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Comment préparer et cloner à partir d'ADN d'E. coli ?


Je recherche un protocole pour obtenir de l'ADN génomique à partir d'un E. coli échantillon afin que je puisse en cloner une petite partie par PCR dans un plasmide. (< 500 pb dans ce cas).

Il semble que OWW (Open Wet Ware) ne traite que de la préparation d'ADN fragmenté. Cela signifie-t-il que je dois le découper avant de pouvoir le cloner ? Tous les pointeurs seraient vraiment appréciés.


Oui, il faut fragmenter le génome pour l'insérer dans un vecteur de clonage ; vous ne pouvez pas "insérer" le génome entier de 5 Mbp de E. coli en un vecteur. Il est difficile de transformer des cellules avec d'énormes plasmides, 2-20 kpb est une plage optimale. Dans tous les cas, si vous voulez un clone du génome entier, attendez 30 minutes et la cellule se fera un plaisir de vous obliger.

La plupart des procédures qui isolent l'ADN génomique le fragmenteront en premier lieu, car il est beaucoup trop gros et fragile pour rester ensemble, et si c'était le cas, la majorité serait prise dans d'autres débris cellulaires et jetée. Le vortex avec des billes de verre est une première étape typique pour le fragmenter au hasard. Après cela, vous pouvez digérer l'ADN et votre vecteur pour y placer des extrémités correspondantes, le ligaturer et transformer les cellules hôtes.

Si vous souhaitez une approche ciblée (pour extraire un gène spécifique, une technique avec laquelle je ne suis pas familier), vous pourrez peut-être utiliser la PCR sur votre ADN extrait et fragmenté, car il y aurait, espérons-le, un segment intact couvrant ce que vous voulez.


Salut à tous, je pense que je ne savais pas comment formuler cette question correctement. Après avoir demandé à un collègue, on m'a dit que je n'avais pas du tout besoin de préparer l'ADN pour ce petit scénario sans bibliothèque.

Elle m'a dit de prendre juste un petit frottis de bactéries sur un cure-dent et de le mettre dans la réaction PCR avec le mélange maître et l'enzyme et les cycles de chauffage feraient le reste.

Peut-être que cette question était trop simple - désolé si c'était le cas.

(Effectivement, cela a bien fonctionné.)


Qu'est-ce que le clonage de gènes et pourquoi devons-nous cloner un gène ?

Clonage de gènes est le processus par lequel un gène d'intérêt est localisé et copié (cloné) à partir d'ADN extrait d'un organisme. Lorsque l'ADN est extrait d'un organisme, tous ses gènes sont extraits en une seule fois. Cet ADN, qui contient des milliers de gènes.

De plus, où le clonage de gènes est-il utilisé ? Clonage de gènes est une pratique courante dans les laboratoires de biologie moléculaire qui est utilisé par des chercheurs pour créer des copies d'un gène pour des applications en aval, telles que le séquençage, la mutagenèse, le génotypage ou l'expression hétérologue d'une protéine.

Bref, quelle est l'importance du clonage de gènes ?

Un des plus important apports de l'ADN clonage et génétique l'ingénierie à la biologie cellulaire est qu'ils ont rendu possible la production de n'importe quelle protéine de la cellule en quantités presque illimitées. De grandes quantités d'une protéine souhaitée sont produites dans des cellules vivantes en utilisant des vecteurs d'expression (Figure 8-42).

Quelles sont les deux applications du clonage de gènes ?

La méthode de clonage de gènes est utile pour étudier en détail la structure et la fonction des gènes. Applications médicales : dans Médicament, les bactéries clonées jouent un rôle important dans la synthèse des vitamines, des hormones et des antibiotiques. Applications agricoles : le clonage dans les bactéries facilite la fixation de l'azote dans les plantes.


Plasmides

Les plasmides sont petits (quelques milliers de paires de bases), ne portent généralement qu'un ou quelques gènes, sont circulaires et ont un seul origine de réplication. Les plasmides sont répliqués par la même machinerie qui réplique le chromosome bactérien. Certains plasmides sont copiés à peu près au même rythme que le chromosome, de sorte qu'une seule cellule est susceptible de n'avoir qu'une seule copie du plasmide. D'autres plasmides sont copiés à un taux élevé et une seule cellule peut en avoir 50 ou plus.

Les gènes sur les plasmides avec un nombre élevé de copies sont généralement exprimés à des niveaux élevés. Dans la nature, ces gènes codent souvent pour des protéines (par exemple, des enzymes) qui protègent la bactérie d'un ou plusieurs antibiotiques. Les plasmides pénètrent dans la cellule bactérienne avec une relative facilité. Cela se produit dans la nature et peut expliquer la propagation rapide de la résistance aux antibiotiques dans les hôpitaux et ailleurs. Les plasmides peuvent être délibérément introduits dans des bactéries en laboratoire en transformant la cellule avec les gènes entrants.

Figure 11.1.2 Micrographie électronique d'une cellule d'E. coli rompue pour libérer son ADN Avec l'aimable autorisation de Huntington Potter et David Dressler, Harvard Medical School

Dans la figure ci-dessus, l'enchevêtrement est une partie d'une seule molécule d'ADN contenant plus de 4,6 millions de paires de bases codant pour environ 4 300 gènes. Les petits cercles sont des plasmides.


Clonage reproductif

Clonage reproductif est une méthode utilisée pour faire un clone ou une copie identique d'un organisme multicellulaire entier. La plupart des organismes multicellulaires subissent une reproduction par voie sexuée, ce qui implique l'hybridation génétique de deux individus (parents), ce qui rend impossible la génération d'une copie identique ou d'un clone de l'un ou l'autre des parents. Les progrès récents de la biotechnologie ont permis d'induire artificiellement la reproduction asexuée de mammifères en laboratoire.

La parthénogenèse, ou "naissance vierge", se produit lorsqu'un embryon grandit et se développe sans que la fécondation de l'ovule ne se produise. Il s'agit d'une forme de reproduction asexuée. Un exemple de parthénogenèse se produit chez les espèces dans lesquelles la femelle pond un œuf et si l'œuf est fécondé, c'est un œuf diploïde et l'individu se développe en femelle si l'œuf n'est pas fécondé, il reste un œuf haploïde et se développe en mâle . L'œuf non fécondé est appelé œuf parthénogénique ou vierge. Certains insectes et reptiles pondent des œufs parthénogéniques qui peuvent devenir des adultes.

