dans les deux sens. Cela signifie qu'environ 1000 nucléotides sont ajoutés par seconde. Ainsi, le processus est assez rapide et se déroule sans beaucoup d'erreurs.

La réplication de l'ADN utilise un grand nombre de protéines structurelles et d'enzymes, dont chacune joue un rôle essentiel au cours du processus. L'un des principaux acteurs est l'enzyme ADN polymérase, également connu sous le nom de DNA pol, qui ajoute des nucléotides un par un à la chaîne d'ADN en croissance complémentaire au brin matrice. L'ajout de nucléotides nécessite de l'énergie, cette énergie est obtenue à partir des nucléosides triphosphates ATP, GTP, TTP et CTP. Comme l'ATP, l'autre NTP (nucléosides triphosphates) sont des molécules à haute énergie qui peuvent servir à la fois de source de nucléotides d'ADN et de source d'énergie pour conduire la polymérisation. Lorsque la liaison entre les phosphates est « rompue », l'énergie libérée est utilisée pour former la liaison phosphodiester entre le nucléotide entrant et la chaîne en croissance. Chez les procaryotes, trois principaux types de polymérases sont connus : l'ADN pol I, l'ADN pol II et l'ADN pol III. On sait maintenant que l'ADN pol III est l'enzyme requise pour la synthèse de l'ADN. L'ADN pol I est une enzyme accessoire importante dans la réplication de l'ADN et, avec l'ADN pol II, est principalement requise pour la réparation.

Comment la machine de réplication sait-elle par où commencer ? Il s'avère qu'il existe des séquences nucléotidiques spécifiques appelées origines de la réplication où la réplication commence. Dans E. coli, qui a une seule origine de réplication sur son seul chromosome (comme la plupart des procaryotes), cette origine de réplication est longue d'environ 245 paires de bases et est riche en séquences AT. L'origine de réplication est reconnue par certaines protéines qui se lient à ce site. Une enzyme appelée hélicase déroule l'ADN en brisant les liaisons hydrogène entre les paires de bases azotées. L'hydrolyse de l'ATP est nécessaire pour ce processus. Au fur et à mesure que l'ADN s'ouvre, des structures en forme de Y appelées fourches de réplication sont formés. Deux fourches de réplication sont formées à l'origine de la réplication et celles-ci s'étendent de manière bidirectionnelle au fur et à mesure que la réplication progresse. Les protéines de liaison simple brin recouvrent les brins simples d'ADN près de la fourche de réplication pour empêcher l'ADN simple brin de se retourner en une double hélice.

L'ADN polymérase a deux restrictions importantes : elle est capable d'ajouter des nucléotides uniquement dans le sens 5'8242 à 3'8242 (un nouveau brin d'ADN ne peut être étendu que dans ce sens). Il nécessite également un groupe 3′-OH libre auquel il peut ajouter des nucléotides en formant une liaison phosphodiester entre l'extrémité 3′-OH et le phosphate 5′ du nucléotide suivant. Cela signifie essentiellement qu'il ne peut pas ajouter de nucléotides si un groupe 3′-OH libre n'est pas disponible. Alors comment ajoute-t-il le premier nucléotide ? Le problème est résolu à l'aide d'une amorce qui fournit l'extrémité 3′-OH gratuite. Une autre enzyme, l'ARN primase, synthétise un segment d'ARN d'environ cinq à dix nucléotides de long et complémentaire de l'ADN matrice. Parce que cette séquence amorce la synthèse d'ADN, elle est appelée à juste titre l'amorce. L'ADN polymérase peut maintenant étendre cette amorce d'ARN, en ajoutant un par un des nucléotides complémentaires au brin matrice ((Figure)).


Question : Vous isolez une souche cellulaire dans laquelle la jonction des fragments d'Okazaki est altérée et soupçonnez qu'une mutation s'est produite dans une enzyme trouvée au niveau de la fourche de réplication. Quelle enzyme est la plus susceptible d'être mutée ?

La fourche de réplication se déplace à une vitesse de 1000 nucléotides par seconde. La topoisomérase empêche le sur-enroulement de la double hélice d'ADN avant la fourche de réplication pendant que l'ADN s'ouvre, elle le fait en provoquant des entailles temporaires dans l'hélice d'ADN, puis en la refermant. Parce que l'ADN polymérase ne peut s'étendre que dans la direction 5′ à 3′, et parce que la double hélice de l'ADN est antiparallèle, il y a un léger problème au niveau de la fourche de réplication. Les deux brins d'ADN matrice ont des orientations opposées : un brin est dans le sens 5′ à 3′ et l'autre est orienté dans le sens 3′ à 5′. Un seul nouveau brin d'ADN, celui qui est complémentaire du brin d'ADN parental 3'8242 à 5'8242, peut être synthétisé en continu vers la fourche de réplication. Ce brin synthétisé en continu est connu sous le nom de brin principal. L'autre brin, complémentaire de l'ADN parental 5'8242 à 3'8242, s'étend loin de la fourche de réplication, en petits fragments appelés fragments d'Okazaki, chacun nécessitant une amorce pour démarrer la synthèse. De nouveaux segments d'amorce sont déposés dans la direction de la fourche de réplication, mais chacun s'en éloigne. (Les fragments d'Okazaki portent le nom du scientifique japonais qui les a découverts pour la première fois. Le brin avec les fragments d'Okazaki est connu sous le nom de brin retardé.)

Le brin principal peut être étendu à partir d'une seule amorce, tandis que le brin retardé a besoin d'une nouvelle amorce pour chacun des courts fragments d'Okazaki. La direction globale du brin en retard sera de 3 à 5 8242, et celle du brin d'avance de 5 à 8 4 à 3 8242. Une protéine appelée pince coulissante maintient l'ADN polymérase en place pendant qu'elle continue d'ajouter des nucléotides. La pince coulissante est une protéine en forme d'anneau qui se lie à l'ADN et maintient la polymérase en place. Au fur et à mesure de la synthèse, les amorces d'ARN sont remplacées par de l'ADN. Les amorces sont éliminées par l'activité exonucléase de l'ADN pol I, qui utilise l'ADN derrière l'ARN comme sa propre amorce et comble les lacunes laissées par l'élimination des nucléotides d'ARN par l'ajout de nucléotides d'ADN. Les coupures qui restent entre l'ADN nouvellement synthétisé (qui a remplacé l'amorce d'ARN) et l'ADN précédemment synthétisé sont scellées par l'enzyme ADN ligase, qui catalyse la formation de liaisons phosphodiester entre l'extrémité 3 & 8242-OH d'un nucléotide et le 5 & #8242 extrémité phosphate de l'autre fragment.

Une fois que le chromosome a été complètement répliqué, les deux copies d'ADN se déplacent dans deux cellules différentes au cours de la division cellulaire.

Le processus de réplication de l'ADN peut être résumé comme suit :

  1. L'ADN se déroule à l'origine de la réplication.
  2. L'hélicase ouvre les fourches de réplication formant l'ADN, celles-ci sont étendues de manière bidirectionnelle.
  3. Les protéines de liaison simple brin recouvrent l'ADN autour de la fourche de réplication pour empêcher le rembobinage de l'ADN.
  4. La topoisomérase se lie à la région en amont de la fourche de réplication pour empêcher le superenroulement.
  5. La primase synthétise des amorces d'ARN complémentaires du brin d'ADN.
  6. L'ADN polymérase III commence à ajouter des nucléotides à l'extrémité 3 & 8242-OH de l'amorce.
  7. L'allongement du brin retardé et du brin avant continue.
  8. Les amorces d'ARN sont éliminées par activité exonucléase.
  9. Les lacunes sont comblées par l'ADN pol I en ajoutant des dNTP.
  10. L'espace entre les deux fragments d'ADN est scellé par l'ADN ligase, qui aide à la formation de liaisons phosphodiester.

(Figure) résume les enzymes impliquées dans la réplication de l'ADN procaryote et les fonctions de chacune.

Réplication de l'ADN procaryote : les enzymes et leur fonction
Enzyme/protéine Fonction spécifique
ADN pol I Supprime l'amorce d'ARN et la remplace par de l'ADN nouvellement synthétisé
ADN pol III Enzyme principale qui ajoute des nucléotides dans le sens 5′-3′
Hélicase Ouvre l'hélice d'ADN en brisant les liaisons hydrogène entre les bases azotées
ligase Scelle les espaces entre les fragments d'Okazaki pour créer un brin d'ADN continu
Primase Synthétise les amorces d'ARN nécessaires pour démarrer la réplication
Pince coulissante Aide à maintenir l'ADN polymérase en place lors de l'ajout de nucléotides
Topoisomérase Aide à soulager la pression sur l'ADN lors du déroulement en provoquant des ruptures, puis en refermant l'ADN
Protéines de liaison simple brin (SSB) Se lie à l'ADN simple brin pour empêcher l'ADN de se rembobiner.

