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Serait-il possible de créer un gel, contenant des virus, qui pourrait altérer le génome humain lorsqu'il est frotté ?


Je me demandais s'il était possible de concevoir un virus, que lorsqu'il entre en contact avec les follicules pileux humains, il pourrait altérer la couleur naturelle des cheveux de quelqu'un. Cheveux naturellement bleus n'importe qui ?

Sans aucun doute, il y a beaucoup de problèmes, mais j'espérais qu'ils pourraient être identifiés et potentiellement résolus.


Catastrophe des armes biogénétiques : virus propagé par la CIA avec un nano-UAV comme œil de cyber-libellule

De la pandémie à une catastrophe mondiale de la Chine à l'Iran en passant par l'Italie pour un bilan dramatique de plus de 4 000 morts, 5 fois les 813 du SRAS en 2003. En attendant, la suspicion qui s'est propagée par la CIA avec un Cyber ​​Insecte ou autre type de nano-drone, comme le prétendent des sources de renseignement.

Bien que le CoronaVirus n'apparaisse absolument mortel que pour les personnes âgées ou celles dont le système immunitaire est affaibli, sa propagation augmente de façon exponentielle en raison de la facilité de contagion entre les êtres humains (salive, haleine, mains) et de sa résistance de durée indéfinie sur les surfaces et les objets. Il est vrai qu'avec un jet d'éthanol ou un autre désinfectant domestique le virus peut être tué mais ce qui est inquiétant c'est son retour facile.

En effet, il a pu tuer à la fois le médecin héros chinois, Li Wenliang, l'ophtalmologiste qui avait le premier sonné l'alarme en Chine en décembre dernier (c'est la raison du numéro de code Covid-19), mais aussi le directeur de l'hôpital de Wuhan. , Li Zhiming.

Le premier n'avait que 33 ans, le second 51, tous deux visiblement très exposés à cette violente maladie respiratoire mais tous deux étaient également équipés de tous les outils médicaux nécessaires disponibles jusqu'à présent pour la combattre. Environ un millier de médecins sont infectés en Chine et parmi eux, il y a déjà 6 décès confirmant qu'un contact prolongé avec des personnes infectées peut être fatal même pour des individus ayant de bons anticorps, des protections adéquates et des traitements efficaces.

Dr Liu Zhiming, directeur de l'hôpital de Wuhan, décédé ces derniers jours

Tout cela met en évidence la puissance du virus qui, malgré un taux de mortalité désormais autour de 2% et donc inférieur aux syndromes des voies respiratoires SRAS (7%), a une rapidité contagieuse dans certaines zones tragiquement élevées et, surtout, imparables. Il s'agit d'une souche virale de la grande famille des CoronaVirus : celle du simple 'rhume', le trouble des voies respiratoires supérieures comprenant rhume, toux, maldigola, qui peut cependant dégénérer en pneumonie si grave qu'elle paralyse les poumons bloquant ainsi l'oxygénation du sang.

Le Comité international de taxonomie des virus (ICTV) l'a déjà rebaptisé Severe Acute Respiratory Syndrome CoronaVirus 2 (SARS-CoV-2) compte tenu de sa dangerosité déjà attestée dans un article détaillé publié par certains scientifiques chinois dans le numéro de février de “Science China Sciences de la vie » qui met en évidence des anomalies biochimiques de nature à amener le Parti communiste chinois à le considérer sans l'ombre d'un doute comme une arme biologique.

Selon d'autres experts américains, il s'agit d'un instrument de guerre qui est devenu incontrôlable à Wuhan, des analystes secondaires et indépendants chinois ont été construits et diffusés par un ennemi de Pékin. Parmi les principaux suspects figurent les États-Unis qui, partout dans le monde, notamment dans les pays frontaliers de la Russie, de la Chine et du Moyen-Orient, disposent d'au moins 25 laboratoires pour la production d'armes biogénétiques, c'est-à-dire calibrée sur le génome de certains groupes ethniques. Et certains 007 confirment qu'il s'agit d'une épidémie généralisée avec les nano-drones …

En plus d'avoir commencé des études sur la manipulation génétique d'insectes tels que des véhicules viraux comme outils de défense ou d'attaque (officiellement contre les ravageurs en agriculture), les États-Unis ont déjà créé DragonflEye, la cyber-libellule guidée par la lumière pour les vols de reconnaissance, la pollinisation ciblée et livraison de “payload”. Nous verrons plus loin en détail les laboratoires partenaires du Pentagone qui ont développé le projet, initié par la CIA en 1970 avec le premier Insecthoper.

Il s'agissait du premier prototype de “nano-drone” qui a également évolué aujourd'hui dans le Black Hornet 3, l'hélicoptère UAV de 10 cm déjà utilisé par l'armée américaine et d'autres pays de l'OTAN, dont le kit peut tenir dans un sac à dos militaire. Ou un touriste visitant un pays étranger…

CHINE ET IRAN : PLUS DE MORTS DANS LES PAYS ENNEMIS AMÉRICAINS

L'augmentation du nombre de décès et d'infections par le COVID-19 (où “CO” signifie corona, “VI” pour virus, “D” pour maladie et 󈬃” indique l'année au cours de laquelle cela s'est produit), comme l'a appelé le directeur général de l'Organisation mondiale de la santé Tedros Adhanom Ghebreyesus le 11 février 2020, c'est tellement vertigineux que désormais aucun établissement de santé ni aucun média au monde n'est en mesure de fournir une mise à jour en temps réel, donc , les données que nous rapportons seront déjà dépassées de moitié maintenant après publication.

Si l'on examine le nombre actuel de morts, on constate que le deuxième pays le plus touché est un autre ennemi historique des États-Unis, l'Iran, au centre des récents affrontements militaires suite à l'assassinat du général Qasem Soleimani, commandant des forces Qods, des Pasdaran iraniens, dans une opération du Pentagone et de la Central Intelligence Agency, l'attaque au missile par les Gardiens de la Révolution islamique de Téhéran contre deux bases américaines en Irak avec 109 soldats grièvement blessés pour des lésions cérébrales, et le crash de l'avion de la CIA Flying Le commandement en Afghanistan, toujours entouré de mystère …

Le principal foyer d'infection et de décès en Iran se situerait à Qom, le lieu de la principale mosquée où les chiites ont hissé le drapeau rouge de vengeance pour la mort de Soleimani, où il est le plus important central, comme le souligne Gospa News dans un rapport précédent. l'enrichissement nucléaire d'uranium qui a repris ses activités à pleine capacité après la sortie de Washington de l'accord Joint Comprehensive Plan of Action, acronyme JCPOA, et encore plus après l'assassinat de l'officier supérieur des Pasdaran (autre nom des gardiens de la révolution pasdarans). Un bunker souterrain qui ne peut pas être attaqué avec des missiles mais pas avec un virus…

ARME BIOGÉNÉTIQUE À HAUT RISQUE POUR L'HUMANITÉ

Compte tenu de l'énormité de la contagion, pour un organisme d'information indépendant, il est désormais non seulement légal mais aussi un devoir de signaler toutes les sources qui décrivent le SARS-CoV-2 comme une arme biologique.

Ces curieuses coïncidences sur son étalement géographique en Chine, rival des USA sur le plan commercial pour la bataille tarifaire, surmontée par un accord à quelques jours du déclenchement de l'épidémie, et de l'Iran, antagoniste sur le front militaire et énergétique , ont été rapportés pour justifier la validité crédible de l'affirmation d'une source ayant des relations importantes avec la Russie et des contacts avec les services de renseignement de divers pays étrangers dont nous prenons évidemment soin de garder l'anonymat.

Le CoronaVirus est une arme biologique propagée par un agent de la CIA en Chine avec des nano-drones. Les États-Unis ont déjà le vaccin » nous a confié un sujet international. Des propos troublants à prendre avec précaution au moins autant que les communiqués officiels des pays de l'OTAN habitués depuis des années à proférer des mensonges pour le prétendu bien de l'Occident.

Peu de mots pour une immense pandémie qui prend de plus en plus les contours d'une attaque militaire criminelle au jour le jour et qui confirme l'alarme lancée il y a quelques mois par le Royaume-Uni soulignée dans le précédent reportage de Gospa News sur la suspicion désormais quasi certaine – cette épidémie a été causée par une arme biogénétique.

Le Center for the Study of Existential Risk (CSER) de l'Université de Cambridge a souligné dans un rapport d'août les dangers de la technologie dans le domaine de la guerre car « une bio-arme pourrait être construite pour cibler un groupe ethnique spécifique en fonction de son profil génomique » Définir cette éventualité « extrêmement néfaste et potentiellement imparable.

EXPERTS AMÉRICAINS : COVID-19 EST UNE BIO-ARME

Dans le même reportage précédent, nous avons également signalé le premier expert mondial qui a déclaré qu'il croyait que le CoronaVirus était une arme biologique.