La reproduction sexuée nécessite deux cellules lorsque l'ovule haploïde et les spermatozoïdes fusionnent, il en résulte un zygote diploïde. Le noyau du zygote contient l'information génétique pour produire un nouvel individu. Cependant, le développement embryonnaire précoce nécessite le matériel cytoplasmique contenu dans l'ovule. Cette idée constitue la base du clonage reproductif. Par conséquent, si le noyau haploïde d'un ovule est remplacé par un noyau diploïde provenant de la cellule d'un individu de la même espèce (appelé donneur), il deviendra un zygote génétiquement identique au donneur. Le transfert nucléaire de cellules somatiques est la technique consistant à transférer un noyau diploïde dans un ovule énucléé. Il peut être utilisé pour le clonage thérapeutique ou le clonage reproductif.

Le premier animal cloné était Dolly, une brebis née en 1996. Le taux de réussite du clonage reproductif à l'époque était très faible. Dolly a vécu sept ans et est décédé de complications respiratoires (Figure 2). Il y a des spéculations que parce que l'ADN cellulaire appartient à un individu plus âgé, l'âge de l'ADN peut affecter l'espérance de vie d'un individu cloné. Depuis Dolly, plusieurs animaux tels que des chevaux, des taureaux et des chèvres ont été clonés avec succès, bien que ces individus présentent souvent des anomalies faciales, des membres et cardiaques. Il y a eu des tentatives pour produire des embryons humains clonés en tant que sources de cellules souches embryonnaires, parfois appelées clonage à des fins thérapeutiques. Le clonage thérapeutique produit des cellules souches pour tenter de remédier à des maladies ou défauts néfastes (contrairement au clonage reproductif, qui vise à reproduire un organisme). Pourtant, les efforts de clonage thérapeutique ont rencontré une résistance en raison de considérations bioéthiques.

Question de pratique

Figure 2. Dolly la brebis a été le premier mammifère à être cloné. Pour créer Dolly, le noyau a été retiré d'un ovule d'un donneur. Le noyau d'un deuxième mouton a ensuite été introduit dans la cellule, qui a pu se diviser jusqu'au stade blastocyste avant d'être implanté dans une mère porteuse. (crédit : modification du travail par “Squidonius”/Wikimedia Commons)


Enzymes de restriction et clonage

Cette section sur le clonage comprend des informations qui sont une base nécessaire pour les laboratoires de recherche, mais peuvent être nécessaires de temps en temps dans les laboratoires cliniques lorsque quelque chose de vraiment intéressant est trouvé dans le laboratoire moléculaire. Le clonage d'une séquence (ou d'une partie) d'un gène est également nécessaire pour avoir des matrices stables pour la production de sondes, ou pour conserver ce produit PCR intéressant. Le stockage à long terme des produits de PCR sans les cloner les rend sensibles à la dégradation par les exonucléases bactériennes (enzymes qui digèrent l'ADN par les extrémités). Les enzymes de restriction sont les réactifs de base du clonage, mais sont utilisées dans des applications cliniques associées à la prise d'empreintes digitales - identité génétique, épidémiologie et en préparation du transfert pour d'autres applications.

Clonage Étape 1 : Digestion par restriction.
C'est une étape qui coupe essentiellement l'ADN en petits morceaux. Rappelez-vous du sous-ensemble de module II-a, qu'il y avait également du matériel sur les digestions par enzymes de restriction qui a fourni un certain contexte pour cette section et comprenait également l'application des digestions de restriction à l'identification (empreintes ADN). Les ciseaux moléculaires sont appelés endonucléases de restriction. Rappelons que les endonucléases de restriction sont des enzymes qui clivent l'ADN. Ils sont dérivés de bactéries où ils fonctionnent en clivant l'ADN étranger et en protégeant ainsi l'intégrité de la bactérie hôte (un système immunitaire bactérien). Ces enzymes reconnaissent des séquences de bases spécifiques dans l'ADN double brin. La séquence de bases sert de code pour l'enzyme de restriction en disant "couper ici". Par exemple, l'enzyme marquée EcoRI reconnaît la séquence de bases GAATTC et coupe entre le G et A.

Les sites sur la molécule d'ADN reconnus par les enzymes sont appelés sites de restriction. Les sites de restriction sont palindromes, lisant le même 5'→3' sur chaque brin de l'ADN. Les différentes enzymes portent le nom des bactéries dont elles sont issues. Eco est dérivé d'Escherichia coli et Hin d'Haemophilus influenzae, par exemple. Vous remarquerez que le premier panneau au-dessus de la coupe ne laisse aucun surplomb et s'appelle une coupe émoussée laissant des extrémités émoussées. N'importe quelle extrémité émoussée peut être jointe à n'importe quelle autre extrémité émoussée - quelque chose à retenir lors du clonage de produits PCR. L'autre panneau montre une coupe qui laisse des extrémités en surplomb appelées surplombs de 5 'ou 3' selon le brin en surplomb.

On peut choisir des enzymes qui se clivent de chaque côté d'une séquence d'ADN souhaitée. Dans ces cas, les sites de coupure ont été prédéterminés en trouvant la séquence de nucléotides qui codent pour une protéine ou une caractéristique spécifique. Dans d'autres cas, diverses endonucléases seront essayées.

Une fois que l'ADN a subi une digestion de restriction, il peut être utilisé pour se recombiner avec tout autre morceau d'ADN qui a les extrémités complémentaires, quelle que soit la source de cet ADN. Cela permet l'insertion d'un segment d'ADN dans un plasmide qui a été clivé avec la ou les mêmes enzyme(s)

Centre de formation en biotechnologie de l'Université de Calgary


Glossaire des vecteurs de clonage Gateway

Type de vecteur Caractéristiques vectorielles But
Vecteur de donneur attP sites de recombinaison ccdB gène de sélection négative Utilisé pour cloner att B-gènes flanqués d'intérêt à générer clones d'entrée
Vecteur d'entrée attL sites de recombinaison Utilisé pour générer clones d'entrée par clonage TOPO ou par clonage de restriction
Vecteur de destination attR sites de recombinaison ccdB gène pour les éléments de sélection négative pour exprimer le gène d'intérêt dans le système approprié Se recombine avec le clone d'entrée pour générer un clone d'expression

Un exemple

  • 4539 paires de bases
  • une seule origine de réplication
  • un gène (ampère r ) conférant une résistance à l'antibiotique ampicilline (un parent de la pénicilline)
  • une Célibataire occurrence de la séquence
  • un fragment de 3755 paires de bases portant à la fois le ampère r gène et l'origine de réplication
  • un fragment de 784 paires de bases
  • les deux fragments ont des extrémités collantes
  • 4207 paires de bases
  • une seule origine de réplication
  • un gène (kan r ) conférant une résistance à l'antibiotique kanamycine.
  • un seul site coupé par BamHI
  • un seul site coupé par HindIII
  • un fragment de 2332 paires de bases
  • un fragment de 1875 paires de bases avec le kan r gène (mais pas d'origine de réplication)
  • les deux fragments ont des extrémités collantes

Possibilités de ligature

Si vous supprimez les deux enzymes de restriction et fournissez les conditions pour que l'ADN ligase fasse son travail, les morceaux de ces plasmides peuvent se rejoindre (grâce à la complémentarité de leurs extrémités collantes).

