Informations

Existe-t-il des différences dans les taux de cholestérol de la membrane cellulaire entre les types cellulaires ?


Avec différents types de cellules et fonctions cellulaires, y a-t-il des niveaux distincts de cholestérol dans la membrane cellulaire de chaque type de cellule, ou tous les types de cellules ont-ils une quantité de cholestérol similaire ?

Je suppose que certains types de cellules nécessitent différents niveaux de stabilité de la membrane cellulaire et, en tant que tels, différents niveaux de cholestérol dans cette membrane cellulaire.


Oui, il existe des différences dans les taux de cholestérol de la membrane cellulaire entre les différents types de cellules humaines.

Ce tableau d'Alberts (2002) montre la différence de composition en cholestérol dans une cellule hépatique, un globule rouge et une cellule/oligodendrocytes de Schwann (myéline) :

Table: Compositions lipidiques approximatives de différentes membranes cellulaires

En plus de cela, le tableau montre qu'il existe une différence dans la composition du cholestérol entre les différentes membranes d'une même cellule (comparer membrane plasma, mitochondrie et urgence). En fait, c'est une différence plus célèbre, représentée dans cette figure de Lehninger (2000) :

Chiffre: Composition lipidique de la membrane plasmique et des membranes organelles d'un hépatocyte de rat. La spécialisation fonctionnelle de chaque type de membrane se reflète dans sa composition lipidique unique. Le cholestérol est prédominant dans les membranes plasmiques mais à peine détectable dans les membranes mitochondriales.

Sources:

  • Alberts, B. (2002). Biologie moléculaire de la cellule. New York : Garland Science.
  • Lehninger, A., Nelson, D., Cox, M. (2000). Principes de biochimie. New York : ça vaut le coup.

Vous avez raison, différentes cellules ont différentes quantités de cholestérol dans la membrane. Par exemple, un globule rouge aura plus de cholestérol dans sa membrane qu'une cellule épithéliale dans l'intestin grêle. Ce serait parce que la cellule sanguine flotte librement dans le corps plutôt que d'adhérer physiquement à quelque chose, donc un plus grand niveau de stabilité est nécessaire. Il dépend uniquement de la fonction des cellules.


La découverte et la structure des cellules_version précédente

En 1655, le scientifique anglais Robert Hooke a fait une observation qui allait changer à jamais la théorie et la recherche biologiques fondamentales. En examinant une section séchée de chêne-liège avec un microscope optique rudimentaire, il a observé de petites chambres et les a nommées cellules. En une décennie, les chercheurs ont déterminé que les cellules n'étaient pas vides mais plutôt remplies d'une substance aqueuse appelée cytoplasme.

Au cours des 175 années suivantes, la recherche a conduit à la formation de la théorie cellulaire, d'abord proposée par le botaniste allemand Matthias Jacob Schleiden et le physiologiste allemand Theodore Schwann en 1838 et formalisée par le chercheur allemand Rudolf Virchow en 1858. Dans sa forme moderne, ce théorème a quatre parties de base:

  1. La cellule est l'unité structurelle et fonctionnelle de base de la vie. Tous les organismes sont composés de cellules.
  2. Toutes les cellules sont produites par division de cellules préexistantes (c'est-à-dire par reproduction). Chaque cellule contient du matériel génétique qui est transmis au cours de ce processus.
  3. Toutes les fonctions chimiques et physiologiques de base - par exemple, la réparation, la croissance, le mouvement, l'immunité, la communication et la digestion - sont exécutées à l'intérieur des cellules.
  4. Les activités des cellules dépendent des activités des structures subcellulaires au sein de la cellule (ces structures subcellulaires comprennent les organites, la membrane plasmique et, le cas échéant, le noyau).

La théorie cellulaire conduit à deux généralités très importantes sur les cellules et la vie dans son ensemble :

  1. Les cellules sont vivantes. Les cellules individuelles de vos organes sont tout aussi « vivantes » que vous, même si elles ne peuvent pas vivre de manière indépendante. Cela signifie que les cellules peuvent prendre de l'énergie (qui, selon le type de cellule, peut être sous forme de lumière, de sucre ou d'autres composés) et des matériaux de construction (protéines, glucides et graisses), et les utiliser pour se réparer et créer de nouvelles générations. de cellules (reproduction).
  2. Les caractéristiques et les besoins d'un organisme sont en réalité les caractéristiques et les besoins des cellules qui composent l'organisme. Par exemple, vous avez besoin d'eau parce que vos cellules ont besoin d'eau.

Matériaux et méthodes

Plasmides et mutagenèse

Les plasmides portant des substitutions d'alanine ont été préparés à partir de pHXB2 (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program Cat. Number 526 (25)) et pJRFL qui, afin de correspondre à l'arrière-plan de pHXB2, a été cloné dans le plasmide d'arrière-plan pSV7D de pCAGGSJRFL un cadeau de James M. Binley (26). La mutagenèse a été réalisée à l'aide du kit de mutagenèse dirigée Stratagene QuikChange II XL et les modifications ont été vérifiées par séquençage d'ADN (Roswell Park Cancer Institute DNA Sequencing Laboratory). Le plasmide exprimant Rev était pCMV-rev (pRev-1) (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program Cat. Number 1443 (27)) et le plasmide exprimant Tat était pCEP4-Tat (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program Cat. Number 4691 (28))

Fusion cellule-cellule

Pour le test de fusion cellule-cellule, le plasmide d'enveloppe pHXB2 ou pJRFL, WT ou chaque mutant, ont été co-transfectés, avec des plasmides pour les protéines virales Tat et Rev, par précipitation au phosphate de calcium dans des cellules 293T (ATCC), maintenues dans l'Eagle modifié de Dulbecco Milieu (DMEM) avec 10 % de sérum bovin foetal (FBS), 1 % de pénicilline-streptomycine. Vingt-quatre heures après la transfection, les cellules ont été retirées de la plaque et comptées, puis ensemencées à 2 × 10Ɽ cellules/puits avec 2 × 10Ɽ cellules/puits de la lignée cellulaire réceptrice, TZM- bl (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program Cat. Number 8129 (29)), dans une plaque à 96 puits. Les plaques ont été incubées pendant la nuit à 37 ଌ dans un 5% de CO2 incubateur. Après 24 heures, les niveaux de fusion membranaire ont été mesurés par un test de luciférase (One-glo, Promega) selon le protocole du fabricant en utilisant le lecteur de plaques Spectra Max M5 (Molecular Devices), et les niveaux ont été normalisés aux niveaux de fusion WT. Les expériences ont été réalisées en triple de l'étape de transfection à la mesure de l'activité luciférase ainsi, les incertitudes incluent toutes les étapes de la procédure expérimentale.

Entrée virale

Pour le test d'entrée virale, les plasmides pHXB2 ou pJRFL, WT et chaque mutant, et pNL4𠄳.HSA.RE- (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program Cat. Number 3417 (30)) ont été co-transfectés par précipitation au phosphate de calcium dans Cellules 293T, qui ont été maintenues dans du DMEM avec 10 % de FBS, 1 % de pénicilline-streptomycine. Quarante-huit heures après la transfection, le milieu a été récolté et filtré à travers un filtre de 0,45 μM et centrifugé à 55 000 × g pendant 1 heure pour constituer le stock de virus. Le titre infectieux du virus de type sauvage (WT) a été mesuré par coloration X-gal comme décrit précédemment (31). Le test immuno-enzymatique de capture de l'antigène p24 du VIH-1 (AIDS & Cancer virus program, NCI at Fredererick) a été effectué pour déterminer des quantités équivalentes de particules virales mutantes enveloppées au virus WT à MOI 0,01. Ensuite, la quantité de p24 à multiplicité d'infection (MOI) 0,01 de WT a été utilisée pour normaliser le nombre de particules virales et 100 ng/mL de concentration de p24 de chaque virus muté ont été utilisés tout au long de l'article. Les cellules réceptrices, TZM-bl, qui ont été maintenues dans du DMEM avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine, ont été ensemencées à 2 × 10Ɽ cellules/puits dans une plaque de 96 puits dans un volume de 100 ul . Le lendemain, le milieu a été retiré et 100 ul du stock de virus (MOI 0,01, 100 ng/mL de p24) ont été ajoutés dans chacun des puits. Les plaques ont été centrifugées à 3000 × g pendant une heure puis incubées à 37 ଌ dans un 5% CO2 incubateur. Après 48 heures, les niveaux d'entrée virale ont été mesurés par un test de luciférase tel que décrit ci-dessus pour le test de fusion cellule-cellule.