Regardez la réplication de l'ADN (vidéo) pour voir le processus complet.

Résumé de la section

La réplication chez les procaryotes commence à partir d'une séquence trouvée sur le chromosome appelée origine de réplication, le point auquel l'ADN s'ouvre. L'hélicase ouvre la double hélice de l'ADN, ce qui entraîne la formation de la fourche de réplication. Les protéines de liaison simple brin se lient à l'ADN simple brin près de la fourche de réplication pour maintenir la fourche ouverte. Primase synthétise une amorce d'ARN pour initier la synthèse par l'ADN polymérase, qui ne peut ajouter des nucléotides qu'à l'extrémité 3 & 8242 d'un brin d'amorce précédemment synthétisé. Les deux nouveaux brins d'ADN se développent selon leurs directions respectives 5 & 8242-3 # 8242. Un brin est synthétisé en continu dans la direction de la fourche de réplication, c'est ce qu'on appelle le brin principal. L'autre brin est synthétisé dans une direction éloignée de la fourche de réplication, dans de courts segments d'ADN connus sous le nom de fragments d'Okazaki. Ce brin est connu sous le nom de brin retardé. Une fois la réplication terminée, les amorces d'ARN sont remplacées par des nucléotides d'ADN et l'ADN est scellé avec de l'ADN ligase, ce qui crée des liaisons phosphodiester entre le 3 & 8242-OH d'une extrémité et le 5 & 8242 phosphate de l'autre brin.

Connexions artistiques

(Figure) Vous isolez une souche cellulaire dans laquelle la jonction des fragments d'Okazaki est altérée et soupçonnez qu'une mutation s'est produite dans une enzyme trouvée au niveau de la fourche de réplication. Quelle enzyme est la plus susceptible d'être mutée ?

(Figure) ADN ligase, car cette enzyme réunit des fragments d'Okazaki.

Réponse libre

La réplication de l'ADN est bidirectionnelle et discontinue, expliquez votre compréhension de ces concepts.

A une origine de réplication, il se forme deux fourches de réplication qui s'étendent dans deux directions. Sur le brin retardé, des fragments d'Okazaki se forment de manière discontinue.

Que sont les fragments d'Okazaki et comment se forment-ils ?

De courts fragments d'ADN sont formés sur le brin retardé synthétisé dans une direction éloignée de la fourche de réplication. Ceux-ci sont synthétisés par DNA pol.

Si le taux de réplication dans un procaryote particulier est de 900 nucléotides par seconde, combien de temps faudrait-il 1,2 million de génomes de paires de bases pour faire deux copies ?

1333 secondes ou 22,2 minutes.

Expliquez les événements qui se déroulent au niveau de la fourche de réplication. Si le gène de l'hélicase est muté, quelle partie de la réplication sera affectée ?

Au niveau de la fourche de réplication, les événements qui se déroulent sont l'action de l'hélicase, la liaison de protéines de liaison simple brin, la synthèse d'amorces et la synthèse de nouveaux brins. S'il existe un gène d'hélicase muté, la fourche de réplication ne sera pas étendue.

Quel est le rôle d'une amorce dans la réplication de l'ADN ? Que se passerait-il si vous oubliez d'ajouter une amorce dans un tube contenant le mélange réactionnel pour une réaction de séquençage d'ADN ?

L'amorce fournit un groupe 3 & 8242-OH pour que l'ADN pol commence à ajouter des nucléotides. Il n'y aurait pas de réaction dans le tube sans amorce, et aucune bande ne serait visible sur l'électrophorèse.

Les antibiotiques quinolones traitent les infections bactériennes en bloquant l'activité de la topoisomérase. Pourquoi ce traitement fonctionne-t-il ? Expliquez ce qui se passe au niveau moléculaire.

Les bactéries traitées aux quinolones ne pourront plus répliquer leur ADN. La topoisomérase soulage l'excès de superenroulement de l'ADN qui se produit avant la fourche de réplication lorsque l'ADN est déroulé pour la réplication. Si la topoisomérase est inhibée, l'ADN hélicase ne pourra dérouler l'ADN que pendant une courte période avant que le super-enroulement ne devienne trop enroulé pour que la réplication se poursuive.

Glossaire


Protéines de réplication de brin en retard dans la stabilité du génome et la réparation de l'ADN

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Ces auteurs ont participé à ce travail à part égale.

Auteur correspondant. Adresse : Département de biochimie et de biophysique, Centre médical de l'Université de Rochester, 601 Elmwood Ave., Box 712, Rochester, NY 14642. Téléphone : 585-275-3269. Télécopieur : 585-275-6007. Courriel : [e-mail protected]


Résultats

Pour élucider comment le MCM interagit avec l'ADNsb, nous avons déterminé la structure cristalline du domaine N-terminal du Pyrococcus furiosus MCM (PfMCMN) protéine en complexe avec homopolymère (dT)30 ADNsb (tableau 1).

Statistiques de collecte et de raffinement des données

PfMCMN:dT30PfMCMN (pas d'ADN)
Collecte de données
Groupe d'espaceP21P21
Dimensions de la cellule
une, b, c (UNE)94.276, 113.397, 196.854122.849, 103.064, 122.435
, , (°)90, 101.354, 9090, 119.85, 90
Résolution (Å)50-3.20 (3.31–3.20)50-2.65 (2.74–2.65)
Rsymbole0.109 (0.786)0.100 (0.569)
jeje13.4 (1.64)16.3 (2.26)
Complétude (%)100 (100)98.8 (98.2)
Redondance4.1 (4.1)3.7 (3.7)
Raffinement
Résolution (Å)50-3.20 (3.29–3.20)50-2.65 (2.72–2.65)
Nombre de reflets63497/3376 (4453/218)72376/3839 (5183/285)
Rtravail/Rlibre0.257/0.294 (0.372/0.373)0.259/0.270 (0.484/0.502)
Nombre d'atomes
Protéine2435912258
ADN5840
Zn 2+ 126
L'eau00
B-les facteurs
Protéine12978
ADN179N / A
Zn 2+ 204145
L'eauN / AN / A
R.m.s. écarts
Longueurs de liaison (Å)0.0080.011
Angles de liaison (°)1.1641.361

Architecture moléculaire MCM-ssDNA

L'unité asymétrique du cristal de PfMCMN:ssDNA contient deux hexamères indépendants, chacun lié à ssDNA (Figure 1, Figure 1-figure complète 1,2 Vidéo 1). Les sous-unités sont appelées A à F (hexamère 1) et G à L (hexamère 2). Comme SsoMCMN (Pucci et al., 2007 Liu et al., 2008), PfMCMN s'élue en tant que monomère par chromatographie d'exclusion stérique (données non présentées) mais adopte un arrangement hexamérique dans la structure cristalline. La structure est similaire à celle de MontMCMN (Fletcher et al., 2003) et SsoMCMN (Liu et al., 2008) avec trois sous-domaines (Figure 1—supplément de la figure 3) : un sous-domaine A largement hélicoïdal, un sous-domaine B de liaison au Zn et un sous-domaine C à pli OB. Le pore central du PfMCMN l'anneau hexamérique est de forme ovale avec un diamètre variable autour de l'anneau reflétant un écart significatif par rapport à la symétrie sextuple pure. Le RMSD des positions Cα du sous-domaine C de la permutation sextuple est de 3,03 Â et 1,45 Â pour les hexamères 1 et 2, respectivement. En revanche, PfMCMN sans ADN lié est hautement symétrique et montre un RMSD minimal à partir d'une symétrie sextuple (Figure 1 - la figure complète 4 à 6, RMSD = 0,33 ), indiquant que l'ADN induit une asymétrie dans l'anneau MCM. Le diamètre le plus étroit du canal se situe au niveau du tour du sous-domaine C (figure 1 - supplément de la figure 3), cohérent avec les structures précédentes de MCMN (Fletcher et al., 2003 Liu et al., 2008).

Un hexamère cristallographiquement unique vu parallèlement (A) et perpendiculairement (B) au canal.