Francis Boyle est professeur de droit international au Collège de droit de l'Université de l'Illinois. Il a rédigé la législation nationale des États-Unis pour mettre en œuvre la Convention sur les armes biologiques, connue sous le nom de 1989 Combat Terrorism Weapons Act, qui a été approuvée à l'unanimité par les deux chambres du Congrès américain et promulguée par le président George W. Bush. Dans une interview avec le site américain Geopolitics and Empire, il a déclaré que cet instrument de guerre était devenu incontrôlable au laboratoire de niveau de biosécurité 4 (BSL-4) de Wuhan.

A croire la théorie des armes biologiques, il y a Jeff Brown, expert chinois, fondateur avec d'autres journalistes et auteurs internationaux de la Bioweapon Truth Commission, (www.bioweapontruth.com), une organisation indépendante qui a créé la plus grande archive de documentation, de films et publications audio sur les États-Unis et l'Occident. En fait, Brown a commencé à étudier le phénomène depuis les attaques d'armes biologiques américaines contre la Chine pendant la guerre de Corée (1950-1953) et contre la tristement célèbre "Unité 731" du Japon.

Son histoire est bien présentée dans un article du journal britannique The Guardian :

Formé au milieu des années 1930 à Harbin, dans le nord-est de la Chine, l'Unité 731 a mené des expériences mortelles sur environ 3 000 prisonniers, qui étaient pour la plupart chinois et coréens. Selon les récits historiques, des prisonniers hommes et femmes, nommés « bûches » par leurs tortionnaires, ont été soumis à une vivisection sans anesthésie après avoir été délibérément infectés par des maladies telles que le typhus et le choléra. Certains ont eu des membres amputés ou des organes prélevés.

« Alors que le Japon se dirigeait vers la défaite à l'été 1945, le chef de l'unité, le lieutenant-général Shiro Ishii, a interdit aux chercheurs de discuter de leur travail et a ordonné la démolition du quartier général de l'unité à Harbin. À la fin de la guerre, les autorités américaines ont secrètement accordé aux responsables de l'unité l'immunité de poursuites en échange de l'accès à leurs recherches. Plusieurs anciens fonctionnaires de l'Unité 731 ont poursuivi une carrière réussie dans les domaines de la médecine, des universités et des affaires », lit-on dans le post.

C'est pourquoi Brown, auteur du site China Rising, lui-même aujourd'hui, dans un entretien avec Kevin Barrett, expert en terrorisme international, et animateur de l'émission radio Truth Jihad Radio, accuse les États-Unis d'être les manipulateurs de l'épidémie : m en contact avec des gens tous les jours en Chine. Et ils sont sur le pied de guerre. Ils mobilisent des centaines de millions de personnes. Ils ont mobilisé l'armée.

Ils ont mis en quarantaine comme 50 millions de personnes et des centaines de millions de personnes vont maintenant travailler depuis leur domicile pendant les deux prochaines semaines. Je veux dire, c'est pourquoi le taux de mortalité est si faible et le nombre d'incidences est relativement faible, même si, comme vous le dites, les États-Unis ont le motif. Ils ont le modus operandi et ils ont les moyens de le faire.

L'interview, publiée dans son intégralité sur le site Web Veterans Today, dirigé par des officiers de marine vétérans du Vietnam et des experts du renseignement militaire et d'anciens agents de la CIA, a été publiée il y a quelques jours avant l'annonce des 6 morts en Iran. Ce fait, cependant, ne contredit pas le raisonnement de Brown, mais l'étend simplement à un autre groupe ethnique, celui islamique de Téhéran.

Carte des bio-laboratoires de la Defense Threat Reduction Agency (DTRA) du Pentagone dans le projet dévoilé par la journaliste Dilyana Gaytandzhieva

L'existence d'études spécifiques de bio-ingénierie génétique testées sur des insectes et des chauves-souris (parmi les premiers suspects d'être un animal porteur de l'infection) a révélé la même Darpa (Defense Advanced Research Projects Agency), l'agence de recherche en armement du Pentagone qui a officiellement ouvert le secteur de la biologie en 2014.

Pour confirmer que dans au moins 25 laboratoires contrôlés par le département américain de la Défense, il y avait des expériences de développement d'armes biochimiques avec des interactions entre virus et insectes, la journaliste bulgare Dilyana Gaytandzhieva dans son enquête sur les activités d'une autre entité encore plus spécifique du Pentagone : Agence de réduction des menaces pour la défense (DTRA).

Tel que publié par Gospa News, le journaliste, le premier au monde à découvrir les armes conventionnelles livrées par la CIA aux terroristes de l'Etat islamique avant que le dossier turc SETA ne révèle toutes les formations djihadistes fournies en missiles TOW par l'agence de contre-espionnage américaine, a découvert l'existence de recherches dans le domaine de la biogénétique en référence aux génomes chinois et russe.

PROTÉINES “MODÉLISÉES” POUR DEVENIR AGRESSIVE

Eh bien, les soupçons de manipulation biogénétique de Gaytandzhieva, membre de la Commission de vérité sur les armes biologiques de Brown mentionné ci-dessus, sont maintenant partiellement confirmés dans des recherches scientifiques divulguées par une vidéo de certains représentants du Parti communiste chinois (CPP) selon laquelle le double site de langue GNews (proche de l'expert en communication Stephen Bannon, ancien coordinateur de la campagne électorale gagnante de Donald Trump) traduit de la langue d'origine.

« Le 21 janvier, trois chercheurs de l'Académie chinoise des sciences ont publié un article conjoint dans la revue « Science China Life Sciences », rédigé en anglais. Ils ont révélé la vérité sur le nouveau coronavirus, alors s'il vous plaît, surveillez attentivement cette nouvelle » lit-on.

Trois chercheurs ont trouvé cette information – Pei Hao, chercheur de l'Institut Pasteur de Shanghai et de l'Académie chinoise des sciences, Wu Zhong, chercheur du National Engineering Research Center for the Emergence Drugs, Academy of Military Medical Sciences, et Xuan Li , chercheur au Key Laboratory of Synthetic Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences.

Les chercheurs ont été choqués lorsqu'ils ont comparé la protéine S du SRAS avec la protéine S de Wuhan CoV et ont découvert qu'elle ne modifie pas la composition structurelle du virus même si quatre acides aminés ont été remplacés.

Cette recherche indique une découverte importante selon laquelle la protéine S du CoV de Wuhan favorise une forte interaction avec les molécules ACE2 humaines, ce qui peut conduire à infecter les cellules épithéliales des voies respiratoires supérieures. Cette découverte nous a également appris que le Wuhan CoV est très contagieux par nature. Cette recherche a jeté les bases théoriques permettant à la Chine de développer le contrôle, le test et l'intervention du Wuhan CoV de manière scientifique. Après avoir lu le rapport de recherche, les gens sont indignés par l'incrédulité. Le point clé de toutes ces découvertes est que « quatre des protéines S importantes ont été remplacées dans le coronavirus de Wuhan ».

Premièrement, le but est de déguiser le CoV de Wuhan en SRAS pour qu'il soit plus difficile pour les chercheurs en médecine et les médecins de le différencier du SRAS. Cela les induit en erreur à prendre des mesures de prévention de type SRAS, ce qui peut entraîner un retard du traitement et une propagation accrue du virus. Deuxièmement, il est si contagieux qu'il se propage rapidement à dessein – en outre, le Parti communiste chinois blâmé « ce type de crime par le biais de la biotechnologie contre l'humanité peut-il être commis par des chauves-souris ou des rats de bambou ? Dix mille ans d'évolution ne peuvent pas produire ce type d'altération précise de quatre importantes protéines S ! Le fait que le virus de Wuhan ait été créé dans un laboratoire sous influence humaine est indiscutable. C'est inhumain à l'extrême».

En 2010, la Chine a remporté la bataille contre le virus du SRAS. En 2015, l'hôpital de l'APL a remporté des batailles contre le virus Ebola en Afrique. Cette fois, notre ennemi a choisi le Nouvel An chinois pour une nouvelle épidémie virale. Nous sommes confrontés à un nouveau défi. Tout le personnel de recherche médicale et de prévention des épidémies de notre pays est entré dans un état prêt à la guerre. Tous les habitants du pays sont en état d'alerte et prêts au combat. Le peuple chinois gagnera cette guerre, a ajouté le PCC.

Les chercheurs du document synthétique intitulé « Évolution du nouveau coronavirus à partir de l'épidémie en cours de Wuhan et modélisation de sa protéine de pointe pour le risque de transmission humaine » publié dans la revue scientifique sous le titre « lettre à l'éditeur » sont plus prudents mais soulignent les mêmes préoccupations.

L'article scientifique sur Science China – cliquez pour lire le document en anglais

Selon la structure cristalline du domaine RBD de la protéine S du SRAS-CoV complexé avec son récepteur ACE2 (code PDB : 2AJF), ​​la structure complexe 3-D de la protéine Wuhan CoV S se liant à l'ACE2 humain a été modélisée avec une superposition structurelle et une rigidité moléculaire. amarrage - les médecins biochimistes ont écrit – Ainsi, à notre grande surprise, malgré le remplacement de quatre des cinq résidus d'acides aminés d'interface importants, la protéine S du CoV de Wuhan s'est avérée avoir une affinité de liaison significative avec l'ACE2 humain. En regardant de plus près, les résidus de remplacement aux positions 442, 472, 479 et 487 dans la protéine S du CoV de Wuhan n'ont pas modifié la conformation structurelle.