Quantification des protéines

Le culot viral a été préparé par ultracentrifugation à 55 000 tr/min pendant 1 h en utilisant un rotor Beckman SW55Ti. Les culots ont été remis en suspension dans le tampon de lyse : 50 mM de Tris, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 5 mM d'EDTA, 0,5 % de Nonidet P-40 et 0,1 % de SDS. Les lysats cellulaires 293T ont été collectés en utilisant le réactif d'extraction de protéine M-Per Mammalian (Thermo Scientific). Les lysats cellulaires et les culots de virus ont été normalisés pour la concentration totale de protéines en utilisant le kit de dosage de protéines BCA (Pierce).

Analyse Western Blot

Après électrophorèse, transfert et blocage, les transferts ont été sondés avec un anticorps monoclonal anti-VIH-1 gp41 de souris (Chessie 8 National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Program Cat. Number 526 (32)) et anti-HIV-1 gp120 anticorps polyclonal (US Biologique). Pour s'assurer que le stock de virus contient des quantités égales de particules virales, la normalisation a été effectuée sur la base de transferts western pour les niveaux de p24 en utilisant l'anticorps monoclonal anti-VIH-1 p24 (National Institute of Health AIDS Research and Reference Reagent Program). La concentration en protéines totales a été déterminée en utilisant le test BCA comme décrit ci-dessus et 10 μg de protéines totales ont été chargées par piste. L'anticorps secondaire utilisé était l'IgG anti-souris d'âne conjugué à l'IR800 pour gp41 et p24 et l'IgG de lapin anti-chèvre conjugué à l'IR-700 pour la gp120 et les transferts ont été scannés et analysés à l'aide du système d'imagerie infrarouge Odyssey (LI-COR).


Introduction

Les neutrophiles, également connus sous le nom de leucocytes polymorphonucléaires (PMN), sont le type cellulaire le plus abondant dans le sang humain. Ils sont produits dans la moelle osseuse en grand nombre, 縐 11 cellules par jour. Dans des conditions homéostatiques, les neutrophiles entrent dans la circulation, migrent vers les tissus, où ils complètent leurs fonctions, et sont finalement éliminés par les macrophages, le tout en l'espace d'une journée. Les neutrophiles sont des cellules effectrices importantes dans le bras inné du système immunitaire (Mayadas et al., 2014). Ils patrouillent constamment dans l'organisme à la recherche de signes d'infections microbiennes et, lorsqu'elles sont détectées, ces cellules réagissent rapidement pour piéger et tuer les agents pathogènes envahisseurs. Trois fonctions antimicrobiennes principales sont reconnues pour les neutrophiles : la phagocytose, la dégranulation et la libération de matériel nucléaire sous forme de pièges extracellulaires de neutrophiles (TNE) (Figure 1). Ces fonctions étaient considérées, jusqu'à récemment, comme le seul but des neutrophiles. Cependant, les recherches actuelles menées par des chercheurs dans plusieurs domaines de la biologie cellulaire des neutrophiles ont révélé que les neutrophiles possèdent un répertoire très diversifié de réponses fonctionnelles qui vont au-delà de la simple destruction de micro-organismes. Les neutrophiles répondent à de multiples signaux et réagissent en produisant plusieurs cytokines et autres facteurs inflammatoires qui influencent et régulent l'inflammation ainsi que le système immunitaire (Nauseef et Borregaard, 2014 Scapini et Cassatella, 2014). De nos jours, il est reconnu que les neutrophiles sont des cellules complexes transcriptionnellement actives (Ericson et al., 2014) qui produisent des cytokines (Tecchio et Cassatella, 2016), modulent les activités des cellules voisines et contribuent à la résolution de l'inflammation (Greenlee-Wacker, 2016) , régulent les macrophages pour des réponses immunitaires à long terme (Chen et al., 2014), participent activement à plusieurs maladies dont le cancer (Uribe-Querol et Rosales, 2015 Mishalian et al., 2017), et ont même un rôle dans la mémoire immunitaire innée (Netea et al., 2016).

Figure 1. Mécanismes antimicrobiens des neutrophiles. Lorsque les neutrophiles reconnaissent les agents pathogènes microbiens, ils déploient différentes fonctions pour les détruire. La phagocytose implique l'ingestion du micro-organisme dans une vacuole phagocytaire qui, lors de la maturation, devient un phagolysosome. Dans ce nouvel organite, le micro-organisme est détruit par l'action du pH bas et des enzymes dégradantes. Les neutrophiles dégranulent également et libèrent dans leur environnement le contenu de leurs granules. Lorsque le micro-organisme est trop gros pour être ingéré, les neutrophiles peuvent également produire des pièges extracellulaires (TNE) formés par les fibres d'ADN et les protéines des granules.

La multitude de réponses fonctionnelles des neutrophiles est induite par l'activation transcriptionnelle et par des changements dans l'expression des molécules de surface ou de l'activité. Ces changements phénotypiques ne sont généralement détectés que dans un sous-ensemble de neutrophiles, ce qui suggère qu'il existe une grande hétérogénéité des neutrophiles (Beyrau et al., 2012). Les neutrophiles présentent des phénotypes différents depuis le moment où ils quittent la moelle osseuse et entrent dans la circulation (neutrophiles frais) jusqu'au moment où ils disparaissent de la circulation (neutrophiles âgés). Ce changement de phénotype est connu sous le nom de vieillissement, car il se produit en une seule journée et se traduit par divers neutrophiles aux propriétés distinctes (Adrover et al., 2016). De plus, le microenvironnement dans différents tissus peut inciter les neutrophiles à acquérir des fonctions spécialisées. Ainsi, le fait que les neutrophiles puissent afficher de nombreux phénotypes fonctionnels soutient en outre l'existence de plusieurs sous-ensembles de neutrophiles.

Le cancer est une affection particulière, dans laquelle le nombre de neutrophiles en circulation augmente et le phénotype de ces cellules change au cours de la progression tumorale. Dans le cancer avancé, plusieurs sous-populations de neutrophiles circulants présentant différentes caractéristiques de maturité, de cytotoxicité tumorale et de suppression immunitaire ont été décrites (Sagiv et al., 2015), y compris les cellules suppressives dérivées des myéloïdes granulocytaires (G-MDSC). Cependant, ces différents types cellulaires ne sont pas clairement définis et leur existence en tant que sous-ensembles de neutrophiles authentiques ou même en tant que type cellulaire complètement différent est aujourd'hui un sujet controversé. Pour la plupart des chercheurs, il est clair que les différences dans les protéines de la membrane plasmique et les réponses fonctionnelles des neutrophiles dans divers contextes sont des preuves solides de la remarquable plasticité des neutrophiles. Pourtant, cette hétérogénéité des neutrophiles n'est pas étayée par des critères de consensus permettant de définir les populations de neutrophiles dans le sang et dans les tissus. De plus, la stabilité des phénotypes observés dans ces sous-populations n'est pas claire. Ces sous-ensembles de neutrophiles authentiques ou simplement divers stades d'activation sont-ils affichés en réponse à des facteurs locaux ?

Le but de cette revue est de mettre en évidence les différences dans les réponses fonctionnelles des neutrophiles et d'autres types de cellules, tels que G-MDSC, qui peuvent ou non être des sous-populations de neutrophiles circulants. Nous présentons les caractéristiques des différents types de neutrophiles, décrivons leurs fonctions et discutons des relations possibles entre eux.


Discussion

Les gènes exprimés dans chaque type cellulaire définissent leur fonction et leurs réponses aux signaux internes et externes. Nous rapportons ici une stratégie robuste pour l'expression spécifique de type cellulaire et le profilage épigénétique du cerveau post-mortem humain qui intègre les caractéristiques de plusieurs protocoles antérieurs pour des études monocellulaires ou basées sur la population des types de cellules du SNC. Nous démontrons que les anticorps contre les protéines ER ou membranaires spécifiques aux cellules peuvent souvent être utilisés pour trier les noyaux isolés, augmentant considérablement les anticorps candidats qui peuvent être utilisés à cette fin. Nous rapportons un profil d'expression génique spécifique au type cellulaire très précis et complet des neurones et de la glie des cerveaux de souris, de rat et d'humain. En utilisant cette méthodologie, nous constatons que même définis de manière classique, les types de cellules cérébelleuses diffèrent entre la souris et l'homme par l'expression de centaines de gènes orthologues. L'expression spécifique à l'espèce est confirmée par l'analyse des données de transcriptome à noyau unique des mêmes types de cellules murines (Saunders et al., 2018) et humaines (Lake et al., 2018), et par des tests ATAC-seq démontrant que l'expression active est accompagnée de accessibilité améliorée à la chromatine. Fait intéressant, les gènes exprimés dans les neurones granulaires humains mais pas chez la souris sont fréquemment exprimés dans d'autres régions du cerveau de la souris. L'analyse des données spécifiques aux types cellulaires de seize cerveaux post-mortem humains révèle que les conséquences moléculaires spécifiques du vieillissement diffèrent entre les types cellulaires, bien que dans chaque cas, l'expression des gènes impliqués dans le développement et le maintien des synapses soit diminuée. Enfin, nous rapportons l'induction d'une réponse moléculaire robuste et spécifique au type cellulaire d'étiologie inconnue dans les cellules granulaires de trois des seize donneurs. Prises ensemble, les expériences que nous présentons documentent une méthodologie précise pour une analyse complète de types de cellules spécifiques dans le cerveau des rongeurs et des humains, et démontrent que cette approche peut fournir une voie améliorée pour l'enquête sur les événements moléculaires associés à la fonction et au dysfonctionnement des types de cellules humaines.