L'ADN ss est de couleur cyan. (UNE) Chaque sous-unité est colorée et étiquetée de manière unique. Les chaînes latérales des deux résidus d'arginine MSSB qui se lient à l'ADNsb sont représentées en bâton. Les domaines de liaison Zn se projettent dans la page. Les domaines ATPase, non présents dans la structure cristalline, se projetteraient hors de la page. (B) La protéine est représentée en gris transparent pour souligner que l'ADNsb est perpendiculaire au canal. Les domaines de liaison au Zn sont en bas et les domaines ATPase seraient situés en haut.

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Détails de la structure cristalline pour PfMCMN:dT30.

La vidéo illustre l'unité asymétrique, qui comprend deux hexamères MCM dans une orientation côte à côte. Chaque sous-domaine est illustré dans Hexamer 1 pour montrer que le ssDNA interagit avec le sous-domaine OB-fold C. Enfin, des vues détaillées du -turn et du motif de liaison à l'ADN simple brin (MSSB) du MCM sont illustrées.

L'ADNsb se lie à l'intérieur du canal central de l'anneau hexamérique dans une configuration intrigante. L'ADNsb fait le tour de l'intérieur du PfMCMN anneau dans un plan perpendiculaire au canal central (Figure 1, Figure 1 - Figure supplément 1). Ceci contraste avec l'ADNsb passant par le canal central, comme observé dans les structures des complexes d'acides nucléiques des domaines moteurs des hélicases hexamériques E1 (Enemark et Joshua-Tor, 2006), Rho (Thomsen et Berger, 2009) , et DnaB (Itsathitphaisarn et al., 2012). Cette distinction suggère que les interactions MCM-ssDNA nouvellement identifiées pourraient remplir une fonction distincte des activités hélicase et translocase motorisées. L'ADNss se lie au MCMN OB-fold sous-domaine C dans une région compatible avec celle de la protéine prototype OB-fold SSB, mais l'ADNsb est orienté approximativement perpendiculairement à celui observé dans les structures SSB-ssDNA (Figure 1 - supplément de la figure 7, Raghunathan et al., 2000 Chan et al., 2009). Le ssDNA ne progresse pas vers une extrémité spécifique du canal, par conséquent, le ssDNA n'a pas de direction d'entrée ou de sortie assignable de l'anneau. Au lieu de cela, le ssDNA a une polarité définie par rapport à l'anneau MCM. Vu du côté C-terminal du complexe (comme le montre la figure 1A), la direction 5 'à 3' de l'ADN simple brin se déroule dans le sens des aiguilles d'une montre autour du canal. Cette polarité est observée pour les deux ADNsb dans chaque hexamère de l'unité asymétrique.

La structure révèle que les sous-unités MCM individuelles ne participent pas toutes simultanément à la liaison ssDNA. Dans chaque hexamère, les nucléotides liés ne sont pas continus mais sont séparés en deux tronçons. Dans l'ensemble, deux tronçons 7-mer sont observés dans l'hexamère 1, et les tronçons 11-mer et 4-mer sont observés dans l'hexamère 2. Les sous-unités qui interagissent avec l'ADN utilisent un mode de liaison cohérent avec quatre nucléotides par sous-unité (Figure 1, Figure 2 , Figure 2—supplément de la figure 1). Le quatrième nucléotide de l'extrémité 5' de ce mode de liaison est visible dans les cas où il s'étend sur la liaison aux sous-unités adjacentes, mais il est souvent désordonné à l'extrémité 3' d'un tronçon d'ADNsb. L'incrément de liaison de quatre nucléotides par sous-unité contraste avec les domaines moteurs d'autres hélicases hexamériques qui se lient à l'une (E1, Enemark et Joshua-Tor, 2006 Rho, Thomsen et Berger, 2009) ou à deux (DnaB, Itsathitphaisarn et al., 2012) nucléotides par sous-unité et indique que 24 nucléotides peuvent se lier si toutes les sous-unités engagent simultanément l'ADNsb. L'absence de liaison à l'ADN simple brin au niveau de certaines sous-unités n'est pas due à une longueur d'ADN insuffisante car un oligonucléotide 30-mère a été utilisé pour la cristallisation. L'ADN discontinu pourrait résulter de la liaison simultanée de l'hexamère à deux brins 30-mères distincts ou de la liaison étroite de l'hexamère à un brin d'ADNsb 30-mère dans deux régions, les nucléotides intermédiaires se liant faiblement ou pas du tout. Nous considérons que ce dernier est plus probable parce que la liaison de deux parties du même brin devrait être coopérative.

Vues stéréoscopiques des détails de l'interaction protéine-ADN pour deux interfaces de sous-unités.

La liaison implique principalement des résidus sur la face du pli OB d'une sous-unité, jaune, y compris une interaction entre une base thymidine et des atomes de chaîne principale du brin . Cette thymidine est prise en sandwich entre F202 d'une sous-unité et E127 de la sous-unité adjacente en cyan. La lysine 129 de la sous-unité voisine (cyan) interagit à la fois avec l'ADN et la sous-unité jaune. Les interfaces spécifiques représentées sont (en haut) entre les chaînes F (jaune) et A (cyan) et (en bas) entre les chaînes A (jaune) et B (cyan). Les détails structurels de la liaison à l'ADN semblent très similaires aux autres interfaces où l'ADN est observé (voir la figure 2 - supplément de la figure 1). Les principales interactions impliquent R124 et R186. La présence d'ADNsb est corrélée à la proximité des deux sous-unités telle que définie par la distance entre les positions R201 Cα et E127 Cα (flèche magenta).

La capacité d'une sous-unité à se lier à l'ADNsb est déterminée par la distance entre les sous-unités (Figure 1, Figure 2, Figure 2 - supplément de la figure 1). Pour comparer la distance entre différentes paires de sous-unités, nous avons mesuré la distance entre l'atome R201 Cα d'une sous-unité et l'atome E127 Cα de la sous-unité dans le sens inverse des aiguilles d'une montre, comme illustré à la figure 1 (flèche magenta, figure 2). La liaison à l'ADN est systématiquement observée au niveau de la première sous-unité si cette distance est inférieure à 7,5 , et elle n'est pas observée si cette distance dépasse 8,4 . L'interface entre les sous-unités J et K montre une distance intermédiaire (7,6 ), et la densité électronique entre F202 (sous-unité J) et E127 (sous-unité K) est beaucoup plus faible qu'aux interfaces où l'ADN a été modélisé (Figure 2 - supplément de la figure 1). La corrélation de la liaison de l'ADNsb avec la configuration intersous-unitaire est conceptuellement similaire aux sites ATPase multi-sous-unités où différentes configurations intersous-unités déterminent la capacité de se lier ou d'hydrolyser l'ATP (Abrahams et al., 1994 Enemark et Joshua-Tor, 2008). Dans MCMN, les modifications apportées à la configuration intersous-unité imposent la liaison à l'ADNss.

Les résidus conservés sur le pli OB se lient à l'ADNsb

Les interactions les plus significatives entre PfMCMN et l'ADNsb impliquent deux arginines adjacentes, R124 et R186, qui se projettent du tonneau du pli OB vers l'intérieur de l'anneau (figures 1 et 2). Ces résidus interagissent avec les atomes d'oxygène des sucres et des bases de l'ADNsb (figure 2) et sont hautement conservés dans d'autres protéines MCM (figure 3). Nous appelons cette région conservée le motif de liaison à l'ADN monocaténaire MCM (MSSB). Fait intéressant, une base de thymidine se projette vers le tonneau du pli OB (figure 2) et crée deux liaisons hydrogène avec les atomes de la chaîne principale d'un brin du tonneau . Cette base se trouve également à l'interface de la sous-unité, entre les chaînes latérales de la phénylalanine 202 d'une sous-unité et de l'acide glutamique 127 de la sous-unité adjacente. Les résidus de tour R234 et K236 n'interagissent pas avec l'ADNsb dans la structure. La liaison à l'ADN consiste principalement en des interactions avec les sucres et les bases plutôt qu'avec les phosphates du squelette. En revanche, les hélicases hexamériques E1 (Enemark et Joshua-Tor, 2006) Rho (Thomsen et Berger, 2009) et DnaB (Itsathitphaisarn et al., 2012) se lient aux acides nucléiques principalement par le biais d'interactions avec les phosphates du squelette.

Alignement de séquence spécifique à la famille MCM dans les régions où les interactions les plus fortes avec l'ADNsb sont observées.