En résumé, notre analyse a montré que le Wuhan CoV partageait avec les coronavirus SRAS/SARS-like un ancêtre commun qui ressemble au coronavirus de chauve-souris HKU9-1. Notre travail souligne la découverte importante que le domaine RBD de la protéine S du CoV de Wuhan prend en charge une forte interaction avec les molécules ACE2 humaines malgré sa diversité de séquences avec la protéine S du SRAS-CoV. Ainsi, le CoV de Wuhan pose un risque de santé publique important pour la transmission humaine via la voie de liaison Sprotein-ACE2.

VACCIN « CINQ YEUX » SOUDAINEMENT PRÊT…

Des chercheurs américains tentent de démanteler l'hypothèse d'un virus de laboratoire dans la discussion avec différents profils sur le site spécialisé Virologica.org où le débat est centré sur le génome et son origine animale (le profil génétique est proche à 99% de celui d'un virus cultivé dans le pangolin de Malaisie). L'un de ces scientifiques, à la fin de sa digression dans laquelle il exclut catégoriquement la manipulation humaine avec des arguments biochimiques décalés, remercie Wellcome Trust pour sa contribution.

Cela montre une relation évidente avec l'un des principaux financiers des expérimentations sur la famille des CoronaVirus avant l'épidémie. Comme rapporté dans l'article précédent, en effet, cette fondation est née après la transformation de la holding pharmaceutique américaine Wellcome rachetée par le groupe Glaxo SmithKline, le notoire GSK, leader dans la production de vaccins dans le monde mais aussi à plusieurs reprises enquêté et condamné. d'innombrables violations pénales en matière de corruption et de lois sur la santé, déjà formellement accusé de contribuer à la recherche d'un vaccin avec l'Université australienne du Queensland (voir article précédent).

Aux dernières nouvelles, en un temps record, le vaccin australien aurait déjà passé les premiers tests et son expérimentation sur des cobayes animaux aurait déjà commencé.Il ne faut pas oublier que le renseignement de l'Australie SIS fait partie du groupe international des services secrets des soi-disant « Five Eyes » avec les États-Unis, le Royaume-Uni, le Canada et la Nouvelle-Zélande.

C'est pourquoi le brevet d'un nouveau vaccin par les Australiens avec l'aide de la big pharma britannique GSK qui est partenaire de l'agence Darpa du Pentagone dans de multiples projets est certainement un autre motif de soupçon.

Wellcome Trust fait plutôt partie des financiers du Pirbright Institute dépositaire du brevet no. 10130701 aux USA pour une recherche ConoraVirus sur des poulets aviaires. Le nom de ce centre de recherche britannique est évoqué dans le cadre de la conversation radiophonique entre les journalistes américains Kevin Barrett et Jeff Brown.

« Eh bien, vous savez, je pense que les gens doivent comprendre que le virus Ebola appartient à, breveté par l'armée américaine. Le virus Zika est breveté par la Fondation Rockefeller. Je viens d'apprendre que le coronavirus, notre ami préféré ces quatre dernières semaines, est breveté par le Pirbright Institute, qui est financé par Bill Gates ».

Le Pirbright Institute a évidemment immédiatement démenti toute implication dans le type "humain" du virus en réitérant que les études ne portaient que sur des poulets. Mais il est clair aussi que s'il avait vraiment élargi le champ de la recherche, il se garderait bien de le déclarer en ces jours d'urgence mondiale.

DE GRAVES DOMMAGES EN CHINE MEME POUR L'INFLUENCE PORCINE

Brown lui-même confirme avoir reçu des informations sur une projection estimée de 65 millions de morts dans le monde d'un informateur du renseignement qui s'est présenté avec le curieux surnom d'Uriah Reep.

«Uriah Heep et moi avons parlé de la façon dont ils ont été manifestement attaqués par un virus de la grippe porcine, la grippe porcine africaine, qui a sauté de la région de la Géorgie, avec le Richard Lugar Bioweapons Lab jusqu'en Chine. Et puis il a fait un bond dans tout le pays, anéanti 40 pour cent des porcheries du pays, dans la plus grande industrie porcine au monde. Et puis ils ont aussi fait la même chose avec la grippe aviaire. Lorsque vous suivez la façon dont ces deux virus, vous savez, se sont propagés à travers la Chine comme une traînée de poudre. Je veux dire, tout comme dans un train à grande vitesse, il n'y a aucun moyen que cela se soit produit naturellement, par le mouvement normal du bétail et de la volaille ».

En fait, en raison de la gravité de la pandémie humaine, l'épidémie porcine est complètement passée au second plan. Cela met la pression sur le système financier chinois en raison de l'inflation induite par la hausse des prix du porc. Le média GNews met en évidence une circonstance très suspecte : la grippe porcine africaine en Chine provenait de porcs russes importés alors que la Chine tentait d'arrêter d'acheter des produits américains pour nuire aux agriculteurs américains.

Le 1er février 2020, le site Web militaire chinois le plus influent, www.xilu.com, a publié un article pour reconnaître que le coronavirus de Wuhan est d'origine humaine, accusant les États-Unis d'avoir créé une telle arme biologique contre la Chine. Portail chinois.

Il est possible que nos ennemis veuillent détruire notre productivité. C'est la soi-disant guerre sans restriction qui affecte tous les aspects de notre économie. La CIA peut infiltrer la Chine par la guerre de propagande et provoquer une « révolution de couleur » à Hong Kong, pourquoi ne peut-elle pas lancer une attaque biochimique en Chine par manipulation ?.

Depuis sa naissance en juillet 2018, Gospa News a élaboré de multiples rapports d'enquête sur la tentative de coup d'État au Venezuela, lorsqu'en 2019, le pays a été mis à genoux par des pannes d'électricité continues causées par des sabotages électromagnétiques qui ont quitté les États-Unis qui, en plus de détruire divers pouvoirs plantes, ont tué plusieurs personnes dans les hôpitaux laissés sans lumière.

Nous avons écrit sur la guerre civile en Ukraine causée par la révolution orange qui a culminé avec le massacre de la place Maidan à Kiev causé par des tireurs d'élite mercenaires géorgiens, sur le conflit en Syrie, où les Casques blancs financés par Londres et Washington ont été accusés de crimes graves. y compris celle d'enfants tués au chlore à Douma pour organiser une fausse attaque chimique de l'armée de Damas, et sur les attaques de drones américains contre les séparatistes houthis au Yémen qui ont fait des milliers de victimes civiles.

Par conséquent, en ce moment, il m'est plus facile de croire les accusations des communistes de Pékin plutôt que les silences ou les démentis de l'OTAN qui viennent de la Maison Blanche.

Le SARS-CoV-2 a toutes les caractéristiques pour être considéré comme une arme biogénétique conçue spécifiquement pour cibler certains groupes ethniques, certainement les Chinois mais probablement aussi les Musulmans iraniens au vu des derniers décès, et il s'est manifesté comme une parfaite tempête virale : en pleine période du Nouvel An chinois où les Asiatiques dispersés dans le monde rentrent chez eux pour faire la fête avec leurs proches, et à quelques semaines des consultations électorales pour le renouvellement du Parlement de Téhéran (ce week-end), un autre moment de grands mouvements et contacts entre la population. Ce qui s'est passé ailleurs peut être le soi-disant « dommages collatéraux » de toute mission militaire.

Selon notre source proche du renseignement étranger, le virus a été propagé en Chine (et probablement ailleurs) par un agent de la CIA équipé de “nano-drones” qui sont faciles à cacher pendant le transport et à utiliser sans prêter attention au transport de matériel de contagion en capsules ou vitro à répandre ou à faire exploser avec des décharges électromagnétiques au bon moment.

La technologie développée par l'agence DARPA du Pentagone et mise au service de l'armée américaine ou du National Clandestine Service, le bureau des opérations tueuses de la CIA, est parmi les plus sophistiquées au monde comme le rapportait le précédent rapport sur les armes biochimiques. . Parmi les moyens possibles dont dispose l'armée américaine pour la diffusion d'armes de masse figurent deux tout nouveaux bijoux de micro-ingénierie.

La première dépasse toute imagination humaine pour ceux qui ne sont pas dans le secteur et part d'un projet rudimentaire.

LA CYBER-LIBRONFLY ET LE NANO-DRONE

La CIA a créé son propre drone de taille nanométrique dans les années 1970. À une époque où le gouvernement exigeait un appareil d'écoute miniature, ils ont inventé un bourdon mécanique. Leur conception initiale était trop difficile à contrôler, alors ils ont abandonné l'idée et ont inventé l'Insectothopter, un mini drone libellule lit-on sur le site Web de Globaldroneuav, une société chinoise spécialisée dans la fourniture de pièces détachées pour les véhicules aériens sans pilote et administrée par l'armée de Pékin à la retraite. le colonel Qin Ren-ping, en tant que PDG.