Expression génique spécifique à l'espèce et au type cellulaire dans le cerveau des mammifères

Bien qu'une définition consensuelle du type de cellule n'ait pas encore émergé pour le SNC des mammifères, un modèle évolutif récent (Arendt, 2008 Arendt et al., 2016) est utile pour l'examen des données que nous avons générées ici. Selon ce modèle, les caractéristiques spécifiques des types cellulaires homologues peuvent varier tant qu'elles restent définies par un appareil de régulation distinctif et partagé. Par exemple, les profils d'expression des gènes des cellules granulaires ou des astrocytes peuvent varier entre les espèces, ou même dans les cellules individuelles d'un type, sans perdre leur identité de type cellulaire. Cette définition peut tenir compte à la fois des changements fonctionnels des types cellulaires entre les espèces et de l'altération de l'expression des gènes au sein du type cellulaire en raison de mutations dans cis-les séquences régulatrices. Nos données documentent des différences importantes dans l'expression des gènes orthologues dans chaque type de cellule entre les cerveaux de rongeurs et humains. Des centaines de ces différences sont spécifiques au type cellulaire et, dans certains cas, ces gènes restent exprimés dans d'autres régions du cerveau. Nous pensons que ces données sont passionnantes et provocatrices. Ils démontrent que la biochimie affinée des types de cellules homologues du SNC humain et murin est susceptible de différer de manière significative, et ils soutiennent fortement que les différences dans les profils d'expression génique ne peuvent pas être utilisées comme critère de définition de l'identité du type cellulaire entre les espèces.

Les résultats présentés ici apportent trois informations supplémentaires sur l'évolution du cerveau des mammifères. Premièrement, bien qu'elles soient cohérentes avec les exemples publiés précédemment de cis-la divergence des séquences régulatrices en tant que mécanisme d'évolution (Maricic et al., 2013 Prud'homme et al., 2006 Weyer et Pääbo, 2016), l'absence de catégories GO hautement enrichies pour la plupart des événements spécifiques à la cellule que nous avons documentés suggère que les changements de séquences régulatrices sont les principaux moteurs de la variation phénotypique entre les types de cellules homologues dans le cerveau des mammifères. Ceci est cohérent avec le modèle évolutif présenté ci-dessus, car il permet une évolution substantielle des propriétés fonctionnelles de la cellule tout en maintenant le complexe régulateur central (CoRC) qui définit un type cellulaire donné (Arendt et al., 2016). Deuxièmement, les différences d'expression que nous avons documentées sont importantes, et nous avons limité notre analyse aux gènes orthologues de confiance élevée. Nos données complètent donc une étude précédente sur les cellules progénitrices qui ont signalé des changements substantiels dans l'expression de gènes humains dépourvus d'orthologues murins (Florio et al., 2015). Nous constatons également que les changements dans l'expression des gènes entre les espèces s'accompagnent de changements dans l'accessibilité de la chromatine du promoteur, et que les séquences d'ADN dans les régions régulatrices putatives autour des gènes enrichis en espèces sont moins conservées que pour les gènes inchangés. Alors que nos travaux sont cohérents avec des études antérieures montrant que l'évolution des promoteurs est plus lente que pour d'autres éléments régulateurs (Bae et al., 2015 De la Torre-Ubieta et al., 2018 Villar et al., 2015), nos résultats suggèrent que l'évolution du promoteur joue également un rôle important dans la régulation de l'expression génique spécifique au type cellulaire. Nous notons que dans les gènes exprimés par des cellules granulaires enrichies de souris, l'occurrence préférentielle de motifs GATA dans le corps du gène et l'expression spécifique à la souris du facteur de liaison GATA atypique Trps1 suggèrent également que l'expression différentielle des facteurs de transcription et les domaines régulateurs au sein des gènes peuvent contribuer à une transcription divergente entre les espèces. Pris ensemble, ces ensembles de données prédisent que les différences exprimées entre les types de cellules murines et humaines sont étendues, spécifiques au type cellulaire et phénotypiquement importantes.

Phénotypage moléculaire des types cellulaires du SNC humain

Les progrès récents des technologies de séquençage et d'analyse du génome humain ont conduit à une augmentation étonnante de notre connaissance des causes génétiques complexes des maladies psychiatriques et neurologiques humaines (Burguière et al., 2015 Hinz et Geschwind, 2017 Vorstman et al., 2017). Dans certains cas, la recréation des mutations causales dans le génome de la souris a abouti à des modèles expérimentaux suffisamment précis pour l'étude de la base moléculaire du trouble (Lombardi et al., 2015 Lyst et Bird, 2015 Orr, 2012), et ils ont a conduit à la découverte de caractéristiques inattendues de la maladie (Baker et al., 2013 Guy et al., 2007). Dans d'autres cas, les modèles animaux informatifs restent insaisissables (Lavin, 2013) et l'étude des mécanismes moléculaires de la maladie difficile (Biton et al., 2008 Medina et Avila, 2014). Nous présentons ici des données pour trois types de cellules cérébelleuses dans seize échantillons de cerveau humain. Tous les échantillons ont été prélevés sur des sujets non affectés ayant reçu un diagnostic neuropathologique de « cerveau adulte normal ». Les coefficients de corrélation entre les échantillons (r = 0,98 à 1,0) ont indiqué que les données sont extrêmement reproductibles et que l'impact de la PMD sur le profil d'expression des ARN nucléaires est mineur. Les premières indications selon lesquelles le sexe et l'âge ont un impact différent sur l'expression des gènes dans les types de cellules du SNC sont intéressantes, et elles suggèrent que le profilage nucléaire est suffisamment précis pour une étude détaillée des comportements humains sexuellement dimorphes et du vieillissement de circuits cérébraux spécifiques. Une possibilité intéressante, par exemple, est que l'analyse comparative des cerveaux humains puisse fournir un aperçu critique des impacts du vieillissement sur les types de cellules qui sont sélectivement vulnérables aux troubles humains d'apparition tardive.

L'une des découvertes les plus intrigantes que nous présentons est que les cellules granulaires cérébelleuses de trois échantillons de cerveau présentent une induction robuste d'un ensemble de 224 gènes contenant de nombreux gènes précoces immédiats, et cet ensemble est enrichi pour les catégories GO (pliage/repliage des protéines, apoptose, réponse transcriptionnelle au stress, réponse à des stimuli externes, activité ATPase, etc.) qui indiquent une réponse aiguë partagée à un stimulus physiologique inconnu ou un événement inattendu et robuste se produisant pendant le traitement de l'échantillon. Comme indiqué ci-dessus, aucune corrélation avec la PMD et aucune induction de marqueurs gliaux indiquant un accident vasculaire cérébral ou des lésions cérébrales n'est évidente dans nos données. Bien que les modifications de l'expression génique dépendantes de l'activité aient été largement caractérisées dans les cellules granulaires de souris en culture, la réponse identifiée dans ces trois échantillons humains se chevauche mais se distingue. Bien que nous ne souhaitions pas spéculer sur la cause de cette réponse, nos données démontrent que des études comparatives minutieuses d'ensembles de données spécifiques aux cellules à partir d'échantillons de contrôle sont une caractéristique importante de la conception expérimentale pour l'analyse comparative des événements moléculaires associés aux réponses à des événements génétiques ou environnementaux indésirables. .

Enfin, nos données fournissent des exemples supplémentaires de l'importance de la cartographie épigénétique dans des types cellulaires spécifiques en complément de l'analyse de l'expression génique. En particulier, l'utilisation de la cartographie ATAC-seq (Buenrostro et al., 2015 Chen et al., 2016) des domaines régulateurs putatifs pour des types de cellules spécifiques du SNC confirme que les gènes activement exprimés contiennent des domaines de chromatine accessibles. L'absence de ces domaines dans un gène qui n'est pas transcrit dans le type cellulaire homologue d'une autre espèce démontre que l'absence d'expression reflète des mécanismes complexes qui établissent un domaine réprimé de la chromatine à proximité du gène. Bien que nos données n'identifient pas les domaines de régulation spécifiques associés à ces changements d'expression, des précédents d'études sur l'évolution des amplificateurs (Villar et al., 2015) suggèrent qu'une enquête plus approfondie sur l'accessibilité différentielle dans ces gènes peut conduire à une compréhension mécanistique des espèces spécifiques. l'expression du gène.