Les résidus globalement conservés sont ombrés en bleu foncé et les résidus conservés spécifiques à une famille sont ombrés en bleu clair. Les résidus identifiés pour participer à la liaison à l'ADN à partir de notre structure (point rouge) et de travaux antérieurs (Pucci et al., 2004) (point lavande) sont notés au-dessus des séquences. Les positions de résidus conservées pour la liaison à l'ADNsb sont ombrées en rouge et correspondent à R124 et R186 dans PfMCM (Figure 2). pf = Pyrococcus furiosus mt = Methanothermobacter thermautotrophicus sso = Sulfolobus solfataricus ap = Aéropyrum pernix gi = Giardia lamblia aq = Amphimedon queenslandica cr = Chlamydomonas reinhardtii sc = Saccharomyces cerevisiae sp = Schizosaccharomyces pombe à = Arabidopsis thaliana ce = Caenorhabditis elegans dm = Drosophila melanogaster xl = Xénope laevis dr = Danio rerio gg = Gallus gallus hs = Homo sapiens.

Nous avons étudié le rôle des résidus identifiés dans la liaison à l'ADN du MCM à l'aide d'une analyse mutationnelle et d'essais de déplacement de mobilité électrophorétique. Comme prévu, de type sauvage PfMCMN lie simple brin (Figure 4, Kdemi = 6,8 M) et double brin (Figure 4—supplément de la figure 1, Kdemi = 7,0 µM) oligonucléotides. Les résidus arginine R124 et R186 font les interactions ADNsb les plus significatives dans la structure. Les mutants R124A et R186A présentent chacun une diminution significative de la liaison à l'ADNsb (réduction de 7 et 6 fois, respectivement). La mutation simultanée des deux arginines a montré des défauts encore plus forts (réduction de 25 fois), sans liaison à l'ADNsb détectable à moins que la concentration en protéines n'ait augmenté de façon spectaculaire (figure 4). Le mutant K129A est modestement défectueux dans la liaison à l'ADNsb (réduction d'un facteur quatre, figure 4). Les mutants individuels R124A, R186A et K129A se lient à l'ADNdb avec une affinité comparable au type sauvage (figure 4 - supplément de la figure 1). Le double mutant R124A/R186A ne présente que des défauts modestes de liaison à l'ADNdb (réduction de trois fois). Les mutants d'alanine d'autres résidus moins conservés n'ont pas altéré de manière significative la liaison à l'ADN simple brin ou à l'ADN double brin. Par exemple, conformément à l'implication de son amide de chaîne principale plutôt que de sa chaîne latérale dans la liaison à l'ADNsb, le mutant K233A à tour n'altère pas de manière significative la liaison à l'ADNsb. De même, la chaîne latérale F202 interagit avec une base de thymidine, mais elle est décalée par rapport à une interaction d'empilement idéale (figure 2). Le mutant F202A correspondant n'est pas altéré dans la liaison à l'ADN simple brin et n'est pas conservé comme aromatique dans d'autres protéines Mcm (figure 3).

Déplacement électrophorétique de la mobilité de l'oligo-dT 40-mer en présence de PfMCMN.

L'ADNsb, 160 nM avec un marqueur 5′-fluorescéine, a été titré avec des concentrations croissantes (1,4, 2, 2,7, 6,8, 13,5, 20,3, 27, 40,5, 54 M) de PfMCMN. La ruelle marquée '’ est chargé avec un échantillon de contrôle manquant de protéines. La mutation des résidus R124 et R186 altère significativement la liaison à l'ADNsb. Le double mutant R124A/R186A a été titré avec des concentrations plus importantes (54, 81, 108, 135, 162, 189, 216, 243, 270 M) de PfMCMN afin de détecter la liaison.

Les mutants correspondants de levure MCM2-7 sont défectueux in vivo

Dans S. cerevisiae (Sc), les PfLes acides aminés MCM R124 et R186 dans le motif MSSB sont tous deux conservés sous forme d'arginine ou de lysine dans Mcm4, Mcm6 et Mcm7, tandis que Mcm2, Mcm3 et Mcm5 présentent un résidu chargé positivement sur un seul des deux sites (figure 3). Tester le rôle du motif MSSB dans S. cerevisiae réplication de l'ADN, nous avons construit des mutants à double alanine dans ScMCM4 (mcm4-R334A/K398A = mcm4D), ScMCM6 (mcm6-R296A/R360A = mcm6D) et ScMCM7 (mcm7-R247A/K314A = mcm7D) car ces sous-unités présentaient le plus de similitudes avec PfMCM dans la MSSB.

Nous avons testé la capacité de ces mutations à remplacer la sous-unité Mcm de type sauvage correspondante dans S. cerevisiae cellules. Lorsqu'elles sont présentes comme la seule sous-unité Mcm mutante dans la cellule, les mutations dans le ScMCM4, ScMCM6 ou ScMCM7 MSSB a complété la délétion du gène correspondant (figure 5A, figure 5 - supplément de la figure 1). Parce que les défauts de liaison à l'ADN observés pour le mutant PfLes complexes MCM ont modifié les six sous-unités, nous avons testé la capacité des combinaisons par paires des ScMCM Les mutations MSSB fonctionnent à la place de leurs homologues de type sauvage. Contrairement aux mutations simples, les trois combinaisons de doubles mutants n'ont pas pris en charge la division cellulaire. La différence phénotypique dramatique entre les mutations doubles et simples peut être due à la nécessité de deux sous-unités adjacentes pour créer une interaction ADNsb productive. Étant donné que les sous-unités Mcm4, 6 et 7 sont adjacentes les unes aux autres dans le complexe Mcm2-7, chaque combinaison par paire devrait interrompre au moins trois paires de sous-unités possibles pour la liaison (par exemple, le double mutant Mcm4/6 interférerait avec Mcm2/ 6, paires de sous-unités Mcm6/4 et Mcm4/7 pour la liaison à l'ADNsb).

La mutation de deux motifs MSSB est mortelle et provoque des défauts de chargement de l'hélicase. (UNE) La mutation de deux motifs Mcm4, 6, 7 MSSB est mortelle. Disposition des sous-unités dans l'anneau Mcm2-7 vu du côté C-terminal. Les sous-unités Mcm4, 6 et 7 sont adjacentes les unes aux autres en face de la porte Mcm2/5. Toutes les combinaisons par paires des mutants MSSB Mcm4, 6 et 7 sont létales alors que les mutants MSSB individuels sont viables. (B) Chargement de l'hélicase avec les complexes MSSB double mutant Mcm2-7 indiqués. Trois formes de dosage sont présentées : après un lavage à haute teneur en sel pour surveiller l'achèvement du chargement (panneau supérieur) en présence d'ATPγS au lieu d'ATP pour surveiller l'association initiale de l'hélicase et de toutes les protéines de chargement de l'hélicase (ORC, Cdc6 et Cdt1, panneau du milieu) et avec de l'ATP après un lavage à faible teneur en sel, permettant de maintenir les protéines de charge liées à l'hélicase (panneau du bas). Tous les chargements dépendaient de Cdc6 et les protéines sont détectées après SDS-PAGE et coloration des protéines fluorescentes.

S. cerevisiae Les mutants MCM2-7 présentent des défauts de chargement d'hélicase et d'initiation de la réplication

Pour mieux définir les défauts moléculaires du mutant S. cerevisiae Complexes Mcm2-7, nous avons purifié les complexes Mcm2-7 contenant les doubles mutants mortels (Mcm4D/6D, Mcm4D/7D et Mcm6D/7D) ainsi que la protéine Cdt1 associée. Nous avons également purifié le triple mutant Mcm4/6/7 (Mcm4D/6D/7D) avec Cdt1 associé. Après purification, tous les complexes mutants ont montré une composition de sous-unités et une migration similaires dans les colonnes de filtration sur gel en tant que Mcm2-7/Cdt1 de type sauvage (Figure 5—supplément de la figure 2). Ainsi, ces mutations n'inhibent pas l'assemblage initial du complexe Mcm2-7/Cdt1.

Nous avons testé chacun des complexes mutants pour leur capacité à être chargés sur l'ADN d'origine à l'aide d'un test de chargement d'hélicase reconstitué (Evrin et al., 2009 Remus et al., 2009 Figure 5B). Pour s'assurer que tous les hexamères Mcm2-7 retenus sur l'ADN étaient chargés, nous avons lavé les protéines finales associées à l'ADN avec une teneur élevée en sel. Ce traitement supprime toutes les protéines de charge d'hélicase (ORC, Cdc6 et Cdt1) de l'ADN mais laisse les complexes Mcm2-7 chargés (Figure 5B, panneau supérieur) (Randell et al., 2006). La protéine de type sauvage a montré un chargement robuste et dépendant de Cdc6 sur l'ADN d'origine. En revanche, chacun des complexes Mcm2-7 double mutant présentait une charge Mcm2-7 réduite. Les complexes Mcm4D/6D et Mcm6D/7D n'ont montré que des défauts modestes (moins de ∼ du double, Figure 5—supplément de la figure 2). Le complexe Mcm4D/7D a montré un défaut plus important (∼10 fois), et le triple mutant Mcm4/6/7 a montré le défaut le plus sévère de chargement de l'hélicase (∼20 fois de réduction, Figure 5—supplément de la figure 2).