L'insectothopter a connu des problèmes de contrôle de vol chaque fois que des vents de travers étaient apparents, il n'a donc pas été utilisé sur le terrain et est maintenant stocké au musée de la CIA.

libellule, le cyber-insecte-espion génétiquement modifié, piloté à la lumière

Selon Popular Mechanics, DragonflEye est une libellule génétiquement modifiée avec des « neurones directeurs » sensibles à la lumière implantés dans sa moelle épinière. Les insectes équipés d'un sac à dos personnalisé rempli de capteurs sont capables d'être contrôlés, mais ils sont encore en développement. Des flashs de lumière sont utilisés pour faire voler ou bouger les insectes», lit-on sur le même site.

Il semble maintenant que le projet a surmonté le premier obstacle après que certaines des libellules génétiquement modifiées aient pris leur premier vol. L'idée a été développée par des chercheurs du laboratoire Charles Drak Stark et du Howard Hughes HHMI Medical Institute, spécialisé dans la recherche biomédicale et partenaires de divers projets DARPA. À l'été 2017, leurs premiers tests positifs ont eu une grande visibilité dans les médias et sur YouTube également avec l'interview des chercheurs.

Ce système repousse les limites de la récupération d'énergie, de la détection de mouvement, des algorithmes, de la miniaturisation et de l'optogénétique, le tout dans un système suffisamment petit pour qu'un insecte puisse porter J. Wheeler, ingénieur biomédical au Draper and Howard Hughes Medical Institute et chercheur principal de la technologie a déclaré dans un communiqué, selon Us TomoNews.

Les libellules cyborg pourraient être transformées en de minuscules systèmes de surveillance. D'autres applications de cette technologie peuvent inclure la pollinisation guidée, la livraison de la charge utile et la médecine de précision et les diagnostics sont spécifiés.

Depuis deux ans, on ne sait rien de DragonflEye et de son utilisation possible dans le domaine militaire compte tenu de la collaboration consolidée entre l'Institut Hughes et le Pentagone. Cependant, il est clair que si une libellule peut être génétiquement modifiée et télécommandée pour la pollinisation de la même manière, elle peut être facilement pilotée pour la propagation d'un virus.

Si cela apparaît comme la solution la plus futuriste pour toutes ses implications, évidemment au détriment du pauvre insecte complètement déformé par des souffrances que personne ne saura jamais, il existe une alternative beaucoup moins science-fiction et plus pragmatique déjà largement utilisée par divers OTAN. armées. Il s'agit du nano-UAV Black Hornet produit par le norvégien Prox Dynamics et déjà impitoyable par les forces armées britanniques en Afghanistan depuis 2012 en tant que drone de surveillance et de reconnaissance.

Adopté également par les Marines américains, l'armée australienne et les départements spéciaux de l'armée allemande Bundeswehr et du Forsvaret norvégien, c'est le plus petit engin volant télécommandé existant puisqu'il ne mesure que 10 cm de long avec un diamètre de rotor de 12 cm.

Black Hornet 3 nano-drone qui peut voler même dans les zones sans GPS

La société scandinave a ensuite été rachetée par la société américaine FLIR Systems, Inc., leader dans la conception et la production de caméras infrarouges et l'un des principaux fournisseurs du département américain de la Défense. En juin 2018, la version mise à jour de Black Hornet 3 a été présentée, laquelle au système de reconnaissance personnelle (PRS) du nano-drone d'origine a ajouté la possibilité de naviguer dans des environnements sans GPS, permettant au chasseur de maintenir une conscience situationnelle, la détection des menaces et la surveillance. partout où la mission le mène.

Pouvoir voler sans connexion GPS peut donc échapper à la détection du radar au vu de sa taille microscopique. Il est dans les doigts de la main d'un soldat, il a un poids à vide de 18 g, une vitesse de croisière de 36 km/h, une autonomie de 25 minutes (mais en cas de problème ou de batterie insuffisante il revient à la base de manière autonome ) et une portée de 1600 mètres. Il est piloté grâce à un moniteur connecté à la caméra installée sur l'avion. Le kit de contrôle à deux appareils pèse moins de 1kg et peut tenir dans le sac à dos d'un militaire comme dans celui de tout touriste de passage en Chine…

Avec ces références, nous avons donc montré comment la propagation d'une arme biologique via des nano-drones fournis par des sources de renseignement internationales est parfaitement envisageable et réalisable. Qui aurait pu le mettre en œuvre, comment, où et quand des mystères demeurent évidemment.

“Dark Prince” était certainement au courant de ces mystères, Michael d’Andrea, commandant des opérations spéciales de la Central Intelligence Agency’s au Moyen-Orient, qui a disparu sur l'avion espion Bombardier / Northrop Grumman E-11A s'est écrasé ” 8211 ou abattu – en Afghanistan quelques jours. avant que le virus ne devienne une formidable épidémie en Chine et dans de nombreux pays du monde. Les patrons américains 007 ont soudainement disparu avec tous ses secrets …

© 2020 – Fabio Giuseppe Carlo Carisio – aucune reproduction sans autorisation – versione originale in italiano


Partir de rien

Lorsque les autorités sanitaires chinoises ont été confrontées pour la première fois à l'épidémie, il y avait une familiarité troublante. Ils avaient déjà traité un ensemble similaire de symptômes lors de l'épidémie de SRAS au début des années 2000 et avaient vu la propagation du MERS une décennie plus tard. Grâce à ces virus et à des virus apparentés, nous disposions déjà d'une description détaillée de la structure du génome typique du coronavirus dès 2005. Cette connaissance s'avérerait sans aucun doute essentielle pour la première étape du développement d'un test de diagnostic rapide : la caractérisation du génome du nouveau virus, 2019-nCoV.

Parce que nous savons à quoi ressemble le coronavirus moyen, nous avons pu identifier des zones qui ne changent pas beaucoup au fil de l'évolution des nouveaux membres de cette famille de virus. Et cela nous permet d'obtenir des séquences de son génome sans isoler au préalable le virus.

Le premier défi du séquençage d'un génome de coronavirus est qu'il est composé d'ARN plutôt que d'ADN. La plupart de nos outils pour travailler avec les acides nucléiques sont spécifiques à l'ADN. Heureusement, nous avons découvert une enzyme appelée "transcriptase inverse" qui prend l'ARN et en fait une copie de l'ADN - la transcription est la copie de l'ADN en ARN, cette enzyme fait le contraire, d'où son nom. (La transcriptase inverse a été identifiée pour la première fois dans d'autres virus à ARN qui doivent être copiés dans l'ADN dans le cadre de l'infection.) À l'aide de la transcriptase inverse, les chercheurs ont pu faire des copies d'ADN de parties de 2019-nCoV comme première étape pour étudier son génome.

Mais la transcription inverse d'échantillons d'individus infectés créerait simplement un fouillis de fragments d'ADN à partir de tout ce qui est présent : les propres cellules du patient, des bactéries inoffensives, etc. Heureusement, les techniques de séquençage et d'analyse de l'ADN sont devenues si avancées qu'il est désormais possible de simplement séquencer tout le désordre, les choses non pertinentes et tout, et de laisser les ordinateurs trier ce qui est présent. Le logiciel est capable de prendre ce que nous savons du génome moyen du coronavirus et d'identifier tous les fragments de séquence qui voir comme s'ils venaient d'un coronavirus. D'autres logiciels peuvent déterminer comment tous ces fragments se chevauchent, puis les assembler, produisant un génome de coronavirus presque complet.

À ce stade, les autorités sanitaires chinoises ont reconnu que le virus impliqué dans ces infections était nouveau et elles ont rapidement publié la séquence du génome du virus afin que d'autres organisations de santé puissent se préparer.


Lumières laser et LED - Traitements GHK-Cu

Miller TR, Wagner JD, Baack BR, Eisbach KJ, Effets du complexe tripeptide de cuivre topique sur la peau resurfacée au laser CO2. Chirurgie de la plastie faciale de la voûte plantaire. 2006 juil.-8 août(4):252-9.

Cangul IT, Gul NY, Topal A, Yilmaz R, Évaluation des effets du complexe topique tripeptide-cuivre et de l'oxyde de zinc sur la cicatrisation des plaies ouvertes chez le lapin. Vétérinaire Dermatol. 2006 Déc17(6):417-23.

Huang PJ, Huang YC, Su MF, Yang TY, Huang JR, Jiang CP, Observations in vitro sur l'influence des aides peptidiques de cuivre pour la photoirradiation LED de la synthèse du collagène des fibroblastes. Chirurgie Laser Photomed. 25 juin 2007 (3) : 183-90.

Stimulation de la croissance des cheveux

Publications sur les SRCP et la croissance des cheveux

Des méthodes pour la conception et le test de complexes cuivre-peptide avec des propriétés de croissance des cheveux sont décrites.