Remarques finales

La force motrice pour le développement d'une méthode non génétique précise et efficace pour la caractérisation des propriétés moléculaires des types de cellules du SNC définis est de permettre une étude directe de la biologie humaine. Compte tenu de l'énorme explosion d'études identifiant les causes génétiques des maladies humaines et des démonstrations dans les modèles animaux et humains que celles-ci peuvent inclure des lésions qui impliquent de simples changements dans le dosage des gènes, l'exploration des détails des types de cellules dans les cerveaux normaux et affectés est impérative. Nous pensons que l'analyse comparative des données spécifiques au type de cellule humaine avec celles obtenues dans des systèmes expérimentaux est une approche importante pour faire progresser notre compréhension de la grande variété de troubles humains qui ont un impact sur les circuits du SNC.


Résultats

Zym est incapable de prendre en charge la coexistence de phase liquide ordonnée/liquide désordonné

Afin d'évaluer directement la capacité du Zym à induire la coexistence de domaines liquide/liquide, Erg ou Zym ont été incorporés dans des GUV contenant des rapports équimolaires du lipide saturé DPPC et du lipide insaturé DOPC, et leurs comportements ont été comparés à celui du DOPC /Mélange binaire DPPC. Le système DOPC/DPPC/Chol marqué avec le même analogue lipidique fluorescent, Rhod-DOPE, a déjà été étudié en détail (De Almeida et al., 2007). Il a été montré que cette sonde marque préférentiellement le liquide désordonné (je) phase versus gel (De Almeida et al., 2007), Chol-induit jeo (De Almeida et al., 2005) et induite par l'erg jeo (Bastos et al., 2012) domaines.

Pour le mélange équimolaire binaire de DPPC et DOPC, les images de microscopie confocale ont montré une distribution Rhod-DOPE avec des domaines brillants, insaturés enrichis en lipides et sombres, saturés en lipides (figure 1A). Dans ce mélange binaire les domaines observés correspondent au gel (foncé) et je coexistence de phases (brillantes), avec des aires relatives en accord avec le diagramme de phases de ce mélange (De Almeida et al., 2007). Les domaines sont de forme irrégulière, caractéristique de la coexistence gel/fluide, contrairement à je/jeo coexistence de phases qui conduit à des domaines de forme ronde (Dietrich et al., 2001). De plus, si du Chol est ajouté pour former un mélange ternaire 1:1:2 (rapport molaire), les vésicules sont complètement en jeo alors que pour la proportion équimolaire 1:1:1 il est bien connu que je/jeo une séparation de phases se produit (Figure supplémentaire S1A) (Veatch et Keller, 2003 De Almeida et al., 2007).

Figure 1. Zym ne favorise pas la formation de coexistant je/jeo phases liquides. Images de microscopie confocale des GUV de (UNE) DOPC/DPPC (rapport molaire 1:1), (B) DOPC/DPPC/Erg (rapport molaire 1:1:1), (C) DOPC/DPPC/Zym (rapport molaire 1:1:2) à 23ଌ, marqué avec Rhod-DOPE (0,2 mol%). Barre d'échelle = 5 μm.

Dans le cas de l'Erg, nos résultats indiquent également une nette je/jeo coexistence de phases pour la composition lipidique DOPC/DPPC/Erg (1:1:1, rapport molaire) (Figure 1B et Figure supplémentaire S1B), sous la forme d'un seul rond sombre jeo domaine est observé. En effet, les GUV avec des proportions similaires de DOPC/DPPC/Erg ont déjà été rapportés pour présenter un brillant je phase riche en lipide insaturé (DOPC), coexistant avec l'obscurité jeo domaines riches en lipides saturés (DPPC) et en Erg (Beattie et al., 2005).

Pour le DOPC/DPPC/Zym (1:1:2, rapport molaire) (figure 1C et figure supplémentaire S1D), des domaines de phase de gel non ronds, similaires à ceux trouvés dans les vésicules DOPC/DPPC (figure 1A), ont été clairement observés . Cela indique que le Zym, contrairement au Chol et à l'Erg, n'a pas la capacité de favoriser la formation de coexistants je/jeo phases d'un préexistant je/état du gel. Étant donné qu'une estimation de la fraction de surface de gel à partir d'une inspection visuelle de plusieurs GUV ne révèle aucune différence marquée sur la fraction de gel et je phases avec ou sans Zym, la répartition de ce stérol entre les deux phases semble être similaire. Des résultats analogues ont été obtenus pour des mélanges équimolaires (rapport molaire 1:1:1) de DOPC/DPPC/Zym (Figure supplémentaire S1C).

Zym est incapable d'affecter la perméabilité passive des bicouches lipidiques

Une différence majeure entre le gel et je phase avec une signification biologique directe et vitale est la perméabilité passive de la membrane, qui est connue pour être modulée par les stérols (Scheidt et al., 2013). Ainsi, la perméabilité passive à l'eau (Note complémentaire 1 et Figure complémentaire S2) et aux ions (Note complémentaire 2 et Figure complémentaire S3) a été étudiée dans des vésicules lipidiques formées par des mélanges binaires et ternaires contenant chacun des stérols métaboliquement apparentés (DPPC/stérol 2). :1 et rapport molaire DPPC/DOPC/stérol 1:1:1, respectivement).

Une perméabilité plus élevée à l'eau est exprimée par un taux plus élevé d'augmentation du volume liposomal (tableau 1). Le DPPC et le DPPC/DOPC (rapport molaire 1:1) présentent un comportement opposé : alors que le DPPC (phase gel) hautement organisé est assez imperméable à l'eau, la présence d'une phase fluide riche en DOPC et les défauts de tassement associés à l'interface entre les gel et je domaines (Clerc et Thompson, 1995) dans des mélanges DPPC/DOPC (rapport molaire 1:1) à température ambiante conduisent à la perméabilité la plus élevée de tous les MLV testés.

L'incorporation d'Erg ou de Chol a augmenté la perméabilité à l'eau de la bicouche DPPC (Figure supplémentaire S2A et Tableau 1). Erg a eu un effet plus fort que Chol sur la perméabilité des bicouches, tandis que Zym a eu un effet négligeable. Ce comportement typique de Chol et Erg est attribué à la formation du jeo phase qui, bien qu'ordonnée, a une fluidité plus élevée que la phase gel et une perméabilité passive plus élevée (Bittman et Blau, 1976).

Un effet inverse a été observé pour les mélanges DPPC/DOPC : l'incorporation d'une proportion équimolaire de stérol réduit la perméabilité à l'eau de la bicouche (Figure complémentaire S2B et Tableau 1). L'effet était plus élevé pour Erg et Chol par rapport à Zym. Bien que pour les mélanges binaires, la perméabilité intrinsèque intrinsèque de la phase riche en DPPC soit devenue plus élevée en présence de stérol, nous avons constaté que, dans l'ensemble, la perméabilité diminuait significativement pour les membranes DPPC/DOPC contenant Chol ou Erg. En fluidifiant les domaines de gel (Figure 1), l'interaction entre les lipides à l'interface du domaine est facilitée et le décalage entre les phases ordonnées et désordonnées est réduit, ce qui entraîne une diminution de la perméabilité de la bicouche lipidique par rapport au gel/je interfaces de domaine (Cordeiro, 2018 Kirsch et Bཬkmann, 2019). Plus précisément, une proportion équimolaire de Chol dans les bicouches DPPC/DOPC correspond à une je/jeo la coexistence des phases (De Almeida et al., 2007) et l'interface entre deux phases liquides est beaucoup moins sujette aux défauts de tassement que celle entre un gel et je phase, qui serait présente en l'absence de stérol. La même explication vaut pour l'observation d'un effet similaire sur la perméabilité lorsque l'Erg est présent dans les vésicules DPPC/DOPC et est cohérent avec le je/jeo coexistence de phases observée dans les GUV (Figure 1). Ainsi, la perméabilité des interfaces de domaine est un facteur crucial pour la perméabilité passive totale dans les mélanges ternaires. Le petit effet du Zym, car il est incapable de fluidifier la phase gel à travers jeo formation, prend en charge qu'il s'adapte bien entre les phospholipides étroitement emballés, très probablement en adoptant une structure très plane.