Le mélange des fragments pKAN et pAMP fournit plusieurs (au moins 10) possibilités de molécules réunies. Certains d'entre eux ne produiront pas de plasmides fonctionnels (les molécules avec deux ou sans origine de réplication ne peuvent pas fonctionner).

  • le fragment pAMP de 3755 pb (avec ampère r et une origine de réplication) avec le
  • Fragment pKAN de 1875 pb (avec kan r )

Scellé avec ADN ligase, ces molécules sont des plasmides fonctionnels capables de conférer une résistance à les deux ampicilline et kanamycine. Ce sont des molécules de ADN recombiné.

Parce que l'origine de réplication, qui permet à la molécule de fonctionner comme un plasmide, a été apportée par pAMP, pAMP est appelé le vecteur.


Comment un bactériophage pourrait-il être utilisé pour cloner un gène ?

De même, à quoi sert le clonage de gènes ? Clonage de gènes est une pratique courante dans les laboratoires de biologie moléculaire qui est utilisé par chercheurs pour créer des copies d'un gène pour des applications en aval, telles que le séquençage, la mutagenèse, le génotypage ou l'expression hétérologue d'une protéine.

De plus, comment cloner un gène sur un vecteur ?

  1. Exécutez la PCR et purifiez le produit PCR : exécutez la PCR pour amplifier votre ADN d'insertion.
  2. Digérez votre ADN :
  3. Isolez votre insert et vecteur par purification sur gel :
  4. Ligaturez votre insert dans votre vecteur :
  5. Transformation:
  6. Isoler le plasmide fini :
  7. Vérifiez votre plasmide par séquençage :

Comment une sonde peut-elle être utilisée pour localiser un gène d'intérêt une fois qu'il a été cloné ?

Sondes pour découverte protéines Si le produit protéique d'un le gène est connue et isolée sous forme pure, alors cette protéine pouvez être utilisé pour détecter le cloner du correspondant gène dans une bibliothèque. Pour créer la bibliothèque, l'ADNc est inséré dans le vecteur dans le cadre avec la protéine bactérienne, et les cellules volonté faire une protéine de fusion.


Clonage et biologie synthétique

L'ADN d'intérêt, tel qu'un gène, un ou plusieurs éléments régulateurs, ou un opéron, etc., est préparé pour le clonage en l'extirpant de l'ADN source à l'aide d'enzymes de restriction, en le copiant à l'aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) ou en assemblant à partir d'oligonucléotides individuels. Parallèlement, un vecteur plasmidique est préparé sous forme linéaire à l'aide d'enzymes de restriction ou PCR. Le plasmide est un petit morceau d'ADN circulaire qui est répliqué dans l'hôte et existe séparément de l'ADN chromosomique ou génomique de l'hôte. En joignant physiquement l'ADN d'intérêt au vecteur plasmidique par des liaisons phosphodiester, l'ADN d'intérêt devient une partie du nouveau plasmide recombinant et est répliqué par l'hôte.

Les vecteurs plasmidiques permettent à l'ADN d'intérêt d'être copié en grandes quantités et, souvent, fournissent les éléments de contrôle nécessaires à utiliser pour diriger la transcription et la traduction de l'ADN cloné. En tant que tels, ils sont devenus le cheval de bataille de nombreuses méthodes moléculaires, telles que l'expression des protéines, les études d'expression des gènes et l'analyse fonctionnelle des biomolécules.

Au cours du processus de clonage, les extrémités de l'ADN d'intérêt et du vecteur doivent être modifiés pour les rendre compatibles pour se joindre par l'action d'une ADN ligase, recombinase ou in vivo Mécanisme de réparation de l'ADN. Ces étapes utilisent typiquement des enzymes, telles que des nucléases, des phosphatases, des kinases et/ou des ligases. De nombreuses méthodologies de clonage et, plus récemment, des kits ont été développés pour simplifier et standardiser ces processus.

Utilisez NEBcloner pour trouver les bons produits et protocoles pour chaque étape de clonage.

Histoire du clonage

Apprenez-en plus sur les différents types de clonage moléculaire trouvés dans le flux de travail ci-dessous : clonage traditionnel, clonage par PCR, clonage sans couture, clonage indépendant par ligation (LIC) et clonage par recombinaison.

Flux de travail de clonage

La biologie de synthèse
La biologie synthétique est une expansion plus récente du domaine de la biotechnologie, dans laquelle les gènes et les protéines sont considérés comme des pièces ou des dispositifs, dans le but de reconcevoir et/ou d'assembler ces pièces de nouvelles manières pour créer une fonctionnalité nouvelle et utile. Les progrès récents dans la génération de biocarburants, la production de produits biochimiques et la compréhension du génome minimal bénéficient tous d'approches biologiques synthétiques. Souvent, ces projets reposent sur l'assemblage ordonné de plusieurs séquences d'ADN pour créer de grandes structures d'ADN artificielles. À cette fin, des méthodes ont évolué pour simplifier ce processus. NEBuilder® HiFi DNA Assembly et Golden Gate Assembly peuvent être utilisés pour créer de nombreuses structures d'ADN fonctionnelles, depuis la simple jonction de deux gènes métaboliques jusqu'à la création d'un génome artificiel.

Pour vous aider à sélectionner la meilleure méthode d'assemblage d'ADN pour vos besoins, veuillez utiliser notre tableau de sélection de biologie synthétique/assemblage d'ADN.


Création du clone

Les étapes du clonage sont les suivantes. L'ADN est extrait de l'organisme à l'étude et est découpé en petits fragments d'une taille adaptée au clonage. Le plus souvent, cela est réalisé en clivant l'ADN avec une enzyme de restriction. Les enzymes de restriction sont extraites de plusieurs espèces et souches de bactéries différentes, dans lesquelles elles agissent comme des mécanismes de défense contre les virus. Ils peuvent être considérés comme des « ciseaux moléculaires », coupant l'ADN au niveau de séquences cibles spécifiques. Les enzymes de restriction les plus utiles effectuent des coupes décalées, c'est-à-dire qu'elles laissent un surplomb monocaténaire au site de clivage. Ces surplombs sont très utiles dans le clonage car les nucléotides non appariés s'apparieront avec d'autres surplombs réalisés en utilisant la même enzyme de restriction. Ainsi, si l'ADN donneur et l'ADN vecteur sont tous deux coupés avec la même enzyme, il existe une forte possibilité que les fragments donneurs et le vecteur coupé s'épisseront ensemble en raison des surplombs complémentaires. La molécule résultante est appelée ADN recombinant. Il est recombinant dans le sens où il est composé d'ADN provenant de deux sources différentes. Ainsi, c'est un type d'ADN qui serait impossible naturellement et c'est un artefact créé par la technologie de l'ADN.