Une grande variété d'analogues de GHK-Cu ont été décrits qui augmentent la taille des follicules pileux et augmentent la croissance des cheveux chez les souris et les rats.

Étudier Résultat Référence
Utilisation d'analogues du GHK-Cu pour l'agrandissement du follicule pileux et la stimulation de la croissance des cheveux Brevet US 5 120 831 Nouveaux complexes et dérivés de peptides métalliques utilisés pour stimuler la croissance des cheveux chez les animaux à sang chaud, en particulier les humains. Pickart Brevet US 5 177 061 Compositions pour stimuler la pousse des cheveux contenant des complexes cuivriques de dérivés peptidiques notamment. ester n-octylique de glycyl-l-histidyl-l-lysine. Pickart Brevet US 5 214 032 Nouveaux composés de cuivre glycyl-histidyl-lysyle utilisés pour stimuler la croissance des cheveux. Pickart US 5 550 183 Compositions métal-peptide et procédés pour stimuler la croissance des cheveux. Pickart
Stimulation de la pousse des poils chez la souris Des analogues de GHK avec des résidus hydrophobes ont été testés et se sont avérés stimuler la croissance des poils chez le rat. Les propriétés stimulantes du follicule pileux des complexes peptidiques de cuivre. Résultats chez les souris C3H. Fors, Pickart et Uno Ann N Y Acad Sci 1991 26642: 468-9
Stimulation de la pousse des poils chez la souris et le rat Les détails de la stimulation des cheveux par les peptides de cuivre ont été étudiés par 1) phototrichogramme, 2) folliculogramme (analyse micro morphométrique) et 3) le taux de synthèse d'ADN dans les cellules folliculaires. Les effets étaient essentiellement une stimulation de la prolifération des cellules folliculaires, entraînant un élargissement des follicules anagènes du type vellus au type terminal (thérapie) ou un maintien des follicules terminaux pie (prévention). Un SRCP (PC1020) a eu pour effet une hypertrophie folliculaire sur la peau du dos des rats duveteux, recouvrant les follicules du vellus. Les agents chimiques et les peptides affectent la croissance des cheveux. Uno et Kurata (Université du Wisconsin, Madison, États-Unis) J Invest Dermatol 1993 101(1 Suppl):143S-147S
Minimiser la chute des cheveux après une chimiothérapie anticancéreuse Protection contre la chute des cheveux par le complexe peptide-cuivre dans des modèles animaux d'alopécie induite par la chimiothérapie. Awa et Nogimori Journal Of Dermatological Science, Vol: 10, 1995, 99-104
Croissance des cheveux humains Stimulation de la croissance des cheveux chez l'homme avec des analogues du GHK-Cu Analyse par phototrichogramme de la stimulation des follicules pileux : une étude clinique pilote avec un complexe peptide-cuivre. Patt, Duncan et Kalis (Université de Reims, France) Techniques de Recherche Dermatologique, (CRC Press), pp-217-226, 1996
Croissance des poils chez les rats Stimulation de la pousse des poils chez le rat Évaluation quantitative de la stimulation des follicules pileux induite par le complexe peptide-cuivre à l'aide des techniques de recherche dermatologique Fuzzy Rat, Uno, Packard, Patt (Université du Wisconsin), (CRC Press), pp-227-239, 1996
Croissance des poils chez les rats Stimulation de la pousse des poils chez le rat avec des analogues du GHK-Cu Évaluation de la stimulation des follicules pileux télogènes à l'aide d'un modèle in vivo : résultats avec des complexes peptidiques de cuivre. Timpe, Dumwiddie, Patt (Procyte Corp.) Techniques de recherche dermatologique, (CRC Press), pp-241-254, 1996
Étude humaine de la croissance des cheveux avec l'analogue GHK-Cu Comparaison de l'analogue GHK-CU dans Tricomin avec 2% de minoxidil. Tricomin 2,5% a augmenté le nombre de cheveux de 97 cheveux non-vellus tandis que le minoxidil 2% a augmenté le nombre de 73 cheveux non-vellus après 3 mois (nombre de cheveux non-vellus) Communiqué de presse de Procyte Corp. 1997
Peptides de cuivre à action prolongée et résistants à la dégradation utilisés pour stimuler la croissance des cheveux Cuivre testé complexé avec des protéines peptones pour les effets de la croissance des cheveux chez la souris. Le mélange cuivre-peptide a produit plus de croissance des cheveux chez la souris que les analogues du GHK-Cu Pickart Brevet US 5 554 375 Compositions protectrices et régénératrices des tissus.
Revoir Remodelage de la peau et croissance des cheveux Pickart L, Effet des peptides de cuivre sur la croissance et l'état des cheveux, Body Language Dermatology 2004, Numéro 7, pages 20-22
Revoir Remodelage de la peau et croissance des cheveux Pickart L, Peptides de cuivre de remodelage de la peau pour améliorer la croissance des cheveux, Cosmetics & Medicine (Russie) 2004, numéro 3, pages 14-29
Étude des follicules humains en culture d'organes AHK-Cu a augmenté la croissance des cellules folliculaires tout en diminuant la mort cellulaire programmée (apoptose) Pyo HK, Yoo HG, Won CH, Lee SH, Kang YJ, Eun HC, Cho KH, Kim KH, L'effet du complexe tripeptide-cuivre sur la croissance des cheveux humains, Arch Pharm Res 2007, vol 7, 834-839.

Analogues GHK-Cu et stimulation de la croissance des cheveux

Certains analogues du GHK-Cu ont la propriété d'agrandir les follicules pileux et de stimuler la croissance des cheveux. Ces analogues ont un caractère plus gras que le GHK-Cu.Cette augmentation des propriétés de type graisse est obtenue soit en synthétisant chimiquement des acides gras dans la molécule de GHK, soit en attachant des résidus d'acides aminés tels que l'alanine, la phénylalanine ou la leucine à la structure de base du GHK.

Ces analogues sont apparus à l'origine dans une tentative de créer des analogues de GHK-Cu qui seraient retenus dans les tissus corporels pendant de plus longues périodes. Cependant, il a été noté que - alors que ces analogues étaient des agents cicatrisants supérieurs - ils augmentaient également de manière marquée la croissance des poils autour de la périphérie des plaies expérimentales chez la souris.

Ces analogues stimulant les cheveux ont été créés par les Drs. Steven Lovejoy, Loren Pickart et Boris Weinstein. Les effets de la réparation de la peau et de l'amélioration de la croissance des cheveux sont étroitement liés. Une nouvelle peau semble naître du follicule pileux. Certains produits à base d'Iamin peuvent être utilisés à la fois pour réparer la peau, augmenter la taille des follicules pileux et stimuler la croissance des cheveux. À mesure qu'une personne vieillit, nos follicules pileux deviennent plus petits, produisant des tiges capillaires plus fines. Une cause majeure de la miniaturisation des follicules pileux semble être due au développement de changements frappants dans les capillaires entourant les follicules pileux. Des études approfondies du cuir chevelu masculin de la naissance à la sénescence trouvent des changements très importants dans la structure des vaisseaux sanguins du cuir chevelu. Le nombre de boucles capillaires sanguines alimentant le follicule pileux est fortement diminué. La circulation sous-épidermique inadéquate qui peut se développer à mesure que les hommes vieillissent ne fournit pas une nutrition riche pour le follicule. Une forte croissance des cheveux nécessite un flux important de nutriments tels que des vitamines, des minéraux et des acides aminés afin que le follicule puisse synthétiser activement de nouveaux cheveux.

Les troubles du flux sanguin vers le follicule et leur inversion peuvent expliquer pourquoi l'administration de peptides de cuivre (tels que Tricomin) au cuir chevelu augmente la croissance des cheveux et augmente la taille des tiges capillaires. On sait depuis longtemps que certains complexes cuivre-peptide stimulent fortement l'angiogenèse ou la formation de nouveaux vaisseaux sanguins. L'augmentation de la taille du follicule pileux et le taux de croissance des cheveux causés par l'administration de peptides de cuivre peuvent être dus à leurs modifications du flux sanguin qui fournissent des nutriments adéquats au follicule, produisant des cheveux à croissance plus rapide avec des tiges capillaires plus épaisses. L'ion de cuivre complexé avec certains peptides a des effets à la fois sur la réparation de la peau et l'amélioration de la croissance des cheveux. Des exemples de ceci sont Tricomin et GraftCyte qui sont basés sur les travaux antérieurs de Pickart (de ProCyte Corporation).

Plus de croissance des cellules folliculaires et moins de mort cellulaire programmée (apoptose)

Au cours du vieillissement chez les hommes et les femmes, il y a une diminution progressive de la taille des follicules pileux. Cela produit des cheveux plus fins et, avec le temps, arrête la croissance de nouveaux cheveux.