Des résultats comparables à ceux obtenus pour la perméabilité à l'eau ont été observés pour la perméabilité de la bicouche aux cations monovalents rapportés par la cinétique d'intensité de fluorescence de la sonde sensible au pH pyranine (tableau 1 et figure supplémentaire S3). In DPPC/DOPC mixtures, the incorporation of an equimolar proportion of sterol reduced the K + /H + exchange rate, but the effect of the jeo-promoting sterols, Chol and Erg, was much stronger when compared to Zym.

Overall, these results support that the formation of jeo domains promoted by Erg and Chol is directly related to the control of membrane passive permeability in highly heterogeneous membranes. Additionally, our experiments highlight that jeo domains, with properties halfway between je and gel, are important for reducing passive permeability at the interfaces between membrane domains.

Erg, Chol and Zym Distinctly Affect the Dielectric Properties of Phospholipid Bilayers

Sterols, in particular Chol, are known to increase the membrane dipole potential when mixed with phospholipids (Haldar et al., 2012). Hence we tested the effect of each sterol on the membrane dipole potential and its connection to jeo phase. Due to its complex photophysics, di-4-ANEPPS is responsive to changes in polarity or membrane potential and hydration (Loew et al., 1992 Loew, 1996 Amaro et al., 2017). The well-established excitation ratiometric method (Haldar et al., 2012) with this dye was thus used to assess the membrane dipole potential in binary systems (Figure 2A). Representative excitation and emission spectra of di-4-ANEPPS incorporated into the different systems under study are shown in Supplementary Figure S4.

Figure 2. The three sterols Erg, Chol, and Zym induce distinct biophysical changes in phospholipid bilayers. (UNE) Fluorescence excitation ratio, Rex, as a function of sterol mole fraction in POPC and DPPC MLVs. Rex is defined as the ratio of fluorescence emission intensity of di-4-ANEPPS arising from excitation at 420 nm divided by the one arising from excitation at 520 nm. (B) Influence of Erg and Zym on the polarity at the membrane/water interface expressed as the sterol induced shift of the wavelength of maximum emission intensity of di-4-ANEPPS as a function of sterol mole fraction in POPC/sterol and DPPC/sterol binary mixtures. The values are the mean ± S.D. d'au moins trois expériences indépendantes. Probe:lipid ratio 1:500.

When added to fluid POPC, neither Erg nor Zym had pronounced effects on the dipole potential, whereas Chol induced a modest but noticeable increase (Figure 2A). For Erg and Chol the results are in full agreement with a study performed using a similar probe, di-8-ANEPPS (Haldar et al., 2012). In the presence of a DPPC gel phase, Erg had the lowest effect on membrane dipole potential, whereas Chol affected it the most. Despite differing in the induced membrane potential, both Chol and Erg are consensual jeo-forming/“raft-promoting” sterols. Thus, a very high membrane dipole potential is a particular feature of Chol-enriched domains but cannot be directly related to the jeo phase forming ability of sterols.

Next, we analyzed the sterol-induced spectral shift of di-4-ANEPPS emission by Erg and Zym (Figure 2B), which relates to the hydration layer and the solvent relaxation in the vicinity of the lipid bilayer (Loew, 1996). For Chol, the spectral shifts obtained are much larger for saturated gel phase lipids, such as DPPC or sphingomyelin, than for unsaturated je phase lipids, such as POPC or DOPC (Bastos et al., 2012). When comparing Erg and Zym in POPC/sterol mixtures, blue-shifts of emission are large even for low Zym, whereas for Erg, the blue-shift is small when je phase still persists (Erg < 30 mol%), increasing more steeply when the system approaches the full jeo state. This possibly derives from Zym’s homogeneous distribution throughout the membrane, affecting membrane properties globally, whereas the effect of Erg on membrane hydration depends on its concentration and hence the proportion of je à jeo. Although the sterol-induced spectral shift follows the same trend in DPPC mixtures with Erg and Zym, the difference between the shifts in a gel versus an je PC bilayer is larger in the case of Erg. Moreover, the absolute magnitude of the emission blue-shift is generally larger for Chol- than for Erg-containing lipid bilayers (Bastos et al., 2012).

Zym Is Unable to Discriminate Gel and lré Phases

In a previous study (Bastos et al., 2012) we have shown that di-4-ANEPPS fluorescence properties respond specifically to sterol type and levels, as well as to sterol-phospholipid interactions. Similarly, the fluorescence lifetime of di-4-ANEPPDHQ, a probe of the same family, is considerably higher in lipid vesicles containing Chol (Amaro et al., 2017) and, in addition, the removal of Chol from the plasma membrane of mammalian cells with M𻋍 leads to the decrease of the lifetime of this probe (Owen et al., 2006). Moreover, these fluorescent probes can be very efficiently excited with visible light with absorption maximum close to the wavelength of common pulsed excitation lasers used in time-resolved fluorescence microscopy, in opposition to other polarity and sterol sensitive dyes e.g., of the family of Laurdan (Golfetto et al., 2013 Mazeres et al., 2017).

To ensure that di-4-ANEPPS mainly reports on sterol dependent properties, we analyzed its fluorescence intensity decays in LUVs made of binary mixtures comprising a PC, either the fully saturated 16:0 DPPC (gel phase forming) or the mono-unsaturated 16:0,18:1Δ 9 c POPC (je phase forming), and each sterol. The parameters obtained from the analysis of such decays are shown in Table 2. Notably, intensity-weighted mean fluorescence lifetime <τ> of di-4-ANEPPS in saturated lipid (DPPC) or unsaturated lipid (POPC) bilayers devoid of any sterol was similar (≈ 1.8 ns and 1.9 ns, respectively) [Figure 3 and Bastos et al. (2012)]. The results in Figure 3 show that all three sterols increase <τ> of di-4-ANEPPS. This indicates a higher quantum yield of the probe in sterol-enriched phases. Moreover, the membrane/water partition coefficient of di-4-ANEPPS previously determined for the POPC/Erg binary system was higher (∼ 2.1×) for an jeo membrane than for an je membrane (Bastos et al., 2012) and its quantum yield was found to be larger when incorporated in the jeo phase (Khmelinskaia et al., 2014).

Tableau 2. The molecular environment reported by di-4-ANEPPS is comparable in living cell membranes and model systems containing the same major sterol in a similar fraction.

Figure 3. Les jeo-promoting sterols Erg and Chol induce clearly distinct changes in lipid properties in saturated (DPPC) versus unsaturated (POPC) phospholipids. Mean fluorescence lifetime <τ> of di-4-ANEPPS in binary mixtures of MLVs with Erg (UNE), Zym (B) or Chol (C) and DPPC (open symbols) or POPC (solid symbols), as a function of sterol mole fraction, at 24ଌ. The values are the mean ± S.D. d'au moins trois expériences indépendantes. Probe:lipid ratio 1:500.

In the presence of Chol and Zym, <τ> was longer than for the same Erg mole fractions, in agreement with the spectral emission blue-shifts previously discussed (Figure 2B). However, when comparing the results obtained for DPPC and POPC, it is obvious that Chol and Erg have a much stronger effect in the gel phase lipid, since <τ> of di-4-ANEPPS had a higher increase in vesicles with DPPC than with POPC. On the other hand, Zym showed a unique behavior since <τ> obtained in DPPC or POPC vesicles containing this sterol largely overlapped. This observation, in good agreement with the approximately equal surface area of each phase in DOPC:DPPC:Zym and DOPC/DPPC GUVs (Figure 1 and Supplementary Figure S1), suggests that Zym is not able to discriminate gel and je phase phospholipids and seems to be equally well accommodated in both phases. The behavior of di-4-ANEPPS <τ> (Figure 3), regardless of the maximum value reached in each particular case, is similar for the Chol and Erg mixtures with DPPC, reaching a plateau slightly before the system is completely in jeo phase (≈ 30 mol% sterol) (Sankaram and Thompson, 1991 Hsueh et al., 2005 Silva et al., 2006), which is consistent with a preference of the probe for the sterol-enriched jeo phase. In contrast, the trend of di-4-ANEPPS <τ> is approximately linear in the case of Zym, without reaching a clear plateau, indicating the absence of a phase separation and of jeo phase formation. The linear trend up to 40/50 mol% Zym is indicative of the efficient incorporation of this sterol into the membrane, despite the lack of marked changes in domain organization and membrane permeability shown above. It should be noted that, in the case of Erg, the sterol solubility limit might have been transposed, particularly when mixed with POPC. Nonetheless, both DPH (1,6-diphenylhexatriene) fluorescence anisotropy in POPC/Erg liposomes (Silva et al., 2006) and the mean temperature of one broad endotherm component of DPPC/Erg mixtures (Mannock et al., 2010) increase up to 40 mol% of the sterol. Moreover, no Erg crystallites were detected at molar proportions as high as 50 mol% in the same DPPC/Erg mixtures (Mannock et al., 2010). The solubility of Chol in both saturated and monounsaturated phosphocholine bilayers, on the other hand, is unarguably higher than 50 mol% (Huang et al., 1999).