L'étape suivante du processus de clonage consiste à couper le vecteur avec la même enzyme de restriction que celle utilisée pour couper l'ADN du donneur. Les vecteurs ont des sites cibles pour de nombreuses enzymes de restriction différentes, mais les plus pratiques sont celles qui n'apparaissent qu'une seule fois dans la molécule du vecteur. En effet, l'enzyme de restriction ouvre alors simplement l'anneau du vecteur, créant un espace pour l'insertion du segment d'ADN donneur. L'ADN vecteur coupé et l'ADN donneur sont mélangés dans un tube à essai, et les extrémités complémentaires des deux types d'ADN s'unissent au hasard. Bien entendu, plusieurs types d'unions sont possibles : fragment donneur à fragment donneur, fragment de vecteur à fragment de vecteur et, plus important, fragment de vecteur à fragment de donneur, qui peuvent être sélectionnés. Des associations d'ADN recombinant se forment spontanément de la manière ci-dessus, mais ces associations ne sont pas stables car, bien que les extrémités soient appariées, le squelette sucre-phosphate de l'ADN n'a pas été scellé. Ceci est accompli par l'application d'une enzyme appelée ADN ligase, qui scelle les deux segments, formant une double hélice continue et stable.

Le mélange doit maintenant contenir une population de vecteurs contenant chacun un insert donneur différent. Cette solution est mélangée à des cellules bactériennes vivantes qui ont été spécialement traitées pour rendre leurs cellules plus perméables à l'ADN. Les molécules recombinantes pénètrent dans les cellules vivantes dans un processus appelé transformation. Habituellement, une seule molécule recombinante pénètre dans une cellule bactérienne individuelle. Une fois à l'intérieur, la molécule d'ADN recombinant se réplique comme n'importe quelle autre molécule d'ADN plasmidique, et de nombreuses copies sont ensuite produites. De plus, lorsque la cellule bactérienne se divise, toutes les cellules filles reçoivent le plasmide recombinant qui se réplique à nouveau dans chaque cellule fille.

Le mélange original de cellules bactériennes transformées est étalé à la surface d'un milieu de croissance dans une boîte plate (boîte de Pétri) de manière à séparer les cellules les unes des autres. Ces cellules individuelles sont invisibles à l'œil nu, mais au fur et à mesure que chaque cellule subit des cycles successifs de division cellulaire, des colonies visibles se forment. Chaque colonie est un clone cellulaire, mais c'est aussi un clone d'ADN car le vecteur recombinant a maintenant été amplifié par réplication à chaque cycle de division cellulaire. Ainsi, la boîte de Pétri, qui peut contenir plusieurs centaines de colonies distinctes, représente un grand nombre de clones de fragments d'ADN différents. Cette collection de clones est appelée banque d'ADN. En considérant la taille du génome du donneur et la taille moyenne des inserts dans la molécule d'ADN recombinant, un chercheur peut calculer le nombre de clones nécessaires pour englober l'ensemble du génome du donneur, ou, en d'autres termes, le nombre de clones nécessaires pour constituer une bibliothèque génomique.

Un autre type de bibliothèque est une bibliothèque d'ADNc. La création d'une banque d'ADNc commence par l'acide ribonucléique messager (ARNm) au lieu de l'ADN. L'ARN messager transporte des informations codées de l'ADN aux ribosomes pour la traduction en protéine. Pour créer une bibliothèque d'ADNc, ces molécules d'ARNm sont traitées avec l'enzyme transcriptase inverse, qui est utilisée pour faire une copie d'ADN d'un ARNm. Les molécules d'ADN résultantes sont appelées ADN complémentaire (ADNc). Une banque d'ADNc représente un échantillon des gènes transcrits, alors qu'une banque génomique comprend des régions non transcrites.

Les bibliothèques génomiques et d'ADNc sont réalisées sans tenir compte de l'obtention de fragments donneurs clonés fonctionnels. Les clones génomiques ne contiennent pas nécessairement des copies complètes des gènes. De plus, l'ADN génomique des eucaryotes (cellules ou organismes qui ont un noyau) contient des introns, qui sont des régions d'ADN qui ne sont pas traduites en protéines et ne peuvent pas être traitées par les cellules bactériennes. Cela signifie que même les gènes de taille normale ne sont pas traduits dans leur intégralité. De plus, les signaux régulateurs eucaryotes sont différents de ceux utilisés par les procaryotes (cellules ou organismes dépourvus de membranes internes, c'est-à-dire les bactéries). Cependant, il est possible de produire des bibliothèques d'expression en découpant des inserts d'ADNc immédiatement adjacents à une région de promoteur bactérien sur le vecteur dans ces bibliothèques d'expression, les protéines eucaryotes sont fabriquées dans des cellules bactériennes, ce qui permet plusieurs applications technologiques importantes qui sont discutées ci-dessous dans le séquençage de l'ADN.

Plusieurs virus bactériens ont également été utilisés comme vecteurs. Le plus couramment utilisé est le phage lambda. La partie centrale du génome lambda n'est pas essentielle pour que le virus se réplique dans Escherichia coli, de sorte que cela peut être excisé à l'aide d'une enzyme de restriction appropriée, et les inserts de l'ADN du donneur peuvent être épissés dans l'espace. En fait, lorsque le phage reconditionne l'ADN dans sa capsule protéique, il n'inclut que des fragments d'ADN de la même longueur que le génome du phage normal.

Les vecteurs sont choisis en fonction de la quantité totale d'ADN qui doit être incluse dans une banque. Les cosmides sont des vecteurs modifiés qui sont des hybrides de plasmide et de phage lambda, mais ils peuvent porter des inserts plus gros que les plasmides pUC (plasmides modifiés pour produire un nombre très élevé de copies d'ADN mais qui ne peuvent accueillir que de petits inserts) ou le phage lambda seul. Les chromosomes artificiels bactériens (BAC) sont des vecteurs basés sur des plasmides de facteur F (facteur de fertilité) de E. coli et peut transporter des quantités beaucoup plus importantes d'ADN. Les chromosomes artificiels de levure (YAC) sont des vecteurs basés sur des plasmides à réplication autonome de Saccharomyces cerevisiae (La levure de boulanger). Dans la levure (un organisme eucaryote), un YAC se comporte comme un chromosome de levure et se sépare correctement en cellules filles. Ces vecteurs peuvent porter les plus gros inserts de tous et sont largement utilisés dans le clonage de grands génomes tels que le génome humain.