Pyo et al (référence ci-dessus) proposent, sur la base d'études de follicules pileux humains, que les actions des peptides de cuivre augmentent la croissance cellulaire dans les follicules pileux en culture tout en diminuant la mort cellulaire programmée ou l'apoptose. Les peptides de cuivre diminuent également la protéine Bax qui augmente l'apoptose. Leurs études utilisent Ala-His-Lys-cuivre, un proche analogue du GHK, que j'avais trouvé pour stimuler la croissance des cheveux il y a de nombreuses années.

Ainsi, les peptides de cuivre peuvent fonctionner en ralentissant le taux de mort cellulaire programmée dans les follicules pileux humains, ce qui arrête finalement la croissance des cheveux humains.

La peau de la souris de gauche a été rasée, puis traitée en trois points avec des peptides de cuivre. Le résultat est une pousse des cheveux beaucoup plus rapide (les trois plaques circulaires de cheveux) dans les trois taches traitées avec des peptides de cuivre. Bien que la croissance des cheveux humains ne réponde pas de manière aussi spectaculaire que celle des souris, la santé de la peau et la fonction des follicules pileux sont étroitement liées. Une nouvelle peau semble naître du follicule pileux. À mesure qu'une personne vieillit, nos follicules pileux deviennent plus petits, produisant des tiges capillaires plus fines. La circulation sanguine qui fournit des nutriments et de l'oxygène au follicule pileux envoie moins de vaisseaux sanguins au follicule pileux, inhibant ainsi le flux vital de nutriments vers le follicule pileux. Les complexes cuivre-peptide améliorent la santé de la peau et une peau plus saine augmente le réseau de vaisseaux sanguins vers les follicules pileux, ce qui donne des follicules plus gros qui poussent les cheveux plus rapidement avec des tiges capillaires plus épaisses.



Dans les images microscopiques à gauche, les grossissements sont identiques. La photo du haut est une peau de souris non traitée avec des peptides de cuivre. La photo du bas est une peau de souris traitée avec des peptides de cuivre. Notez les follicules pileux plus gros (les colonnes violettes allongées) sur la photo du bas, la teneur accrue en graisse sous-cutanée dans la peau (la matière blanche au centre de la peau) et l'épaisseur accrue de la peau. Quand nous sommes jeunes, nous avons une couche de graisse sous la peau (partie de la « graisse de bébé ») qui se réduit considérablement avec l'âge. Les chercheurs capillaires ont noté l'accumulation de cette graisse autour des follicules sains qui poussent vigoureusement les cheveux, et son manque relatif autour des follicules dormants, ont postulé que ces cellules remplissent une fonction de soutien pour le follicule pileux. Il faut souligner que les effets chez l'homme sur la santé des follicules pileux ne sont pas aussi dramatiques.

Nouvelle formation de follicule pileux ?

Parfois, les SRCP peuvent apparemment induire une prolifération de follicules pileux, bien que ce phénomène soit difficile à reproduire de manière cohérente. La photographie du haut est un champ microscopique de follicules pileux de souris chez un animal traité uniquement avec une solution saline. La photographie du bas est une zone similaire de peau de souris traitée avec des peptides de cuivre et qui a une densité de follicules pileux beaucoup plus élevée. Les expériences individuelles sur la multiplication des follicules pileux sont cohérentes, c'est-à-dire que l'effet est réel lorsqu'il se produit, mais des résultats répétés sont difficiles à obtenir. La variabilité peut être due à un timing différent dans le cycle de croissance des cheveux ou à de légers changements dans le type ou la formulation des préparations de cuivre-peptide. De telles expériences suggèrent fortement que, dans certaines circonstances, la formation de nouveaux follicules pileux peut être induite chez les animaux adultes.

Réduire la chute des cheveux après la chimiothérapie / Réduire la chute des cheveux pendant la chimiothérapie

La perte de cheveux causée par les médicaments de chimiothérapie utilisés pour le traitement du cancer peut être minimisée avec des peptides de cuivre. Awa et Nogimori ont découvert que l'application de peptides de cuivre minimise la chute des cheveux après la chimiothérapie et accélère la croissance de nouveaux cheveux chez les rats.

Les rats ont été prétraités avec des SRCP puis exposés à des médicaments chimiothérapeutiques. Cela a réduit la perte de cheveux.

Si les rats recevaient d'abord des médicaments chimiothérapeutiques, puis traités avec des SRCP, les SRCP accéléraient la repousse des cheveux.

T. Awa, K. Nogimori et R. Trachey, Protection contre la chute des cheveux par un complexe peptide-cuivre dans des modèles animaux d'alopécie induite par la chimiothérapie. J. Derm. Sci. 10, 99-104 (1995)

GHK, cuivre, régénération et cellules souches

La principale cause du vieillissement est le déclin de la fonction des organes au fil du temps. Jusqu'à l'âge de 20 ans, les tissus et les organes sont maintenus dans un état pleinement fonctionnel et sain. Mais à mesure que nous vieillissons, la réparation ralentit et nos organes ne parviennent pas à remplir leur rôle biologique. Les cellules souches adultes dans les organes créent de nouvelles cellules pour la réparation et la protéine clé dans l'activation et le soutien de la fonction des cellules souches semble être la protéine P63. Sans P63 adéquat, la peau vieillit rapidement comme le font les autres tissus du corps.

GHK-Copper augmente la protéine P63 en plus de toutes les autres fonctions de protection et de réparation de GHK-Copper. C'est le dernier lien pour comprendre le rôle du GHK-Cuivre dans le corps humain, comme indiqué dans le graphique ci-dessous.

Des études récentes ont révélé que les animaux plus âgés ont autant de cellules souches adultes dans leur corps que les jeunes animaux. Cependant, ces cellules souches ne sont pas différenciées en types de cellules nécessaires pour rajeunir les tissus plus anciens.

D'après mes études précédentes, nous connaissons la quantité de GHK-Cuivre nécessaire pour activer une forte guérison systémique de la peau dans tout le corps chez les souris, les rats et les porcs. Cela devrait être le même que celui nécessaire pour augmenter P63 et activer les cellules souches épithéliales puisque la cicatrisation des plaies se déroule via les actions des cellules souches. Le GHK-Copper doit également activer d'autres types de cellules souches adultes car il a de fortes actions cicatrisantes sur l'estomac, les muqueuses intestinales et le tissu osseux. Environ 75 milligrammes de GHK-Copper injectés trois fois par semaine devraient être suffisants pour activer les cellules souches humaines et améliorer le fonctionnement des organes chez les personnes âgées. Il est possible que GHK-Copper soit efficace en tant que supplément oral enfermé dans des liposomes spéciaux qui sont absorbés par le système lymphatique pour éviter une éventuelle dégradation par les enzymes intestinales.

Le niveau de 75 milligrammes de GHK-Copper devrait être très sûr et est 280 fois inférieur aux actions négatives attendues de la molécule causées par ses actions d'abaissement de la pression artérielle.

Dans les études de culture cellulaire, le cuivre GHK augmente la différenciation des cellules souches embryonnaires. Cependant, dans un système de culture d'organes, le cuivre GHK "activait" les cellules souches adultes qui produisaient alors plus de kératinocytes.

GHK testé pour arrêter la différenciation des cellules souches

GHK-Cu testé pour stimuler la différenciation des cellules souches

GHK a réduit le potentiel clonogénique des cellules souches de 78%

Le GHK-Cu a augmenté le cuivre cellulaire de 2162% au-dessus de la valeur de contrôle et a provoqué la différenciation des cellules souches

Méthodes de contrôle de la prolifération et de la différenciation des cellules souches et progénitrices, brevet américain : 6 962 698, Peled, Tony, Fibach, Eitan, Treves Avi, Gamida Cell Ltd. (Jerusalem, IL) et Hadasit Medical Research Services and Development, Ltd. (Jerusalem , IL)

GHK-cuivre a activé les cellules souches adultes en augmentant les intégrines, P63 et PCNA. Cette augmentation de la prolifération des kératinocytes.

Arch Dermatol Res. 2009 avril301(4):301-6. Le cuivre-GHK augmente l'expression de l'intégrine et la positivité de la p63 par les kératinocytes. Kang YA, Choi HR, Na JI, Huh CH, Kim MJ, Youn SW, Kim KH, Park KC. Département de dermatologie, Seoul National University College of Medicine, Yeongeon-dong, Jongno-gu, Séoul, République de Corée.