Sterol Type and Fraction Dictate the Molecular Environment Reported by di-4-ANEPPS in Living Cell Membranes

Finally, we analyzed living systems naturally containing different sterols in their plasma membrane: mammalian CHO-K1 cells (Chol-containing), poids (Erg-containing) and erg6Δ (Zym-enriched in comparison to poids no Erg) S. cerevisiae cellules. The single mutant erg6Δ was used instead of the double mutant erg6Δerg2Δ, with higher levels of Zym, since double mutants in the Erg biosynthetic pathway have a slower growth rate and exhibit a lower total sterol content than their progenitors (Barton et al., 1975). Cells were labeled with di-4-ANEPPS and FLIM experiments were conducted (Figure 4) to analyze both the plasma membrane and the intracellular membranes of individual cells (Supplementary Note 3, Supplementary Figures S5, S6 and Supplementary Table S1). Importantly, since Erg seems to preferentially localize in the inner leaflet (Solanko et al., 2018), di-4-ANNEPS is suitable to probe these Erg-enriched regions not only because, as di-4-ANEPPDHQ, its fluorescence properties are sensitive to medium polarity, membrane potential and hydration, but also because of its ability to flip flop and distribute across both membrane leaflets as a non-charged and short-chained probe, in comparison with the double positively charged di-4-ANEPPDHQ. As the cellular environment is highly complex, to better understand how sterol structure defines biophysical properties of the plasma membrane in eukaryotes, and what simple lipid mixtures may reflect sterol-dependent properties as reported by di-4-ANEPPS fluorescence intensity decay parameters, we compared the cellular results with those in model membranes.

Figure 4. Mean fluorescence lifetime <τ> of di-4-ANEPPS unravels significant differences in lipid membrane organization between mammalian and yeast cells. FLIM images of mammalian (CHO-K1, UNE), poids (B) et erg6Δ (C) S. cerevisiae cellules. The inset color bars give the <τ> range in ns used in the respective image. Scale bar corresponds to 10 μm for (UN B), 5 μm for (C). Frequency histograms of <τ> (D𠄿) corresponding to the plasma membrane, PM (solid lines), or intracellular membrane, IM (dashed lines), for each cell type are shown. The corresponding regions of interest can be found in Supplementary Figure S5.

In CHO-K1 cells, a significant difference between the average fluorescence lifetime <τ> of di-4-ANEPPS in the plasma membrane (4.27 ± 0.09 ns) and intracellular membranes (3.72 ± 0.20 ns) was observed (Figures 4A,D and Supplementary Figures S5, S6A, S7D). As <τ> of di-4-ANEPPS is sensitive to sterol levels (see Supplementary Notes 4, 5), this difference of <τ> is most probably due to the lower content of Chol in intracellular membranes than in the plasma membrane, a general feature of mammalian cells (Simons and Vaz, 2004 Owen et al., 2006). These results are in perfect concordance with previous observations for di-4-ANEPPDHQ in HEK293 cells, where longer lifetimes were obtained in the plasma membrane in opposition to intracellular membranes (Owen et al., 2006). Similarly, the labeling of mammalian, Drosophile Kc and Dictyostelium AX2 cells with Laurdan probes also revealed a lower polarity of the plasma membrane lipid environment in contrast to intracellular membranes (Mazeres et al., 2017).

Interestingly, in CHO-K1 cells <τ> of di-4-ANEPPS was much longer (about 63%) than in wt S. cerevisiae plasma membrane (2.58 ± 0.07 ns), which is in very good agreement with the previously measured value in living poids yeast cells in mid-exponential phase in suspension (2.55 ± 0.06 ns) (Santos et al., 2017 Figures 4B,E). This may be compared with our observations in model membranes, where it was shown that Erg had a smaller ability to increase di-4-ANEPPS <τ> than Chol (Table 2). Interestingly, membrane organization as judged from <τ> of di-4-ANEPPS in vesicles containing either saturated PC or palmitoylsphingomyelin (PSM)/Chol lipids resembled most that of CHO-K1 cells, while membrane organization in POPC/Erg vesicles resembled that of S. cerevisiae cellules. These results point to a fundamental difference in how to model sterol-enriched regions of mammalian and yeast cell membranes.

To study the influence of sterol profile on membrane properties reported by di-4-ANEPPS <τ>, S. cerevisiae erg6Δ cells were also analyzed, in which Erg is absent and the level of Zym is about four to seven-fold higher than in the poids strain (Zinser et al., 1993 Pedroso et al., 2009 Dupont et al., 2011). Despite the fact that Erg is no longer present, and Zym becomes one of the major cellular sterols (Heese-Peck et al., 2002 Guan et al., 2009 Dupont et al., 2011), no significant differences have been found in the levels of other major membrane lipids (Guan et al., 2009). At a first glance, FLIM images (Figures 4B,C) suggest a similar di-4-ANEPPS fluorescence lifetime in both poids et erg6Δ yeast strains. However, the frequency histograms (Figures 4E,F) point to a slightly longer <τ> of di-4-ANEPPS in erg6Δ cells (Supplementary Figure S4E see also Supplementary Figure S7). This slight increase may be related to the higher Zym content of the mutant cells’ plasma membrane, as mentioned above. This would mean that in the presence of the main sterol of the plasma membrane in this strain, the probe would present a <τ> value similar to the one in the presence of Erg. In fact, that sterol is cholesta-5,7,24-trienol, which was found to accumulate in membrane regions resistant to detergent extraction in Erg6p defective mutants, at levels identical to those of Erg in poids cells (Eisenkolb et al., 2002).

The fluorescence intensity decays of di-4-ANEPPS contain more information than the average fluorescence lifetime <τ>, namely the pre-exponentials and the fluorescence lifetimes of the two exponential components that describe each fluorescence intensity decay. These parameters were collected from all analyzed cells and the average values are given in Table 2. A noticeable difference is found in the value of τ2 entre poids et erg6Δ, despite the small difference between <τ> of the probe in those yeast strains – τ2poids = 2.95 ns and τ2erg6Δ = 3.60 ns (Figure 5). The mutant strain value is more similar to the one obtained in model membranes containing Zym than Erg (Table 2). Comparing the lifetimes measured in yeast to those measured in CHO cells, both τ2 and <τ> were clearly longer in the mammalian cells, as in the model systems containing Chol compared to Erg and Zym.

Figure 5. Long lifetime component τ2 of the fluorescence decay of di-4-ANEPPS is highly sensitive to changes in sterol-dependent properties of membranes. FLIM images of ROIs of the plasma membrane (PM) of CHO-K1 cells (UNE), poids (B), et erg6Δ S. cerevisiae cellules (C). The inset color bars give the long lifetime component τ2 range in ns used in the respective image. Scale bar = 10 μm. (RÉ) Frequency histograms of τ2 corresponding to the FLIM images shown.

Cell membranes are highly complex and dynamic, and their large number of components could conceivably influence di-4-ANEPPS measurements. Nevertheless, a good parallel could be drawn between the measured fluorescence lifetime components and amplitudes in mammalian and yeast cells of varied sterol profile and the model systems of closer sterol composition.


Observing diffusion

Apparatus

  • 1 x ( ext<500>) ( ext) beaker
  • large funnel
  • plastic straw
  • potassium permanganate crystals

Méthode

  1. Fill a beaker with water and allow it to stand for a few minutes so that water movement stops.
  2. Place a large funnel into the water so that it touches the bottom of the beaker. Drop a few small potassium permanganate crystals through the straw. Remove the funnel carefully and slowly.
  3. Observe the size of the area that is coloured by the potassium permanganate at the beginning of the experiment, after 5 minutes and then after 20 minutes.

Des questions

  1. What do you observe happening in the beaker?
  2. What can you conclude based on your observations?
  3. Explain how using hot water would affect the results of this experiment (remember that when you explain you need to give a reason for your answer).

Observing Diffusion

  1. What do you observe happening in the beaker?
  2. What can you conclude based on your observations?
  3. Explain how using hot water would affect the results of this experiment (remember that when you explain you need to give a reason for your answer).
  1. The purple colour slowly spreads (diffuses) throughout the entire beaker of water, until the colour is evenly spread out.
  2. The molecules of water and potassium permanganate must be constantly moving in order for the purple colour to diffuse throughout the water and spread out evenly.
  3. Using hot water would speed up the spreading process/ diffusion. The additional heat from the water gives the particles kinetic energy which enables them to move more quickly. The faster the particles move, the faster the colour spreads/ diffuses throughout the beaker.