Comment préparer et cloner à partir d'ADN d'E. coli ? - La biologie

ABSTRAIT. Les bactéries Escherichia coli a été largement utilisé dans les études sur les gènes de réparation de l'ADN eucaryotes. Plusieurs gènes eucaryotes ont été clonés par complémentation fonctionnelle de lignées mutantes de E. coli. Nous avons examiné les similitudes et les différences entre les systèmes de réparation de l'ADN bactérien et eucaryote. Sur la base de ces données, nous avons examiné les outils utilisés pour le clonage de gènes et les études fonctionnelles de la réparation de l'ADN chez les eucaryotes, en utilisant ce système bactérien comme modèle.

Mots clés: Réparation de l'ADN, Complémentation fonctionnelle, Escherichia coli

Le génome bactérien code environ 115 protéines impliquées dans au moins un aspect de la réparation de l'ADN (Aravind et al., 1999). Ce scénario métabolique a été maintenu tout au long de l'évolution, puisque tous les organismes eucaryotes, ainsi que les bactéries, doivent se prémunir contre les dommages à l'ADN, qui seraient incompatibles avec la vie si les machines de réparation de l'ADN n'apportaient pas les corrections nécessaires. Lorsque nous analysons les systèmes de réparation de l'ADN bactériens et eucaryotes, nous pouvons voir qu'il existe une grande similitude dans la façon dont ces groupes d'organismes éliminent les dommages de l'ADN. Le génome des deux types d'organismes est soumis aux mêmes réactions chimiques, qui génèrent les mêmes substrats endommagés pour les protéines impliquées dans la réparation de l'ADN. On s'attend donc à ce que les voies biochimiques utilisées par les cellules eucaryotes pour répondre à de tels dommages soient similaires à celles bactériennes. Par exemple, la perte de purines et de pyrimidines de l'ADN produit des sites apuriniques ou apyrimidiniques (AP) qui sont réparés après l'action des endonucléases AP, qui catalysent l'incision de l'ADN exclusivement au niveau des sites AP, préparant ainsi l'ADN pour une excision ultérieure, une synthèse de réparation, et le scellement des brins. Cette voie est la même dans les organismes bactériens et eucaryotes et, de plus, il existe une conservation considérable des acides aminés parmi les endonucléases AP de ces deux types d'organismes, ce degré de conservation peut atteindre 41% (Popoff et al., 1990) . Cependant, il existe également des différences dans les systèmes de réparation de l'ADN des bactéries et des eucaryotes. Dans ce dernier cas, les scénarios métaboliques sont plus complexes, car certaines protéines ont de multiples fonctions dans les points de contrôle du cycle cellulaire, l'assemblage de la chromatine, la réparation de l'ADN et la réplication de l'ADN. En comparaison, une voie qui chez les bactéries n'implique que cinq protéines majeures est constituée d'au moins 15 autres protéines chez les eucaryotes, comme observé dans la voie de réparation par excision de nucléotides (Cleaver et al., 2001).

Dans cette revue, nous décrivons l'utilisation de bactéries comme outil pour le clonage et pour les études fonctionnelles des gènes de réparation de l'ADN eucaryotes.

LES VOIES MAJEURES DE LA RÉPARATION DE L'ADN

Toutes les protéines, bactériennes à humaines, impliquées dans la réparation de l'ADN peuvent être regroupées dans les principales catégories fonctionnelles suivantes : a) inversion des dommages, b) réparation par excision de base (BER), c) réparation par excision de nucléotides (NER) et d) réparation des mésappariements (MMR). Nous décrivons les aspects moléculaires fondamentaux et les plus récemment découverts de chaque voie, en utilisant le système bactérien comme modèle pour la réparation de l'ADN dans les études eucaryotes, qui sont examinés plus loin dans cette revue.

L'inversion directe des dommages à l'ADN est de loin le mécanisme de réparation le plus simple décrit jusqu'à présent. Il se compose d'une chaîne polypeptidique unique, aux propriétés enzymatiques, se liant aux dommages et rétablissant le génome de l'ADN à son état normal en une seule étape de réaction. Les principaux polypeptides impliqués dans cette voie sont : a) l'ADN photolyase, qui est l'enzyme responsable de l'élimination des dimères de cyclobutane pyrimidine de l'ADN dans un processus photo-dépendant appelé photoréactivation (Carell et al., 2001), et b) O6-méthylguanine- ADN méthyltransférase I et II, également appelées ADN-alkyltransférases, qui éliminent les bases modifiées O6-alkylguanine et O4-alkylthymine et les alkylphosphotriesters phosphate modifiés (méthylphosphotriesters) (Pegg, 2000) de l'ADN. La protéine photolyase ne se trouve pas dans toutes les cellules vivantes. La plupart des études ont systématiquement échoué à fournir des preuves biologiques ou biochimiques de la photoréactivation chez les primates. Cependant, les ADN-alkyltransférases sont très répandues dans la nature. L'activité de ce groupe d'enzymes a été identifiée dans des extraits de Aspergillus nidulans, Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, des poissons et dans des cellules de mammifères (Friedberg et al., 1995).

EXCISION DES DOMMAGES À L'ADN

Il existe trois voies principales de réparation par excision d'ADN : i) BER, ii) NER et iii) MMR. Dans ces réactions, un segment nucléotidique contenant des dommages de base, une distorsion en double hélice ou des bases mal appariées est remplacé par la séquence nucléotidique normale dans un nouveau processus de synthèse d'ADN polymérase. Toutes ces voies ont été caractérisées chez les organismes bactériens et eucaryotes.

Le BER est initié par les ADN glycosylases, qui catalysent l'hydrolyse des liaisons N-glycosyliques, liant des types particuliers de bases chimiquement modifiées au squelette désoxyribose-phosphate. Ainsi, les dommages à l'ADN sont excisés sous forme de bases libres, générant des sites de perte de bases appelés sites apuriniques ou apyrimidiniques (AP). Un autre moyen de génération de sites AP est la dépurination ou la dépyrimidation de l'ADN, en raison de l'hydrolyse spontanée des liaisons N-glycosyliques. Les sites AP sont des substrats pour les endonucléases AP. Ces enzymes produisent des incisions dans l'ADN duplex à la suite de l'hydrolyse d'une liaison phosphodiester immédiatement en 5' ou 3' de chaque site AP. Le squelette ribose-phosphate est ensuite retiré de l'ADN par l'action d'une exonucléase spécifique appelée désoxyribophosphodiestérase ou dRpase. Enfin, l'ADN polymérase et une ligase catalysent l'incorporation d'un désoxyribonucléotide spécifique dans le site réparé, permettant un appariement correct des bases (Figure 1) (Friedberg et al., 1995).