Pour établir à quelle étape du processus de chargement de l'hélicase ces défauts se sont produits, nous avons étudié le recrutement initial des complexes à l'origine de l'ADN. À cette fin, nous avons remplacé l'ATP par l'ATP-γS peu hydrolysable dans le dosage. En présence d'ATPγS, toutes les protéines nécessaires au chargement de l'hélicase sont recrutées à l'origine, mais aucun chargement ne se produit (Randell et al., 2006). Dans ces conditions, nous avons observé un schéma similaire d'association Mcm2-7/Cdt1 et ORC pour les complexes de type sauvage et mutants Mcm2-7 (figure 5B, panneau du milieu, figure 5 - supplément de la figure 2). Thus, mutating two or three MSSB motifs did not alter the initial recruitment of the Mcm2-7/Cdt1 complex to the origin DNA. We also examined the DNA-associated proteins when ATP-containing reactions were washed with low-salt (Figure 5B, bottom panel, Figure 5—figure supplement 2), a condition that retains helicase-loading proteins on DNA. Under these conditions, the mutant complexes showed a similar pattern of reduced Mcm2-7 DNA association as seen for the high-salt wash experiments. Cdt1 was not retained on the DNA under these conditions for mutant Mcm2-7 complexes, indicating that the MSSB mutations did not interfere with the release of Cdt1 from the Mcm2-7 complex during loading. Together, these data indicate that the loading defect for these Mcm2-7 mutants occurs after their initial recruitment to origin DNA but before the establishment of the ORC-independent association of Mcm2-7 with origin DNA.

We looked for additional replication initiation defects for the Mcm2-7 mutants that showed detectable loading using a modified in vitro replication assay that recapitulates origin-dependent DNA replication initiation and elongation (Heller et al., 2011). In contrast to our original studies, helicase loading in these assays was performed using purified proteins. In addition to measuring new DNA synthesis, we monitored association of Mcm2-7, the helicase activation proteins Cdc45 and GINS and the ssDNA binding protein, RPA, with the origin DNA during the reaction. The analysis of protein associations provided insights into the step during replication initiation during which the mutant Mcm2-7 complexes fail. Consistent with their inability to support cell growth, none of the mutant complexes supported significant DNA synthesis (Figure 6). Analysis of FLAG-Mcm3 DNA association showed that, as in the loading assays, the Mcm4D/6D and Mcm6D/7D complexes are retained on the DNA more strongly than the Mcm4D/7D complex. Cdc45 association mirrored the level of FLAG-Mcm3 association with the DNA, suggesting Cdc45 recruitment is independent of the MSSB (Figure 6—figure supplement 1). In contrast, all of the Mcm2-7 double mutants showed similarly strong defects (≥10-fold) in both GINS and RPA DNA association. In the case of Mcm4D/7D mutant, the DNA replication, GINS and RPA DNA association defects are consistent with its helicase-loading defect. In contrast, for Mcm4D/6D and Mcm6D/7D, the extent of helicase loading and Cdc45 DNA association is distinct from the much larger losses in GINS and RPA DNA association and DNA replication (Figure 6—figure supplement 1). These data strongly suggest that an inability to recruit or maintain GINS and/or RPA is responsible for the replication defects exhibited by these mutants. Because RPA DNA binding is a readout for ssDNA formation and GINS is required to activate the Mcm2-7 helicase, both of these defects indicate that the Mcm4/6 and Mcm6/7 MSSB mutants are defective for helicase activation.

The Mcm2-7 MSSB double mutants are severely defective for in vitro DNA replication.

Proteins associated with the DNA template during DNA replication were analyzed by immunoblotting (top panels) and radiolabeled DNA replication products were analyzed by alkaline agarose electrophoresis (bottom panel). All of the mutants are strongly defective for DNA replication and GINS and RPA DNA template association relative to wild-type Mcm2-7. The levels of Cdc45 and Mcm2-7 (FLAG-Mcm3) association reflected the levels of helicase loading by the same MSSB double mutant Mcm2-7 complexes. Quantitation of these data is shown in Figure 6—figure supplement 1.


Matériaux et méthodes

Protein Expression and Crystallization.

A gene fragment encoding the truncated protein gp2.5Δ26C was cloned into the pET 19b vector (Novagen, Madison, WI) in frame with a DNA sequence encoding an 8-aa rhinovirus 3C protease recognition sequence and a polyhistidine affinity tag. The resulting construct has an N-terminal histidine affinity tag that can be cleaved with PreScission Protease (Amersham Pharmacia) after purification of gp2.5Δ26C. Selenomethionyl gp2.5Δ26C was produced in E. coli by published methods (24, 25), and purified by nickel chelate affinity chromatography. The PreScission Protease was added to the purified gp2.5Δ26C protein at a ratio of 1:100 and the mixture was dialyzed overnight at 4°C against Tris⋅Cl, pH 7.5/300 mM NaCl/3 mM DTT. The protease was then removed by passing the reaction mixture over a 1-ml glutathione agarose column (Amersham Pharmacia).

gp2.5Δ26C was crystallized by the hanging drop vapor diffusion method. Equal volumes of a protein solution (12 mg/ml) and a well solution containing 22% PEG 4000/100 mM Tris⋅Cl, pH 7.0/250 mM CaCl2/14% ethylene glycol were mixed together and incubated at 22°C. Crystals of gp2.5Δ26C appear after 2 days that belong to space group P212121 and have two protein molecules in the asymmetric unit. The dimensions of the unit cell are a = 68.1 Å, b = 71.8 Å, and c = 82.2 Å.

Structure Determination.

Crystals of selenomethionyl gp2.5Δ26C were soaked with 1 mM phenylmercuric acetate in the crystallization well solution for 3 days. X-ray data from a single crystal were collected by using energies corresponding to the selenium K-edge (λ = 0.9792 Å) and the mercury LIII-edge (λ = 1.0073 Å) at beamline X-25 of the National Synchrotron Light Source (Upton, NY). Native x-ray data were collected at beamline A1 of the Cornell High Energy Synchrotron Source (Ithaca, NY) and x-ray intensity data were processed with DENZO/SCALEPACK (26). Six mercury binding sites and four well ordered selenium sites were located in the crystallographic asymmetric unit by anomalous difference Fourier methods. The heavy atom parameters for these metals were refined and single-wavelength anomalous diffraction (SAD) phases were calculated with the program mlphare (27). The best electron density map was obtained after density modification by using the program RESOLVE (28). Model building was performed with the program O (29). The model was refined against the native data set by conjugate gradient minimization and torsion angle-restrained molecular dynamics using the program CNS (30). The success of the refinement was evaluated at each stage by the change in the free R factor (31) and by inspection of stereochemical parameters with either the PROCHECK (32) or the ERRAT program (33). Model refinement converged with a final R factor of 21.4% (Rlibre = 26.8%), using all observed x-ray measurements in the resolution range 25–1.9 Å. The coordinates of the gp2.5 dimer have been deposited in the Protein Data Bank (PDB ID code 1JE5).

Protein Sequence and Structure Alignments.

The structural coordinates of E. coli SSB protein (1EYG) and human RPA70 (1JMC) bound to DNA were obtained from the Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb) and superimposed onto the gp2.5Δ26C model coordinates with program DALI (34, 35 http://www2.ebi.ac.uk/dali/dali.html). A least-squares superposition of the protein models that was based on the structurally homologous residues identified by DALI was then performed with the modeling program O (29).


9.6 Telomeres and Replicative Senescence

The End Replication Problem

Chez l'homme, telomeresconsist of hundreds to thousands of repetitive sequences of TTAGGG at chromosomal ends for maintaining genomic integrity. Because the DNA replication is asymmetric along double strands, RNA pimer sequence at the 3′-hydroxyl end cannot be replaced by DNA polymerase I, as there is no 3′-OH primer group present for the polymerase to extend the DNA chain. This causes the loss of 30–200 nucleotides with each DNA replication and cell division and is known as the end replication problem. Telomeres provide a repetitive noncoding sequence of DNA at the 3′ end to prevent the loss of critical genetically encoded information during replication. Moreover, telomeres are coated with a complex of six capping proteins, also known as shelterin proteins, which are packed into a compact T-loop structurethat hides the ends of the chromosomes. This prevents the DNA repair machinery from mistaking chromosomal ends for double-stranded DNA breaks (Figure 9.25). Therefore, telomeres have been proposed as a mitotic clockthat measures how many times a cell has divided and in essence, gives a cell a defined lifetime.