When the concentration of solutes in solution is low, the water concentration is high, and we say there is a high water potential. Osmosis is the movement of water from a region of higher water potential to a region of lower water potential across a semi-permeable membrane that separates the two regions. Movement of water always occurs down a concentration gradient, i.e from higher water potential (dilute solution) to lower potential (concentrated solution). Osmosis is a passive process and does not require any input of energy. Cell membranes allow molecules of water to pass through, but they do not allow molecules of most dissolved substances, e.g. salt and sugar, to pass through. As water enters the cell via osmosis, it creates a pressure known as osmotic pressure.

Figure 2.14: Osmosis is the movement of water from an area of high water potential to an area of low water potential across a semi-permeable membrane.

Watch osmosis taking place by clicking on the following link.

In biological systems, osmosis is vital to plant and animal cell survival. Figure 2.15 demonstrates how osmosis affects red blood cells when they are placed in three different solutions with different concentrations.

Figure 2.15: The effect of hypertonic, isotonic and hypotonic solutions on red blood cells.

Hypertonic (concentrated)IsotonicHypotonic (dilute)
The medium is concentrated with a lower water potential than inside the cell, therefore the cell will lose water by osmosis.The water concentration inside and outside the cell is equal and there will be no nett water movement across the cell membrane. (Water will continue to move across the membrane, but water will enter and leave the cell at the same rate.)The medium has a higher water potential (more dilute) than the cell and water will move into the cell via osmosis, and could eventuality cause the cell to burst.

Plant cells use osmosis to absorb water from the soil and transport it to the leaves. Osmosis in the kidneys keeps the water and salt levels in the body and blood at the correct levels.


Cells as Building Blocks

A cell is the smallest unit of a living thing. A living thing, whether made of one cell (like bacteria) or many cells (like a human), is called an organism. Thus, cells are the basic building blocks of all organisms. Several cells of one kind that interconnect with each other and perform a shared function form tissues several tissues combine to form an organ (your stomach, heart, or brain) and several organs make up an organ system (such as the digestive system, circulatory system, or nervous system). Several systems that function together form an organism (like a human being). There are many types of cells all grouped into one of two broad categories: prokaryotic and eukaryotic. For example, both animal and plant cells are classified as eukaryotic cells, whereas bacterial cells are classified as prokaryotic.


How to Choose a Cell Health Assay

Choosing a cell health assay can be a challenging task. Here we provide a series of factors to consider when choosing cell-based assays for manual or automated systems.

What do you want to measure?

Which cells, viable or dead, do you want to detect at the end of an experiment? There are cell health assays available that specifically detect the number of living cells (viability assays), the number of dead cells (cytotoxicity assays) and for assessing the mechanism of cell death (apoptosis assays). If the information sought is simply to confirm whether there is a difference between “no treatment” negative controls and “toxin treatment” of experimental wells, the choice between measuring the number of viable cells or the number of dead cells may be irrelevant. However, if more detailed information on the mechanism of cell death is being sought, the duration of exposure to toxin, the concentration of the test compound, and the choice of the assay endpoint become critical (1). Explore the following considerations to help you determine what you want to measure and which assays can help you.

What is your model system?

The species of origin and cell types used in cell health studies are often dictated by specific project goals or the drug target that is being investigated. Regardless of the model system chosen, establishing a consistent and reproducible procedure for culturing cells and setting up assay plates is important. Variation in the number of cells per well or equilibration period prior to performing the assay may affect cellular physiology. Maintenance and handling of stock cell cultures at each step of the process should be standardized and validated for consistency. In addition, be sure to use known positive and negative controls throughout the course of the experiment to establish a general understanding of the physiological condition of the cells. Because the nature of the sample can vary depending on cell type and whether it is a 2D or 3D culture model, the assay procedure should be validated for each culture model system. A model system that requires use of smaller cell numbers, such as with primary cells or other limited cell types, will require an assay with increased sensitivity.

Are you using 2D or 3D cell cultures?

Cells in culture are only a model system and are different than cells in their normal in vivo environment. Many researchers are now using 3D cell cultures to more closely mimic in vivo conditions. Instead of growing in a monolayer on a plate surface, cells in 3D culture grow within a conformation that allows them to interact with each other, forming cell:cell connections. This added complexity can present challenges for experimental design when performing cell based assays because assay reagents may have difficulty reaching the center of large microtissues, and lytic assays may not be able to disrupt all cells within the 3D system. Assays may need to be optimized for 3D systems, by reformulating reagents with stronger detergents and incorporating mechanical disruption and longer incubation times. Colorimetric assays, such as MTT, are not optimal for use with 3D cell cultures because they have limited ability to penetrate multiple layers of cells.

The CellTiter-Glo ® 3D Cell Viability Assay (Cat.# G9681) is specifically designed for determining cell viability in 3D culture models. The assay reagent has increased lytic capacity—allowing better penetration of large spheroid samples resulting in more accurate determination of viability compared to other assay methods. The CellTiter-Glo ® 3D Assay Reagent measures ATP as an indicator of viability and generates a luminescent readout that is much more sensitive than colorimetric or fluorescence-based methods.

To measure cytotoxicity of a compound, the LDH-Glo™ Cytotoxicity Assay (Cat.# J2380) is ideal for use with 3D culture models. Instead of relying on penetration of the cell membrane, the assay measures LDH release from dead cells into the medium. The assay requires only small volumes of medium (2–5µl) to be removed, allowing for repeated sampling over time. This conserves microtissues and maintains remaining viable cells, allowing you to use samples for additional downstream applications, with other assays, or for nucleic acid analysis to acquire more data using the same samples.

When is the right time to perform a cell health assay?

Matching the detected assay marker to the information you need is vital to choosing the appropriate cell health assay. A basic understanding of the changes that occur during different mechanisms of cell death will help you decide which assay to choose. Figure 9 shows a simplified example illustrating chronological changes occurring during apoptosis and necrosis and the results that would be expected using assays that measure different markers.

Figure 9. Mechanisms of cell death can be determined by measuring different markers of cell viability, cytotoxicity and apoptosis in vitro.

Cells undergoing necrosis typically undergo rapid swelling, lose membrane integrity, shut down metabolism and release their cytoplasmic contents into the surrounding culture medium. Cells undergoing rapid necrosis in vitro do not have sufficient time or energy to activate apoptotic machinery and will not express apoptotic markers.

Measuring Apoptosis and Necrosis

Cultured cells that are undergoing apoptosis in vitro eventually undergo secondary necrosis. After extended incubation, apoptotic cells ultimately shut down metabolism, activate caspases, flip phosphatidylserine (PS) to the outer membrane, lose membrane integrity and release their cytoplasmic contents into the culture medium. Markers of apoptosis such as caspase activity or PS exposure on the cell surface may be present only transiently. Therefore, to determine the primary mechanism of cell death, understanding the kinetics of the cell death process in your model system is critical. To avoid missing a critical time point, you may want to choose a nonlytic real-time assay, such as the RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay (Cat.#JA1011), that allows repeated readings from a single assay well over time.

Do you need to collect data from multiple time points?

Live-cell kinetic assays are detection reagents that allow the same sample well to be repeatedly measured over multiple time points. This saves you time and effort, enabling you to collect more informative data in real time. If you need to perform time and dose response experiments to determine the onset or mechanism of toxicity of a drug, you’ll likely benefit from a real-time assay. Especially if you are using limited or precious cell samples, it is critical to get as much data as possible out of your sample. Promega provides a portfolio of assays capable of live-cell kinetic cell health determination.

The RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay (Cat.# G9711) allows you to monitor cell viability continually in the same sample well out to 72 hours depending on cell number. The assay measures the reducing potential of viable cells and is ATP-independent, providing an orthogonal method for viability determination. The RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay (Cat.# JA1011) is a plate reader-based method that measures the real-time exposure of phosphatidylserine (PS) on the outer leaflet of cell membranes during the apoptotic process. The combination and timing of luminescent (apoptotic) and fluorescent (necrotic) signals is used to differentiate secondary necrosis from necrosis caused by other cytotoxic events. The CellTox™ Green Cytotoxicity Assay (Cat.# G8741) uses a dye that produces a fluorescent signal when bound to DNA in membrane-compromised cells. This assay can be applied directly to cells at seeding or when treating with a test compound at any incubation time point, allowing real-time kinetic measurement of the onset of cytotoxicity.

Because these assays are non-toxic and non-lytic, the remaining viable cells remain intact for additional downstream applications resulting in more data per sample.