Le glycyl-L-histidyl-L-lysyl (GHK) possède une grande affinité pour les ions cuivre(II), avec lesquels il forme spontanément un complexe (cuivre-GHK). Il est bien connu que le cuivre-GHK joue un rôle physiologique dans le processus de cicatrisation des plaies et de réparation tissulaire en stimulant la synthèse de collagène dans les fibroblastes. Cette étude a été menée pour étudier les effets du cuivre-GHK sur les kératinocytes. Les effets prolifératifs ont été analysés et la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine et l'immunohistochimie ont été menées pour évaluer les effets du cuivre-GHK dans des modèles d'équivalent de peau (SE). De plus, un western blot a été réalisé. Dans les kératinocytes cultivés en monocouche, le cuivre-GHK a augmenté la prolifération des kératinocytes. Lorsque les modèles SE ont été évalués, les cellules basales sont devenues cubiques lorsque du cuivre-GHK a été ajouté. L'analyse immunohistochimique a révélé que le cuivre-GHK augmentait la positivité de l'antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA) et de la p63. De plus, l'expression des intégrines alpha6 et bêta1 a augmenté dans les modèles SE, et ces résultats ont été confirmés par Western blot. Les résultats de cette étude indiquent que le traitement avec le cuivre-GHK peut augmenter le potentiel prolifératif des kératinocytes basaux en modulant l'expression des intégrines, p63 et PCNA. De plus, des niveaux accrus de p63, un marqueur putatif des cellules souches de la peau, suggèrent que le cuivre-GHK favorise la survie des cellules souches basales de la peau.

Cellule souche cellulaire. 25 juillet 2009 (1) : 64-75. TAp63 prévient le vieillissement prématuré en favorisant le maintien des cellules souches adultes. Su X, Paris M, Gi YJ, Tsai KY, Cho MS, Lin YL, Biernaskie JA, Sinha S, Prives C, Pevny LH, Miller FD, Flores ER. Département d'oncologie moléculaire et cellulaire, École supérieure de sciences biomédicales, MD Anderson Cancer Center de l'Université du Texas, Houston, TX 77030, États-Unis.

Les mécanismes cellulaires qui régulent le maintien des cellules souches des tissus adultes sont encore largement inconnus. Nous montrons ici que le membre de la famille p53, TAp63, est essentiel au maintien des précurseurs épidermiques et dermiques et qu'en son absence, ces précurseurs sénescent et vieillissent prématurément la peau. Plus précisément, nous avons développé une souris knock-out conditionnelle TAp63 et l'avons utilisée pour l'ablation de TAp63 dans la lignée germinale (TAp63(-/-)) ou dans des cellules exprimant K14 dans la couche basale de l'épiderme (TAp63(fl/fl)K14cre+). Les souris TAp63(-/-) vieillissent prématurément et développent des cloques, des ulcérations cutanées, une sénescence des cellules dermiques et épidermiques associées aux follicules pileux et une diminution de la morphogenèse des cheveux. Ces phénotypes sont probablement dus à la perte de TAp63 dans les précurseurs dermiques et épidermiques puisque les deux types cellulaires présentent une prolifération défectueuse, une sénescence précoce et une instabilité génomique. Ces données indiquent que TAp63 sert à maintenir les cellules souches de la peau adulte en régulant la sénescence cellulaire et la stabilité génomique, empêchant ainsi le vieillissement prématuré des tissus.

La sénescence cellulaire est une forme distinctive d'arrêt du cycle cellulaire qui a été suggérée pour moduler les processus de suppression tumorale et de vieillissement. Bien qu'une compréhension détaillée de la machinerie cellulaire régulant ce processus soit en train d'émerger, une compréhension plus approfondie des principaux acteurs liant la sénescence au vieillissement de l'organisme est nécessaire. La découverte récente que la perte de la protéine p63 liée à p53 induit la sénescence cellulaire et provoque des caractéristiques de vieillissement accéléré fournit une preuve supplémentaire que la sénescence cellulaire est intimement liée au vieillissement de l'organisme, et identifie p63 comme un régulateur clé de ces deux processus.

Le membre de la famille p53 p63 comprend de multiples isoformes et est essentiel pour le développement épithélial stratifié. Dans ce numéro de Cell Stem Cell, en générant des souris knock-out spécifiques aux isoformes, Su et al. (2009) révèlent des rôles essentiels pour TAp63 dans le maintien des précurseurs dermiques et épidermiques, la stabilité génomique et la longévité des organismes

La caractéristique distinctive des cellules souches adultes est leur extraordinaire capacité à se diviser avant le début de la sénescence. Alors que les épithéliums stratifiés tels que la peau, la prostate et le sein sont hautement régénérants et représentent de manière disproportionnée les cancers humains, les gènes essentiels à la capacité de prolifération de leurs cellules souches restent inconnus. Ici, nous analysons p63, un gène dont la suppression chez la souris entraîne la perte catastrophique de tous les épithéliums stratifiés. Nous démontrons que p63 est fortement exprimé dans les cellules épithéliales avec une capacité clonogénique et proliférative élevée et que les cellules souches dépourvues de p63 subissent une prolifération prématurée. De plus, nous montrons que p63 est indispensable à la fois pour l'engagement et la différenciation de ces cellules souches au cours de la morphogenèse des tissus. Ensemble, ces données identifient p63 comme un déterminant clé, spécifique à la lignée, de la capacité de prolifération des cellules souches des épithéliums stratifiés.

Études de cicatrisation et de réparation de la peau à l'aide de SRCP

La cicatrisation d'une plaie chirurgicale chez 10 rats témoins et 10 rats traités par GHK-Cu a été étudiée.

L'application de GHK-Cu a nettement stimulé la fermeture des plaies

Effet des médicaments injectés localement sur la cicatrisation des plaies des coussinets chez le chien. Swaim SF, Vaughn DM, Kincaid SA, Morrison NE, Murray SS, Woodhead MA, Hoffman C.E, Wright JC, Kammerman JR, College of Veterinary Medicine, Auburn University, AL, USA, Am J Vet Res 1996 Vol. 57, 394-9

Évaluation de médicaments complexes multipeptides de cuivre sur la cicatrisation des plaies ouvertes chez le chien. Swaim, Bradley, Spano, McGuire et Hoffman (Collège de médecine vétérinaire, Université d'Auburn, AL, États-Unis) J Amer Ani Hos Assoc. 29, 519-525, 1993

La cicatrisation est très altérée chez les patients immunodéprimés et la contraction de la plaie est altérée - Les rats ont été immunodéprimés avec des injections de cortisone, puis l'effet du GHK-Cu a été déterminé.

Chez les rats immunodéprimés, la synthèse de collagène était de 23 % de celle des rats normaux. Le GHK-Cu a plus que triplé la synthèse de collagène chez ces rats, l'élevant à 77% de la cicatrisation normale et restaurée. GHK-Cu a restauré la contraction normale de la plaie chez les rats supprimés

Crème GHK-Cu testée sur la cicatrisation des ulcères cutanés.

GHK-Cu a augmenté la réépithélialisation des ulcères

Amélioration de la cicatrisation des ulcères chez les patients diabétiques par traitement topique de glycyl-l-histidyl-l-lysine Mulder GD, Patt L, Sanders L, Rosenstock J, Altman MI, Hanley ME, Duncan GW, Wound Rep Reg 2:259-269 , 1994

Testé GHK-Cu sur la cicatrisation des plaies par incision linéaire.

Le GHK-Cu a augmenté la résistance à la traction de la plaie de 74 % et la néovascularité de 69 %.

Testé des SRCP de 2e génération sur la réparation de la peau lésée par l'allergie au nickel chez l'humain.

Une étude en double aveugle contrôlée par placebo a révélé une accélération de la récupération de la peau après une blessure et une puissante action anti-inflammatoire.

Testé des SRCP de 2e génération sur la réparation de la peau endommagée par le ruban adhésif humain.

Une étude en double aveugle contrôlée contre placebo a révélé une accélération du taux de réparation de la peau

Testé des SRCP de 2e génération sur la réparation de la peau endommagée par les détergents humains pendant 24 heures.

Une étude en double aveugle contrôlée contre placebo a révélé une accélération du taux de réparation de la peau

Testé des SRCP de 2e génération sur la réparation de la peau humaine endommagée par l'acétone.

Une étude en double aveugle contrôlée contre placebo a révélé une accélération du taux de réparation de la peau

Cangul IT, Gul NY, Topal A, Yilmaz R, Évaluation des effets du complexe topique tripeptide-cuivre et de l'oxyde de zinc sur la cicatrisation des plaies ouvertes chez le lapin. Vétérinaire Dermatol. 2006 Déc17(6):417-23.

Arul V, Kartha R, Jayakumar R, Une approche thérapeutique pour la cicatrisation des plaies diabétiques utilisant des matrices de collagène biotinylées incorporées au GHK, Life Sci. 2007 janvier 280(4):275-84.

Création de ProCyte pour le développement de produits de cicatrisation des plaies

En 1985, Barbara Weinstein et moi avons fondé ProCyte Corporation pour développer le GHK-Cu à des fins cliniques de cicatrisation des plaies. William Weinstein, son fils et avocat, a obtenu les droits de brevet de la technologie pour l'entreprise. Le GHK-Cu ayant des actions directes sur les cellules importantes dans la cicatrisation, j'ai nommé la société ProCyte - mots latins signifiant - "pour la cellule". Le Dr John Majnarich nous a donné des locaux et des fournitures de laboratoire.