Figure 9.25 Telomere Structure. (A) Telomeres are located at the end of chromosomes, where they help protect against the loss of DNA during replication. (B) DNA quadruplex formed by telomere repeats. The looped conformation of the DNA backbone is very different from the typical DNA helix, this is known as T-loop formation. The green spheres in the center represent potassium ions.

L'humain telomerase enzyme is responsible for maintaining and elongating telomeres and consists of an RNA component (TERC) et un reverse transcriptase (TERT), that serves as the catalytic component (Figure 9.26). Les TERT uses the TERC as a template to synthesize new telomeric DNA repeats at a single-stranded overhang to maintain telomere length (Figure 9.26). Some cells such as germ cells, stem cells, hematopoietic progenitor cells, activated lymphocytes, and most cancer cells constitutively express telomerase and maintain telomerase activity to overcome telomere shortening and cellular senescence. However, most other somatic cells generally have a low or undetectable level of telomerase activity and concomitantly limited longevity. Interestingly, overall telomerase activity decreases with age, but increases markedly in response to injury, suggesting a role for telomerase in cellular regeneration during wound healing. The telomere length and integrity are regulated through the interplay between the télomérase et shelterin proteins.

Figure 9.26 Conceptual Model of Telomerase Activity. The active site of the telomerase enzyme contains the RNA template, TERC (shown in red) and aligns with the last few telomeric bases at the end of the chromosome (shown in blue). This creates a single stranded overhang that can be used as a template by the TERT reverse transcriptase to extend the telomere sequence.

In vivo, shortened telomeres and damaged telomeres generally caused by reactive oxygen species (ROS) are usually assumed to be the main markers of cellular aging and are thought to be the main cause of replicative senescence. jen vitro, telomeres loose approximately 50–200 bp at each division due to the end-replication problem. Approximately 100 mitoses are thought to be sufficient to reach the Hayflick limit, or the maximum number of mitotic events allowed prior to entering replicative senescence. Cells in continual renewal, such as blood cells, compensate for telomere erosion by expressing telomerase, the only enzyme able to polymerize telomeric sequences de novo at the extremity of telomeres. Knocking out telomerase components, such as the catalytic subunit (TERT) or the RNA template (TERC), induces several features of aging in mice. In humans, germline mutations in telomerase subunits are responsible for progeroïd syndromes, such as Dyskeratosis congenita, a rare genetic form of bone marrow failure. Furthermore, healthy lifespan in humans is positively correlated with longer telomere length and patients suffering from age-related diseases and premature aging have shorter telomeres compared with healthy individuals. An accumulation of unrepaired damage within telomeric regions has also been shown to accumulate in aging mice and non-human primates, suggesting that damage of telomeres with age may also be contributing to age-driven disease states and reduced healthspan.

Thus, one could argue that the activation and expression of telomerase may be a way of reducing age-related diseases and increasing overall longevity. However, the constitutive expression of telomerase, unfortunately, is a characteristic of almost all cancer cells. It is therefore, no surprise that transgenic animals over-expressiong the catalytic subunit of telomerase (mTERT), develop cancers earlier in life. However, overexpression of telomerase in mice that are highly resistant to cancers has shown large increases in median lifespan and significantly reduced age-associated disorders. Since humans are not highly resistant to cancer, this is not a feasible option for humans. However, additional studies in mice, where constitutive expression of telomerase is only introduced into a small percentage of host cells using adenovirus gene therapy techniques has yielded more promising results. Adenoviruses are a group of viruses that form an icosahedral protein capsid that houses a linear double stranded DNA genome. Infections in humans typically cause symptoms of the common cold and are usually mild in nature. These are a good target for gene therapy, as the DNA that they carry can be mutated, so that they are deficient in their ability to replicate once they have infected the host. They can also be transformed to carry a gene-of-interest into the host, where that gene can then integrate into the host genome. Experiments in mice that were infected with an adenovirus carrying the mTERT gene showed that mTERT was delivered to a wide range of tissues within the body, and increased telomere length within those tissues. Furthermore, the mTERT expressing mice were healthier than their litter mates and displayed a reduction in disabling conditions associated with physiological aging such as osteoporosis and insulin resistance (Figure 9.27). Cognitive skills and metabolic functions were also improved. Noticeably, mice treated with gene therapy did not have increased incidence in cancer rates, suggesting that in at least the short-lived mouse species, that a gene therapy approach to increased telomerase activity is safe. Within these animals, median lifespan was increased by 24% when animals were treated at 1 year of age, and by 13% if treated at 2 years of age.

Figure 9.27 Promoting Healthspan in Mice using a Telomerase Gene Therapy. Delivery of the catalytic subunit of telomerase (TERT) using a modified adenovirus vector (rAAV) suppresses aging associated telomere erosion and extends short telomoeres in a variety of tissues. Consequently, animals display improved healthspan and extended lifespan.

Replication and Repair of Telomere Sequences

In addition to the end replication problem, telomeric DNA (telDNA) replication and repair is a real challenge due to the different structural features of telomeres. Firstly, the nucleotidic sequence itself consists of an hexanucleotidic motif (TTAGGG) repeated over kilobases, with the 5′-3′ strand named the “G-strand” due to its high content in guanine. During the progression of the replication fork, the lagging strand, corresponding to the G-strand, forms G-quadruplex (G4) structures, which have to be resolved to allow fork progression and to complete replication (Figure 9.28a). Secondly, R-loops corresponding to highly stable RNA:DNA hybrids, involving the long non-coding telomeric transcript TERRA (telomeric repeat-containing RNA) also have to be dissociated. Thirdly, the extremity of telomeres adopts a specific loop structure, the T-loop, which has to be unraveled. This is the loop that hides the double strand end from the DNA damage sensors, and is locked by the hybridization of the 3′ single strand overhang extremity with the above 3′-5′ strand, thereby displacing the corresponding 5′-3′ strand to form a D-loop (displacement loop) structure (Figure 9.28a). Lastly, replication also has to deal with barriers encountered elsewhere in the genome, such as torsions and a condensed heterochromatic environment.

Figure 9.28 Obstacles and solutions to replicate telomeres. (a) Telomeric sequence, with the G-strand in solid red line and the C-strand in solid green line, is depicted. The terminal D-loop structuring the much larger T-loop is stabilized by the shelterin complex. The replisome (PCNA, pol ε, etc) polymerizes a new G-strand (depicted in dotted red line) and frees the parental G-strand, enabling the formation of G4 secondary structure. R-loops corresponding to TERRA hybridization (in dotted black lines) with the 3′-5′ strand, and torsions due to the fork progression are also shown. (b) Replication helpers, such as helicases, either helping in G4 unwinding or in D-loop unlocking are depicted. The DNAses (Top2a, DNA2) and RNAses (RNAse H1 and FEN1) help in resolving torsions and RNA:DNA heteroduplexes, while Timeless stimulates the replisome and POT1 competes with RPA1 for binding of the single-strand and helps in G4 dissolution. The shelterin components, POT1, TRF1 and TRF2 help in loading the helper-proteins (fine green arrows)

Since telomeres face a host of obstacles to completing the replication process, as discussed in Figure 9.28, the cell possess a set of specialized machinery to fully achieve their replication, such as the RTEL1, TRF1, and TRF2 proteins, DNAses, RNAsses, and Timeless. The recruitment of these factors is orchestrated by the shelterin complex.

At the molecular level, the GGG telomeric repeats are particularly sensitive to ROS, which produce stretches of 8-oxoguanine that are especially difficult to repair. Coupled with inefficient telomere repair, these ROS-induced lesions produce single and double-strand breaks, and/or generate replicative stress, ultimately resulting in telomere shortening. The presence of unrepaired single or tandem 8-oxoguanine drastically inhibits the binding of TRF1 and TRF2, and impairs the recruitment of telomerase, especially when ROS damage is localized in the 3′ overhang. This type of damage contributes to telomere deprotection and shortening. Strikingly, ROS (and other metabolic stresses) also induce the relocation of TERT to mitochondria, as observed (i) in primary neurons after oxidative stress (ii) in neurons exposed to the tau protein (iii) in Purkinje neurons subjected to excitotoxicity and (iv) in cancer cell lines treated with a G4 ligand. Mitochondrial TERT increases the inner membrane potential, as well as the mtDNA copy number, and decreases ROS production with a protective effect on mtDNA. Mitochondria are also critical sensors of cellular damage and contribute to the processes of autophagy and apoptosis (programmed cell death). The relocalization of TERT following chromosomal damage in the nucleus, may indicate one mechanism the mitochondria utilizes to monitor cellular stress and damage.