Learn more about our portfolio of Live-Cell Kinetic Assays!

How many samples do you need to test?

If only one or a few samples need to be measured, manual counting of live or dead cells using a hemacytometer may be adequate. Imaging or flow cytometry methods are also useful for low sample numbers, but are less amenable to high-throughput applications. If large numbers of samples will be measured, homogeneous assays that do not require cell washes or centrifugation steps are the most efficient. In addition, time required for reagent preparation and incubation should be minimal. The stability of the absorbance, fluorescence or luminescence signal is another important factor that provides convenience and flexibility in recording data and minimizes variability when processing large batches of plates. For screening thousands of samples, it is beneficial to choose assays that are sensitive enough to allow miniaturization into high-density plate formats (384- or 1536-well plates).

Promega produces a broad portfolio of plate reader-based cell health assays that are fast, highly sensitive, simple and compatible with high-throughput measurement (2). While the general protocol for the majority of these "homogeneous" assays is add-mix-measure, some protocols may require transfer, incubation or agitation steps. We recommend fully reviewing the assay protocols to determine if the workflow meets your needs.

Find the Right Assay for Your Needs

Click below to compare the variety of Promega plate-based assays designed to measure cell viability, cytotoxicity and apoptosis.

What kind of sensitivity is required?

Another factor to consider when selecting an assay is sensitivity of detection. The sensitivity required is closely linked to the number of cells used per sample. In general, the luminescent assays are more sensitive than assays based on detecting fluorescence or absorbance because minimal background luminescence results in high signal-to-noise ratios. With fluorescence detection, inherent fluorescence from cells, compound fluorescence and spectral overlap between the excitation and emission wavelengths can result in reduced signal-to-noise ratios.

Detection sensitivity will vary with cell type if you choose to measure a metabolic marker, such as ATP level or MTS tetrazolium reduction. The signal-to-background ratios of some assays may be improved by increasing incubation time. The sensitivity of the detection reagent depends upon both parameters of the model system, such as the plate format and number of cells per well in addition to the parameter being evaluated, such as a decrease in cell viability. Assays that are designed to detect a change in viability in a population of 10,000 cells may not require the most sensitive assay technology. For example, a tetrazolium assay such as the CellTiter 96 ® Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Cat.# G4000) should easily detect the difference between 10,000 and 8,000 viable cells. On the other hand, assay model systems that use low cell numbers in a high-density multiwell plate format may require maximum sensitivity of detection, such as that achieved with the CellTiter-Glo ® Luminescent Cell Viability Assay (Cat.# G7570) that can easily detect fewer than 100 cells.

How stable are the reagents?

For researchers using automated high-throughput screening platforms, the reagent stability and compatibility with robotic components is often a concern. The assay reagents must be stable at ambient temperature for an adequate period of time to complete dispensing into multiple plates. In addition, the signal generated by the assay should be stable for extended periods of time to allow flexibility for recording data either consecutively or in batch mode processing. The CellTiter-Glo® 2.0 Cell Viability Assay is formulated to allow storage at ambient temperature for multiple days, and generates a stable luminescent signal with a half-life that enables batch processing.

What instruments will you need?

In some cases the choice of assay may be dictated by the availability of instrumentation to detect absorbance, fluorescence or luminescence. Our portfolio of assays contains an optional detection format for each of the three major classes of cell health assays (viability, cytotoxicity or apoptosis). In addition, results from some assays such as the CellTiter-Glo ® Luminescent Cell Viability Assay (Cat.# G7570) can be recorded with more than one type of instrument (luminometer or CCD camera).

Discover the Instrument That Is Right For You

GloMax® Microplate Reader Instruments are easy-to-use, modular detection systems that offer greater flexibility when designing your plate-based assay experiments. These instruments work seamlessly with Promega assays by having preloaded protocols for easy and fast detection.

Which plates are appropriate to use?

When using our plate-based assays, choosing the right type of plate is dependent on your research needs. If microscopic observation of cells is desired, opaque clear-bottom plates are required.

In general, opaque black plates are used for reduced background for fluorescent assays, and opaque white plates are used for optimum light output for luminescent assays. However, the signal strength from most luminescent assays is adequate such that black plates can be used. Using black plates for luminescent assays provides the most flexibility for multiplexing fluorescent and luminescent assays from the same sample. Clear plates are acceptable for use with colorimetric assays, but should not be used with fluorescent or luminescent assays. Choosing the right instrument and plates can help you reduce crosstalk and other issues that might confound your data.

Do you want to perform more than one assay with your sample (multiplex)?

Multiplexing more than one assay is a versatile approach that can provide more information from a single sample. For example, you can simultaneously measure cell stress response pathway events and the mechanism of cell death in the same sample well, or measure cell viability with reporter response to normalize results to the number of live cells. Multiplexing requires compatibility of the assay chemistries being used and the ability to distinguish separate signals using different detection wavelengths or detecting different modalities such as fluorescence and luminescence. For compatible assay chemistries, multiplexing can be accomplished simultaneously in the same sample well. For some assay combinations, measurements must be done in a sequential manner. Still other multiplexing options can be enabled by separating a portion of the sample into a different container to overcome assay chemistry incompatibility, instrument requirements or plate format (e.g., clear vs. opaque plastic). For instance, the LDH-Glo&trade Cytotoxicity Assay (Cat.# J2380) offers the opportunity to gather multiple data points by removing small aliquots of culture supernatant to a white opaque assay plate, thus leaving the original assay plate containing cells available for other assays such as reporter gene analysis, image analysis, nucleic acid analysis, etc.

Multiplexing assays in the sample well eliminates the need for multiple parallel samples for different assays and can save you time, effort and cost as well as provide a statistical advantage compared to using parallel samples. Several of our homogeneous cytotoxicity, apoptosis and viability assays can be multiplexed without transferring media, allowing researchers to assay multiple parameters in the same sample well.

Example multiplexing protocols:

Is the assay reproducible?

Reproducibility of data is an important consideration when choosing a commercial assay. However, for most cell-based assays, the variation among replicate samples is more likely to be caused by the cells rather than the assay chemistry. Variations during plating of cells can be magnified by using cell lines that tend to form clumps rather than a suspension of individual cells. Extended incubation periods and edge effects in plates may also lead to decreased reproducibility among replicates and less desirable Z&rsquo-factor values (2). When choosing an assay, understanding the causes of variability in results is key.

What is the cost?

Usually there is a trade-off between the cost of the reagent and the quality of the assay or the convenience it provides to the user. Less costly reagents often have more complex procedures, limited sensitivity, or cause toxicity to cells in culture due to longer incubations and take longer to perform. Despite those general disadvantages, there may be many applications where less costly assays are suitable however, care should be taken to avoid reagents that are cytotoxic as they can affect the assay results or limit the ability to multiplex with other assays.

Commercially available quality-controlled reagents and assay kits are generally more expensive but often save time and cost in the long run by avoiding repeated experiments or nonreplicable results. For example, even though the reagent cost of an ATP cell viability assay may be higher than other assays, the speed (time savings), sensitivity (cell sample savings) and accuracy (confidence in data) may outweigh the initial cost. Assays with good detection sensitivity that are easier to scale down to 384- or 1536-well formats may result in savings of cell culture reagents and enable testing of very small quantities of expensive or rare test compounds and sample types, especially primary cells. Assays capable of real-time measurement can also reduce costs and save time by eliminating the need to replicate plates for time-course experiments.


DATA AVAILABILITY

All reported datasets used in this paper are publicly available with the associated accession numbers provided below. Tabula Muris mouse cell atlas scRNA-Seq data (Figure 2) was obtained from GSE109774 mouse bone marrow scRNA-Seq from GSE70245 and GSE77849 myocardial infarction and sham surgery mouse scRNA-Seq deposited to GSE136088 human Acute Myeloid Leukemia (AML) datasets from the 10x Genomics website (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets/1.1.0/aml027_pre_transplant, https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets/1.1.0/aml027_post_transplant) AML scRNA-Seq time-course from GSE116481 human bulk AML RNA-Seq data (GSE49642, GSE52656, GSE62190, GSE67040) and control cord-blood samples (GSE48846) Human HEK293T scRNA-Seq from the 10X Genomics website (http://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets/2.1.0/hgmm_12k) bulk RNA-Seq from T-cells and B-cells (GSE51984) single-cell RNA-Seq from human peripheral blood mononuclear cells from the 10x Genomics website (https://support.10xgenomics.com/single-cell-vdj/datasets). cellHarmony and AltAnalyze are open-source and provided in Github according to the Apache License 2.0.


Voir la vidéo: Gauchers, droitiers: existe-t-il de réelles différences? 2 - RTL - RTL (Décembre 2021).