La réparation par excision de base est un mécanisme de réparation de l'ADN enzymatique multiple dans lequel chaque enzyme fonctionne séparément. Ce scénario a été maintenu au cours de l'évolution. Connues chez les bactéries, plusieurs ADN glycosylases et endonucléases AP ont également été décrites chez les eucaryotes inférieurs et supérieurs, tels que Trypanosoma cruzi (Pérez et al., 1999), Leishmania majeure (Perez et al., 1999), levures, poissons, plantes, C. elegans, Drosophile et les mammifères (Friedberg et al., 1995). Le BER est essentiel pour protéger l'ADN de divers types de lésions, telles que : uracile, hydroxyméthyluracile, méthylcytosine, hypoxanthine, mésappariements GT, 3-méthyladénine, 7-méthylguanine, 3-méthylguanine, formamidopyrimidine, 8-hydroxyguanine, thymine 5,6-hydratée , et les dimères de pyrimidine (Friedberg et al., 1995). Chacun d'eux est reconnu par une ADN glycosylase spécifique.

Réparation par excision de nucléotides

Plusieurs types d'agents génèrent des adduits de base volumineux dans l'ADN, entraînant une distorsion importante de l'hélice d'ADN. Le plus largement étudié de ces agents endommageant l'ADN est le rayonnement UV, responsable des dimères de thymine, qui produisent une courbure de

30° dans l'ADN (Husain et al., 1988). Certains agents chimiques forment des liaisons croisées de l'ADN, qui sont particulièrement dangereuses. Ces liaisons croisées produisent des distorsions de conformation dans l'ADN. Ce sont des substrats pour les endonucléases d'ADN qui font une incision dans l'ADN, plusieurs nucléotides de chaque côté de la lésion, générant un fragment d'oligonucléotide potentiel. Des réactions d'hélicase ultérieures favorisent l'excision de ce fragment. L'espace résultant est rempli par la synthèse d'ADN polymérase et scellé de manière covalente par l'ADN ligase. Ces réactions enzymatiques séquentielles, initiées par une endonucléase spécifique qui reconnaît la distorsion de l'ADN, sont appelées NER. Cette voie a été décrite à l'origine dans la réparation de l'ADN dans les cellules exposées au rayonnement UV, qui produit des lésions telles que des dimères de pyrimidine et 6-4 photoproduits qui sont excisés par voie enzymatique de l'ADN sous forme de nucléotides intacts plutôt que de bases libres. Le NER est un processus biochimique beaucoup plus complexe que le BER, en particulier dans les cellules eucaryotes. Plusieurs produits géniques sont nécessaires dans un processus en plusieurs étapes, au cours duquel l'assemblage ordonné de protéines d'ADN fournit un complexe enzymatique qui distingue l'ADN endommagé de l'ADN non endommagé.

Dans Escherichia coli il existe trois protéines spécifiques, appelées UvrA, B et C, impliquées dans la reconnaissance des lésions et l'incision des endonucléases. An assembly of two UvrA and one UvrB protein binds to DNA nonspecifically this assembly translocates unidirectionally in the genome, driven by the energy of ATP hydrolysis (Grossman and Yeung, 1990). This mechanism allows constant monitoring for base damage in living cells. It has been suggested that when a damaged site is found, UvrA proteins dissociate and a stable UvrB-DNA complex is formed (Grossman and Yeung, 1990). Then the UvrC protein associates with high affinity to the UvrB-DNA site and induces a conformational change that enables bound UvrB protein to nick the DNA at the fourth nucleotide, 3' to the site of damage (Grossman and Yeung, 1990). This reaction requires the binding of ATP by UvrB protein, however, no ATP hydrolysis occurs at this time (Grossman and Yeung, 1990). Following the 3' incision, UvrC protein catalyzes nicking of the DNA at the seventh nucleotide, 5' to the damage (Grossman and Yeung, 1990). Thus, a stretch of 12 nucleotides is held in the DNA by only hydrogen bonds. This fragment is released by UvrD helicase action, generating a gap that is finally submitted to repair synthesis (Figure 2) (Grossman and Yeung, 1990).

The long patch MMR machinery is present in several organisms. Its function is to remove base substitution and frameshift mismatches that escape from DNA polymerase proofreading activity after DNA replication, increasing DNA replication fidelity 100- to 1000-fold (Modrich and Lahue, 1986). Dans E. coli, the factors that are exclusively involved in MMR are encoded by mutS, mutL et mutH genes (Lahue et al., 1989).

The MutS protein homodimers recognize and bind specifically to base-base mispairing and insertion/deletion loop-outs (IDL). Then, MutS, in association with MutL protein homodimers, activates the MutH protein to make an excision-initiating nick in the unmethylated, newly synthesized strand. The nicked strand containing the mismatch or IDL is excised by exonucleases and resynthesized by DNA polymerase and DNA ligase (Figure 3) (Marra and Schär, 1999).

The current picture of MMR in eukaryotic cells resembles that of E. coli to a great extent, but with two important differences. The first is related to strand discrimination. In eukaryotes the hemimethylation status of newly replicated DNA does not play a role in directing the MMR. No MutH homologue has been identified and it has been proposed that strand discrimination is mediated by strand discontinuities in the newly synthesized DNA. The second fundamental difference is that the MutS and MutL functional homologues are heterodimeric rather than homodimeric. At least six MutS homologues and five MutL homologues, referred to as MSH and MLH, respectively, have been identified in eukaryotes. The best characterized of these factors are MSH2, MSH3 and MSH6, which are involved in MMR in the nucleus. MSH2-MSH6 heterodimers recognize and repair base mismatches and loops of up to two bases, whereas MSH2-MSH3 heterodimers recognize loop-outs of different sizes (Drumond et al., 1995 Marsischky et al., 1996). MSH4 and MSH5 proteins constitute another MSH heterodimer, which, however, does not participate in MMR, but instead is involved in meiotic crossing-over and chromosome segregation (Figure 3) (Nakagawa et al., 1999). MSH1 is targeted to the mitochondria and is necessary for mitochondrial stability in yeast (Reenan and Kolodner, 1992).

CLONING AND CHARACTERIZATION OF EUKARYOTIC DNA REPAIR GENES USING ESCHERICHIA COLI

Complementation with homologous genes

In 1985, Sancar described the use of E. coli as an instrument to study eukaryotic DNA repair genes. A fragment carrying the photolyase gene (PHR1) of Saccharomyces cerevisiae was cloned into an E. coli expression vector and introduced into E. coli strains deficient in DNA photolyase. Complementation of the E. coli phr-1 mutation was observed. This was the first time that a complementation approach was used to study eukaryotic DNA repair genes in E. coli.

After this, several other eukaryotic genes were identified and characterized by complementation assays in bacteria deficient in DNA repair. They were isolated from E. coli mutant cells transformed with a cDNA expression library, due to their ability to restore, at least partially, the resistance of the mutants to treatment with DNA damaging agents (Figure 4).