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Mastering the Content

Which of the following is the enzyme that replaces the RNA nucleotides in a primer with DNA nucleotides?

[reveal-answer q=”628075″]Show Answer[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”628075″]Answer b. DNA polymerase I is the enzyme that replaces the RNA nucleotides in a primer with DNA nucleotides.[/hidden-answer]

Which of the following is not involved in the initiation of replication?

[reveal-answer q=”820951″]Show Answer[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”820951″]Answer a. Ligase is not involved in the initiation of replication.[/hidden-answer]

Which of the following enzymes involved in DNA replication is unique to eukaryotes?

[reveal-answer q=”650146″]Show Answer[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”650146″]Answer d. Telomerase is unique to eukaryotes.[/hidden-answer]

Which of the following would be synthesized using 5′-CAGTTCGGA-3′ as a template?

[reveal-answer q=”429167″]Show Answer[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”429167″]Answer c. 3′-GTCAAGCCT-5′[/hidden-answer]

The enzyme responsible for relaxing supercoiled DNA to allow for the initiation of replication is called ________.
[reveal-answer q=”855893″]Show Answer[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”855893″]The enzyme responsible for relaxing supercoiled DNA to allow for the initiation of replication is calledDNA gyrase or topoisomerase II.[/hidden-answer]

Unidirectional replication of a circular DNA molecule like a plasmid that involves nicking one DNA strand and displacing it while synthesizing a new strand is called ________.
[reveal-answer q=”378861″]Show Answer[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”378861″]Unidirectional replication of a circular DNA molecule like a plasmid that involves nicking one DNA strand and displacing it while synthesizing a new strand is calledrolling circle replication.[/hidden-answer]

More primers are used in lagging strand synthesis than in leading strand synthesis.
[reveal-answer q=”25479″]Show Answer[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”25479″]True[/hidden-answer]


OVERALL MODEL FOR HSV DNA REPLICATION

Initiation of Viral DNA Synthesis

HSV DNA synthesis is believed to initiate at one of the three viral origins of replication, OriL or one of the two copies of OriS with UL9 and ICP8 acting to distort the AT-rich origin spacer region. Complexes containing ICP8 and UL9 can be visualized on negatively supercoiled plasmids containing OriS (Makhov et al. 2003) suggesting that negative supercoiling may facilitate unwinding at the origin. In another in vitro experiment, UL9 and ICP8 were found to unwind an 80-bp double-stranded oligonucleotide containing minimal OriS leading to a model in which UL9 and ICP8 go through a series of conformational changes leading to distortion of an origin. In the first step, two UL9 dimers appear to bind cooperatively to boxes I and II in a second step, UL9, in conjunction with ICP8 in the presence of ATP, can induce the formation of the OriS* hairpin (Aslani et al. 2002 Macao et al. 2004 Olsson et al. 2009). This step is accompanied by conformational changes in UL9 that shift the binding specificity from duplex origin binding to nonspecific ssDNA binding (Macao et al. 2004 Olsson et al. 2009). Because origin binding is specified by the carboxyl terminus and the ssDNA-binding domain requires motif Ia within the amino terminus (Marintcheva and Weller 2003b), the conformational changes in UL9 would be major. The exposure of single-stranded DNA may also cause a conformational change in ICP8 that releases it from UL9 and positions it onto single-stranded DNA where it may act to prevent reannealing of complementary strands. Aspects of this model have been supported by a biophysical analysis of the carboxy-terminal domain of UL9 and a truncated version of ICP8 in complex with a 15-mer double-stranded DNA-containing box I (Manolaridis et al. 2009). This study suggests that a conformational switch of the UL9-binding domain occurs on binding to box I followed by the recruitment of a UL9–ICP8 complex. Several questions remain about how well these in vitro experiments mimic the conditions that arise in an infected cell. Other viral or cellular factors may be required for origin activation on the viral genome in the context of viral infection.

Experiments in infected cells also support the notion that conformational changes in UL9 play critical roles during infection. For instance, UL9 is required at the earliest times post- infection, but appears not to be required at late times. In fact, at late times, UL9 is inhibitory (reviewed in Ward and Weller 2011). The inhibitory properties of UL9 correlate at least in part with its ability to bind to the origins of replication, because inhibition can be relieved by mutations that abrogate DNA binding (Marintcheva and Weller 2003a Chattopadhyay and Weller 2006). Binding of UL9 to the origin of replication is presumably desirable to initiate DNA synthesis but less desirable at later times. Conformational changes in UL9 may be caused by interaction with viral proteins such as ICP8 as described above. Interestingly, other posttranslational modifications of UL9 have also been reported such as phosphorylation and cleavage by cathepsins (Isler and Schaffer 2001 Link et al. 2007). It will be of interest to analyze structural and conformational properties of full-length and truncated versions of UL9 in infected cells to determine the mechanistic basis for the regulation of UL9 during infection.

Élongation

Once ICP8 and UL9 have initiated the distortion or destabilization at a viral origin as described above, it is thought that the H/P complex is recruited to unwind the duplex DNA and synthesize short RNA primers to initiate DNA replication (Fig. 1A). Aspects of this reaction can be reconstituted in vitro. Recombinant H/P complex can unwind duplex DNA but only if a single-stranded region of at least six nucleotides is provided (Chen et al. 2011). Primase activity can be detected in assays that use a single-strand oligonucleotide as a substrate however, primase activity is inefficient in assays using forked substrates (KL Graves-Woodward and SK Weller, unpubl. KA Ramirez-Aguilar and RD Kuchta, unpubl.). A possible reason for this discrepancy has recently been revealed. Although it has previously been reported that in the absence of DNA, the H/P complex exists as a monomer in solution, electrophoretic shift and surface plasmon resonance analysis have now indicated that in the presence of forked DNA, higher-order complexes can form between the H/P and a forked substrate (Chen et al. 2011). Electrophoretic mobility shift assays reveal two discrete complexes with different mobilities only when H/P is bound to DNA containing a single-stranded region, and surface plasmon resonance analysis confirms larger amounts of the complex bound to forked substrates than to single-overhang substrates. In addition, primase activity shows a cooperative dependence on protein concentration, whereas ATPase and helicase activities do not (Chen et al. 2011). Taken together, these data suggest that the primase activity of the H/P requires formation of a dimer or higher-order structure, whereas ATPase activity does not. As depicted in Figure 1A, the functional form of the H/P complex likely contains at least two copies of the H/P complex.

The last of the herpes replication proteins recruited to the fork appears to be the two-subunit polymerase, Pol and UL42. In infected cells, recruitment of Pol requires the presence of an active primase, indicating that conformational changes that occur in an active H/P complex and/or the RNA primer itself are important to bring the polymerase to viral DNA (Carrington-Lawrence and Weller 2003). Recruitment of polymerase to the fork may involve direct interactions between Pol and the H/P. The UL8 subunit of H/P has been reported to interact with Pol (Marsden et al. 1996). In addition, the UL5 subunit has recently been found to interact with Pol based on coimmunoprecipitation and yeast two-hybrid analysis (P Bai, G Liu, J Liu, et al., in prep.). Once the polymerase complex is recruited to the replication fork, it is believed to catalyze leading- and lagging-strand DNA synthesis however, initial attempts to reconstitute HSV DNA synthesis on primed substrates showed efficient leading-strand synthesis but much less efficient lagging-strand synthesis (Graves-Woodward et al. 1997 Falkenberg et al. 2000). Coupled leading- and lagging-strand DNA synthesis has now for the first time been reconstituted on synthetic minicircular DNA templates with the H/P, ICP8, and the viral polymerase (Pol/UL42) (Stengel and Kuchta 2011). To achieve efficient leading- and lagging-strand synthesis, it was necessary to provide high H/P concentrations and a lagging-strand template whose sequence resembled that of the viral DNA (Stengel and Kuchta 2011). The presence of two H/P complexes at the replication fork may provide a simple mechanism for recruiting two polymerases to the replication fork (Fig. 1B). It is anticipated that this system will facilitate future experiments to examine how other viral and cellular proteins will affect DNA synthesis. It is hoped that eventually it will be possible to develop a system to reconstitute origin-dependent replication.