Chen et al. (1989) used this system to clone an S. cerevisiae gène. They used E. coli strains MV1932 (alkA1 and tag) and MV1902 (alkA150:: l pSG1 and tag), which have mutant alkA and tag gènes. These bacterial cells are sensitive to DNA damage by methylating agents, such as methyl methanesulfonate (MMS), due to the absence of either the AlkA ou la Tag gene product, respectively. The 3-methyladenine DNA glycosylase (MAG) from S. cerevisiae (ScMAG) was cloned from a genomic library, as it complemented the bacterial gene function, restoring the ability of the bacteria to survive in the presence of MMS. An additional enzymatic assay showed that extracts from deficient bacteria harboring the cloned yeast gene were able to excise modified bases from [H 3 ]-DMS-treated calf thymus DNA. Chromatographic procedures demonstrated that the excised base was 3-methyladenine. Sequence analyses established the identity of this gene as ScMAG and its expression in yeast-protected cells against the lethal effects of alkylating agents (Chen et al., 1990). This bacterial complementation strategy has also allowed the cloning of other MAG gènes. Humain MAG (hsMAG) was isolated from a human liver cDNA library (Samson et al., 1991). Its cDNA sequence has an open-reading frame of 894 base pairs and a sequence of 176 amino acids, sharing 85% identity with a rat glycosylase polypeptide. Enzymatic analyses showed the ability of three variants of the HsMAG protein to release methylated bases from DNA (O𠆜onnor, 1993). HPLC chromatography identified the modified bases as 3-methyladenine, 7-methylguanine and 3-methylguanine. Arabidopsis thaliana, Schizosaccharomyces pombe and rat MAGs have also been cloned and characterized using this bacterial system (O𠆜onnor and Laval, 1990 Santerre and Britt, 1994 Memisoglu and Samson, 1996). In addition to MAG genes, an S. cerevisiae akyl DNA glycosylase has also been cloned from a genomic DNA library, using an E. coli strain with a phenotype similar to the alkUNE tag double mutant (Berdal et al., 1990).

Genetic manipulation of E. coli to create mutator phenotype strains could also be used to clone DNA repair genes. Hydroxyl radical (OH · ) and singlet oxygen ( 1 O 2 ), produced endogenously by oxidative stress can generate complex modifications in DNA bases (Boiteux et al., 1992). One of these is the oxidized guanine, 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-OxoG), which can pair up with adenine instead of cytosine, causing a GC ® TA transition. The 8-OxoG residues can be removed from DNA by the action of FPG protein and the adenine residue opposite 8-OxoG can be excised by MutY protein. Hence, disruption of fpg et mutY genes could be used to create a mutator phenotype strain in order to select for DNA repair genes involved in 8-OxoG excision. Les S. cerevisiae OGG1 gène (ScOGG1) was cloned this way (van der Kemp et al., 1996). UNE fpg mutY-double mutant E. coli strain was transformed with a yeast genomic DNA library and clones that partially suppressed the bacterial mutator phenotype were selected. The loss of the ability to generate mutants was visualized by the reduction in the number of colonies resistant to the antibiotic rifampicin. ScOGG1 protein purified from over expression in E. coli was used to confirm the enzymatic nature of this gene product in experiments with 8-OxoG excision from calf thymus DNA. Mouse and human homologues involved in 8-OxoG excision have also proven their ability to promote the loss of a mutator phenotype in a rifampicin-resistance assay, providing additional information for the characterization of OGG1 (Rosenquist et al., 1997 Aburatani et al., 1997 Arai et al., 1997 Sugimura et al., 1999). Kohno et al. (1998) have also used this bacterial complementation assay to study differences in 8-OxoG repair caused by human polymorphic OGG1 gènes. The gene product with a Ser at codon 326 had an increased efficiency of complementation compared to its Cys counterpart.

An interesting approach to study eukaryotic DNA repair genes is the employment of E. coli mutator or sensitive phenotype reversion in order to select and characterize mutant genes. Christians and Loeb (1996) have used a D ada-25 Cm r ogt-1::Kan r E. coli strain to search for mutations in human O 6 -methylguanine DNA methyltransferase (hsMGMT) that could maintain the complementation phenotype in the deficient bacterial strain. This bacterial strain, which lacks the ada et ogt gene products, is sensitive to alkylating agents such as N-methyl-N 9 -nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) and to the chemotherapeutic nitrosoureas. A plasmid library harboring the human MGMT gene, randomly mutated in a region surrounding the Cys active residue, was used to transform these deficient bacteria. Clones were selected by their ability to grow in the presence of MNN and also to reverse the mutator phenotype. As the chosen region is evolutionary conserved, few amino acid changes were found. Using this strategy of mutant identification in an ada ogt deficient bacterial strain, Xu-Welliver et al. (1999) tested for hsMGMT mutation at codon 160, which rendered the bacteria resistant to O 6 -benzylguanine (BG). A cDNA from this gene was randomly mutated at this position and used to transform bacterial strains lacking alkyltransferase activity. As it is an inhibitor of human MGMT protein (Dolan et al., 1990 Dolan and Pegg, 1997), this drug has been used in clinical trials to improve the efficiency of akylating drugs such as BCNU and temozolomide (Friedman et al., 1998). Polymorphic G160R hsMGMT has been found in some individuals (Imai et al., 1995), and this polymorphism has been associated with BG resistance (Edara et al., 1996). Fourteen amino acid substitutions at codon 160 have been related to BG resistance (Xu-Welliver et al., 1999), all of them protecting the E. coli mutant strain against MNNG damage. Enzymatic analysis of bacterial extracts or purified protein have proven the effectiveness of these mutant proteins in repairing O 6 -[ 3 H]-methylguanine, although with a lower activity than wild type extracts.