Formation of Concatemeric DNA

Production of HSV concatemeric DNA is an essential step for the generation of progeny virus as the packaging machinery must recognize longer-than-unit-length concatemers during encapsidation. Although it has been proposed that the viral genome circularizes and rolling circle replication leads to the formation of concatemers, several lines of evidence suggest that HSV DNA replication is more complex and may involve recombination-dependent replication.

By analogy with λ phage, HSV may use viral and/or cellular recombination proteins during DNA replication. Herpesviruses have evolved a complex relationship with host DNA damage response pathways (reviewed in Weitzman and Weller 2011). Several cellular factors involved in double-strand-break (DSB) repair including Mre11, Rad50, Nbs1, and Rad51 are recruited to viral prereplicative sites and replication compartments. Several of these are important for efficient virus production leading to the suggestion that one or more of the DSB repair pathways may be used during HSV infection. Using chromosomally integrated reporter assays designed to distinguish between these pathways, it was found that single-strand annealing (SSA) was increased in HSV-infected cells, whereas homologous recombination (HR), nonhomologous end joining (NHEJ), and alternative nonhomologous end joining (A-NHEJ) were decreased (Schumacher et al. 2012). The increase in SSA was abolished when cells were infected with a viral mutant lacking UL12. Moreover, expression of UL12 alone caused an increase in SSA. UL12 and ICP8 are reminiscent of the λ phage recombination system that has been used as a tool for stimulating recombination-mediated genetic engineering in bacteria (Szczepanska 2009, and references therein). In addition, this system plays an important role in the production of viral DNA concatemers necessary for encapsidation and the production of infectious progeny (Lo Piano et al. 2011). The similarities between λ and HSV DNA replication raise the possibility that concatemer formation during HSV infection involves recombination-dependent replication.

In addition to the UL12/ICP8 viral recombination system and the potential role of the SSA pathway during DNA replication, several other repair pathways have been implicated as required for efficient replication (Muylaert and Elias 2007, 2010 Muylaert et al. 2011). DNA ligase IV/XRCC4 have been reported to be important for efficient virus replication (Muylaert and Elias 2007) suggesting a beneficial role for NHEJ however, in cells deficient for DNA-PK or Ku70, HSV-1 grows better than in their presence suggesting this conclusion may be oversimplified (Parkinson et al. 1999 K Mohni and S Weller, unpubl.). As described earlier, the interaction between the HSV-1 polymerase and HSV uracil-DNA-glycosylase (UL2) may indicate a role for base excision repair (Bogani and Boehmer 2008 Bogani et al. 2009, 2010). Recent reports that MSH2 and MLH1 are required for efficient replication of HSV-1 in normal human cells and are localized to viral replication compartments may indicate a role for mismatch repair in HSV replication (Mohni et al. 2011). Further investigation of the complex relationship between HSV and host repair/recombination pathways will be required to elucidate the role of various repair pathways in HSV DNA replication.


DISCUSSION

Biochemical studies suggest two different mechanisms to describe how SSB binds to and dissociates from ssDNA within the replisome. In the external-exchange model, newly exposed ssDNA is bound by SSB from solution. In an alternative model, SSB is recycled within the replisome through an internal-transfer mechanism. Using an in vitro single-molecule visualization approach, we show here that SSB can be recycled within the replisome on time scales corresponding to the synthesis of multiple Okazaki fragments, thereby verifying the existence of an internal-transfer mechanism of SSB molecules at the fork. At higher SSB concentrations, however, we observe that this mechanism is in competition with external exchange of SSB with molecules present in solution. Using single-molecule imaging of labelled SSB in live bacterial cells, we show that both processes occur at the replication fork in a cellular context and that roughly half of the SSB is internally recycled for the next Okazaki fragment.

We conclude that the E. coli replisome strikes a balance between internal transfer and external exchange of SSB. In the absence of SSB in solution, the original population is retained within the replisome and is efficiently recycled from one Okazaki fragment to the next (Figure 4E). The existence of such an internal-transfer mechanism has been hypothesized, as it has been shown that SSBs can be transferred between DNA strands through a transient paired intermediate ( 14, 15, 28). Internal transfer has, however, not been shown before in the context of active DNA replication. We show here that in the absence of competing free SSB in solution, SSB is recycled by the replisome for many tens of kb. Estimates of the total concentration of SSB tetramers in E. coli cells have ranged from 50 to 600 nM (300–600 nM during mid-log phase), which would be sufficient to coat up to ∼20 knt of ssDNA in the SSB35 binding mode ( 2, 14, 25). The concentration of available SSB within the cytosol could be significantly lower with SSB bound to the various ssDNA substrates within the cell. Moreover, at high growth rates, the cell could contain up to 12 active replisomes ( 29), leaving little free SSB. This lack of readily available SSB may make its binding from solution too slow to coat the rapidly produced ssDNA at replication forks, resulting in the exposure of vulnerable ssDNA that can be nucleolytically attacked, form secondary structures or act as a substrate for ssDNA-binding proteins that trigger undesired pathways or responses (e.g. RecA). The internal-transfer mechanism could be a way to ensure rapid SSB coating of newly exposed ssDNA, thereby allowing replication to continue at normal rates without creating large amounts of naked ssDNA.

Furthermore, our observation of internal transfer strongly suggests that SSB predominantly binds in the SSB35 mode at the replication fork. This observation is consistent with recent work that provides evidence that when human mitochondrial SSB loads onto the newly formed ssDNA during replication, it preferentially loads in a low-site-size binding mode, likely in the SSB35 mode ( 58). Comparable studies on human RPA also suggest that a low-site binding mode is utilized during initial loading onto ssDNA ( 59, 60). While it is not known what proportion of SSB in vivo is in either of the predominant binding modes (Figure 1A), internal transfer without equilibration with SSB in solution presumably requires it to be in the SSB35 mode ( 14). We further propose that the advancing lagging-strand polymerase is capable, if necessary, of converting SSB from the SSB65 to the SSB35 mode by reducing the availability of ssDNA, enabling the cooperative transfer of SSB to ssDNA generated behind the DnaB helicase. The mechanistic details of how the polymerase does this are yet to be uncovered.

In the presence of competing SSB in solution, however, this internal-transfer mechanism competes with external exchange of SSB at a rate that is dependent on its concentration in solution (Figure 3E). Such a concentration-dependent exchange mechanism has recently been observed for other proteins that form part of multi-protein complexes ( 37, 48, 61–68), and specifically for SSB ( 24). Under highly diluted conditions, these proteins can remain stably bound within the complex for long periods of time. Yet, rapid (sub-second) exchange is observed at nanomolar concentrations. Such concentration-dependent dissociation can be explained ( 69) and mathematically described ( 70–73) by a multi-site exchange mechanism in which a protein is associated with a complex via multiple weak binding sites, as opposed to a single strong one.

A competition between stability and plasticity that depends on concentration seems harder to comprehend for SSB. Under any circumstance, dilute or not, the SSB–ssDNA interaction has to be disrupted as new dsDNA is synthesized on the lagging strand. Therefore, stability, defined as retention within the replisome, cannot be achieved in the same way as described for other proteins, but instead needs to rely on a mechanism of internal transfer. The disruption of the SSB–DNA interaction due to lagging-strand synthesis would be followed by rapid rebinding of SSB to the next Okazaki-fragment template produced behind the helicase, thereby preventing dissociation of the SSB from the replisome. If, however, there are competing SSB molecules in close proximity to the fork, one of these can bind at the newly exposed ssDNA, thereby blocking that binding site. Consequently, SSB molecules released from the lagging strand can no longer rebind and are effectively competed out of the replisome.

Our observations of SSB dynamics in living cells are consistent with the hypothesis that both internal transfer and external exchange are physiologically relevant pathways accessible to the replisome during coupled DNA replication. In our measurements, during mid-log growth (estimated intracellular SSB concentrations of 300 to 600 nM), the balance seems to be towards external exchange, with relatively fast exchange times of 2.5 ± 1.7 s. This time scale is consistent with those we obtained in our in vitro measurements.

A multi-site exchange mechanism confers both stability and plasticity to the replication machinery, allowing the replisome to operate under different cellular conditions. Our work, combined with other recently published studies, presents a much more dynamic picture of the replisome, distinctly different from the deterministic models generated over the last few decades. It is important to point out that the stochasticity and plasticity observed in recent single-molecule experiments are all consistent with fundamental chemical principles and can be readily explained by hierarchies of weak and strong intra-replisomal interactions ( 74). The apparent generality of the models emerging from these studies suggests that the behaviours of other complex multi-protein systems might also be governed by such exchange processes and might suggest that evolution of complex interaction networks has arrived at an optimal balance between stability and plasticity.


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