Bacterial complementation by eukaryotic genes could be used to study genetic polymorphisms or mutants, as has been shown for the hsMGMT gène. Another example of successful exploration of this approach involves DNA polymerase b (pol b ) gene studies. Sweasy and Loeb (1992) showed the ability of rat pol b to complement the activity of DNA pol I from an E. coli strain, which has a mutation in the DNA pol I gene (polA12) that makes bacterial cells unable to grow at high temperatures. This complementation system has opened new perspectives to identify mutations in the rat pol b sequence that impair polymerase function. Rat pol b cDNA has been used to construct a library of pol b cDNA mutants by treatment with nitrous acid, PCR amplification and bacterial cloning (Sweasy and Loeb, 1993). Sensitive bacteria were transformed with the mutant cDNA library and clones with partial or total loss of polymerase activity were selected. A total of 1186 bacterial transformants were tested for their ability to grow in the presence of MMS at 42°C. Polymerase function was altered in 263 clones. Sequence analysis of 10 clones confirmed single-base substitutions. Fifty-six mutants were unable to grow in both conditions and the others only lost the ability to grow at 42°C. This work has demonstrated the possibility of employment of this polA12 strain in mutant selection. Further mutant characterization was carried out to identify the low fidelity polymerase mutants that conferred the enzymatic mutator phenotype (Washington et al., 1997). Two methods were used to create the mutant library: the first one was nitrous acid treatment, followed by PCR amplification and bacterial cloning, and the other one was PCR under mutagenic conditions. After selection for ability to complement the polA12 strain, positive clones were tested for promotion of trp mutation reversion, which could be associated with the mutator phenotype. Three rat pol b mutants were identified and characterized. One of them had a Y265C substitution and a mutation rate 30-fold higher than the wild type. This mutator enzymatic activity was detected by an in vitro activity assay. The other two had a P312S and a Y265H substitution, respectively, and the mutation rates were increased 10-fold in comparison to wild type. The mutation in the three clones that were analyzed is located in the protein’s carboxyl terminus at an external position on the DNA-binding cleft. Similar to hMGMT, it was also possible to identify drug-resistant mutants of the rat pol b gene (Kosa and Sweasy, 1999). A cDNA library was generated in a mutagenic PCR condition that guaranteed mostly single-base changes and was used to transform a polA12 E. coli souche. The transformed bacteria were then challenged for growth in the presence of 3'-Azido-3'-deoxythymidine (AZT) at 42°C. The rat pol b is able to incorporate AZT into DNA during synthesis, causing cell death. The clones able to grow in the presence of AZT at 42°C kept their enzymatic activity, but they lost the ability to incorporate AZT. Two mutants were selected, D246V and R253M they gave a more effective discrimination against AZT than the wild type protein. The D246V mutant had a 10-fold decrease in the catalytic efficiency of AZT incorporation but dTTP incorporation was unaffected. On the other hand, the R253M mutants showed a moderate efficiency in AZT incorporation, combined with a perturbation in dTTP incorporation. These amino acid substitutions are close to the nucleotide-binding pocket and could affect nucleotide discrimination and selection.

All the examples above are from damage reversal or base excision repair. This is due to the fact that the proteins involved in these pathways can work separately and do not need to interact with other proteins to accomplish their function. The study of genes involved in NER and MMR is more difficult. A good example is the study of the MSH2 gene, the eukaryotic homologue of the E. coli MMR gene MutS. It has been shown that the expression in E. coli of a eukaryotic protein related to the MutS family results in an increased mutation rate in the bacteria, due to lack of interaction of the heterologous protein with the normal bacterial repair machinery (Augusto-Pinto et al., 2001).

Complementation with non-homologous genes

Besides phenotype complementation with homologous genes, the use of DNA-repair-deficient E. coli strains to select for genes involved in this DNA metabolism pathway have provided a means for the selection and characterization of new genes that are involved in DNA repair but are not homologous with known DNA repair proteins.

Pang et al. (1992, 1993) employed this technique to obtain clones that complement E. coli souche recA - , uvr - , phr - (genes related to DNA repair). One of the isolated cDNAs partially complements recombination related (RecA - ) phenotypes. Another three cDNAs also partially corrected the E. coli mutant phenotypes, but their molecular roles were not clearly identified. Most of these cDNAs are apparently targeted to chloroplasts.

Among 840 survivors of heavily UV-irradiated mutants harboring plasmids derived from an Arabidopsis cDNA library, four unique plant cDNAs were identified. Two of them were specific for UV-light damage, and complemented both UvrB- and UvrC- phenotypes in the dark. These cDNAs showed no extensive amino acid homology with known DNA repair proteins. Although the light dependence of one cDNA activity was consistent with its identification as a photoreactivating enzyme, its predicted amino acid sequence did not resemble known photolyase sequences (Pang et al., 1992). The latter cDNA increased the resistance of RecA-UvrB-Phr- bacteria to mitomycin C and MMS as well as to UV light. This lack of specificity, and its ability to increase resistance in both UvrB- et UvrC- mutants, suggested that cDNA activity might be complementing RecA- phénotypes. The partial complementation of three RecA- phenotypes could be due the activities of this gene in homologous recombination. The 395-amino acid open-reading frame encodes an apparent N-terminal chloroplast transit peptide and a putative 322-residue mature protein, with a conserved nucleotide-binding motif but otherwise little global homology with bacterial RecA proteins (Pang et al., 1993).

Using the same strategy, Machado et al. (1996) isolated a DNA repair-related gene from Arabidopsis thaliana that was able to complement bacteria defective in enzymes that play a part in the initial steps of base excision repair. Les E. coli strain employed was the triple mutant BW535 (xth,nfo,nth), defective in the DNA repair endonucleases: exonuclease III, endonuclease IV and endonuclease III. These enzymes are involved in the first steps of base excision repair of DNA lesions normally mediated by oxidative and alkylation products (Doetsch and Cunningham, 1990). The mutant strain presents a hypersensitive phenotype to agents that produce oxygen radicals, such as hydrogen peroxide, and to alkylating agents, such as MMS (Cunningham et al., 1986). The screening was performed by transfecting a cDNA library from Arabidopsis thaliana into BW535 and selecting clones that had increased resistance to MMS. One clone was isolated and characterized. Cette Arabidopsis cDNA also confers MMS resistance to E. coli strain BW9109, which is defective only in the product of the xth gene (exonuclease III) and it is also able to enhance survival after UV irradiation of the UV-sensitive uvrA E.coli strain AB1886, defective in nucleotide excision repair. This lack of specific activities suggests a general role in DNA damage tolerance rather than damage removal. This cDNA is targeted to chloroplasts and mitochondria. Surprisingly, this cDNA was found to be a homologue of yeast thiamine biosynthesis genes, THI4 de S. cerevisiae et nmt2 de S. pombe that are involved in the formation of the thiazole precursor of thiamine. The ability of the Arabidopsis cDNA to functionally complement the yeast thi4 disruption strain suggests that it has a similar role in plant thiamine biosynthesis, so it was named Thi1. In addition, the Thi4-deficient yeast strain also showed a phenotype of mitochondrial DNA instability after treatment with genotoxic drugs, such as MMS and after UV irradiation (Machado et al., 1997). This mitochondrial DNA instability phenotype was complemented by the Arabidopsis Thi1 gene (Machado et al., 1997). Thus, it appears that Arabidopsis Thi1 and S. cerevisiae Thi4 proteins have a dual role in DNA repair and thiamine biosynthesis.

These examples demonstrate only part of the potential utilization of bacterial systems for the study of DNA repair genes. These techniques are facilitated by the ease and rapidity of bacterial manipulations and by our knowledge of E. coli DNA repair genes. These features have allowed bacteria to be used in cloning and complementation studies of both native and mutated gene products.

Research supported by Conselho Nacional de Pesquisas (Brazil), Comissão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES/COFECUB), the World Health Organization, Programa de Núcleos de Excelência and Pró-Reitoria de Pesquisa, Universidade Federal de Minas Gerais.

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