Depuis lors, GHK-Cu a eu de nombreux succès dans la cicatrisation expérimentale des plaies dans des modèles animaux. Cependant, dans les études cliniques humaines, il a eu un certain nombre de succès limités et n'a pas réussi à prouver son efficacité en 3ème phase dans deux essais cliniques pour l'approbation du médicament. Cependant, ce schéma de réussites et d'échecs est similaire à d'autres facteurs de croissance des plaies dans les essais cliniques. À ce jour (2005), aucun facteur de guérison ne s'est imposé sur le marché.

L'agent de cicatrisation le plus efficace, le facteur de croissance dérivé des plaquettes ou PDGF, est vendu par Johnson & Johnson sous le nom de Regranex. Mais il n'améliore la fermeture des ulcères diabétiques que d'environ 20 %.

Des études de dosage appropriées de GHK-Cu dans diverses formulations n'ont jamais été réalisées de manière adéquate. J'ai conçu le premier essai clinique pilote en France en 1987-1988 qui utilisait une concentration de 4% de GHK-Cu dans une crème avec un minimum de conservateurs car de nombreux conservateurs courants inhibent la réparation de la peau. En raison du faible niveau de conservateur, cette crème nécessitait une réfrigération. Cette étude de 60 patients atteints d'ulcères diabétiques et de stase veineuse a mis en évidence une guérison rapide. Cette formulation apparemment réussie n'a jamais été utilisée dans des études cliniques ultérieures, qui n'ont pas atteint les objectifs thérapeutiques dans les essais de la FDA pour des utilisations cliniques.


Bernard Kalis (Université de Reims) qui, avec ses collègues, a réalisé avec succès les premiers tests de GHK sur la cicatrisation des plaies humaines.


Une étude suivante en 1990 conçue par Schering Plough Pharmaceutical a utilisé une crème similaire mais avec un ajout de 1% d'alcool benzoylique comme conservateur supplémentaire. Rétrospectivement, l'ajout d'alcool benzoylique était une erreur puisqu'il est maintenant connu que l'alcool benzoylique inhibe la fonction des fibroblastes des plaies environ 100 fois plus qu'il n'inhibe la croissance des bactéries. La crème GHK-Cu a amélioré la cicatrisation des plaies causées par la chirurgie de Moh. Cependant, il n'a pas accéléré la cicatrisation des ulcères de stase veineuse, ce qui peut être un mauvais modèle pour tester les formulations cicatrisantes car d'autres facteurs de croissance tels que PDGF, TGF, FGF et EGF n'ont pas réussi à démontrer la guérison statistique des ulcères de stase veineuse.

Néanmoins, à la suite de cela, d'autres petites études humaines ont donné des preuves de la cicatrisation des plaies. Une étude bien contrôlée publiée en 1993 sur 120 patients diabétiques dans un seul centre médical a trouvé des preuves d'une guérison accélérée des ulcères diabétiques. Une plus grande étude à double insu en 1995 n'a pas réussi à démontrer une meilleure fermeture, mais a trouvé que le GHK-Cu améliore la réépithélialisation des ulcères.

Cette étude a porté sur 505 patients dans 33 centres médicaux avec une moyenne de 17 patients par centre médical. Compte tenu de la variance des procédures de traitement dans divers centres médicaux, cela peut avoir augmenté la variance statistique et dégradé les données. Les concentrations de GHK-Cu utilisées (2,0% et 0,5%) semblent trop faibles pour une cicatrisation efficace. De plus, l'alcool benzoylique, qui était connu à l'époque pour inhiber les fibroblastes des plaies, était inexplicablement encore utilisé comme conservateur.

En raison de la dégradation rapide du GHK-Cu, les doses doivent être comprises entre 4 et 10 % et il est préférable d'appliquer le GHK-Cu dans une crème non ionique qui libère lentement le GHK-Cu dans le tissu blessé.

Exemple - Guérison de la dermatite pré-ulcéreuse

L'une des meilleures utilisations des SRCP serait la guérison de la dermatite pré-ulcéreuse avant que la peau endommagée ne développe des plaies ouvertes. Les photographies à gauche sont un exemple de guérison de la peau « à risque » avec une dermatite pré-ulcéreuse. Sur la photo du haut, le patient a deux ulcères cutanés ouverts visibles en haut et en bas à gauche de la photo. Sur la droite de la photo, il y a des fissures rougeâtres se développant en ulcères cutanés. Sur la photo du bas, l'application d'une crème peptidique de cuivre à la périphérie des ulcères cutanés a guéri la peau fissurée et empêché le développement d'ulcères. Il convient de souligner que cette crème peptidique de cuivre particulière a été conçue spécifiquement pour les peaux "à risque" au stade de la dermatite pré-ulcéreuse afin d'aider à prévenir une nouvelle dégradation de la peau. Il n'a pas été approuvé pour le traitement des ulcères cutanés ouverts.


Exemple - Guérison des ulcères cutanés diabétiques

Les personnes atteintes de diabète ont souvent une réparation cutanée lente et inadéquate. Les complications cutanées du diabète entraînent une peau sèche, qui a tendance à se fissurer et à cicatriser lentement. Les plaies aux jambes et aux pieds sont la principale cause d'amputation de la partie inférieure de la jambe et actuellement, environ 10 % des patients diabétiques ont besoin d'une amputation au cours de leur vie. La principale raison de l'amputation est les infections associées au développement d'une peau cassée et ulcérée. Les personnes atteintes de diabète courent 15 fois le risque moyen de subir une amputation d'un membre.

Les crèmes SRCP produisent souvent une amélioration rapide de la santé de la peau et aident à prévenir le développement de crevasses et de fissures dans la peau qui peuvent se transformer en ulcères cutanés. La guérison rapide de la peau cassée et craquelée, avant qu'une infection ne s'installe, est très importante.

Souvent, les lésions cutanées chez les patients diabétiques sont relativement faciles à guérir. Le meilleur moyen est de pré-laver la peau affectée avec du peroxyde d'hydrogène à 3% suivi de l'application de crèmes contenant des SRCP. Sur la photo de gauche, une femme diabétique avait six ulcères cutanés au pied et les médecins recommandaient l'amputation immédiate. Au lieu de cela, elle a essayé les lavages au peroxyde d'hydrogène suivis de l'application du peptide de cuivre à la périphérie des ulcères cutanés. Les photographies de gauche sont de chaque côté du pied avant cette procédure et celles de droite après 28 jours de peroxyde d'hydrogène et de crème peptidique de cuivre. Après 28 jours, tous les ulcères cutanés étaient guéris. Les ulcères ne se sont jamais reproduits et elle n'a utilisé un produit supplémentaire que lorsque sa peau est devenue excessivement irritée et craquelée.

Pour la peau craquelée, utilisez une légère couche d'un peptide de cuivre une fois par jour au besoin. Pour les ulcères cutanés, mettez le peptide de cuivre autour du bord des ulcères. Cela aide la peau à cicatriser à partir du bord extérieur des ulcères. REMARQUE : les peptides de cuivre ne sont pas approuvés par la FDA pour une utilisation dans la zone de l'ulcère.

Certains cliniciens déconseillent l'utilisation de peroxyde d'hydrogène sur une peau endommagée et déclarent qu'il augmente les dommages cutanés. Cependant, mes revues de la littérature médicale des 70 dernières années ont trouvé de nombreux rapports d'amélioration de la cicatrisation de la peau après des lavages de peroxyde d'hydrogène à de faibles concentrations (1% à 10%). Cependant, des lésions cutanées sont parfois observées à une concentration plus élevée de peroxyde d'hydrogène. Ainsi, toute utilisation de peroxyde d'hydrogène sur une peau endommagée doit utiliser des concentrations de 1% à 3% et pas plus.


Dosages cliniques du GHK-Cu et pharmacocinétique de la dégradation rapide in vivo

Alors que les actions biologiques du GHK et du GHK-Cu commencent à 10exp (-12) M et culminent à environ 10exp (-8) M, les études cliniques ont utilisé des dosages bien plus élevés. Il peut y avoir des explications à cette divergence. Lorsque des crèmes contenant du GHK-Cu sont appliquées sur des plaies ou une peau intacte, les niveaux d'absorption sont très faibles - allant de 0,05 à 0,15%. Alternativement, lorsque le GHK-Cu est injecté par voie intradermique ou dans un bord de plaie. GHK est rapidement éliminé de la zone avec une élimination de plus de 95% en 1 minute. Chez la souris, il a une demi-vie d'environ 20 minutes lorsqu'il est injecté par voie intrapéritonéale. Il est rapidement décomposé en glycine libre et en lysyl-histidine, qui sont rapidement excrétés. (Détermination simultanée de la glycyl-L-histidyl-L-lysine et de son métabolite, la L-histidyl-L-lysine, dans le plasma de rat par chromatographie liquide haute performance avec dérivatisation post-colonne, Endo T Miyagi M Ujiie A (Kissei Pharmaceutical Co ., Ltd., Minamiazumi, Nagano, Japon) J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 avril 25692 (1):37-42)

Amélioration de la cicatrisation systémique des plaies avec GHK-Cu

Le GHK-Cu peut être utilisé pour améliorer la réparation systémique des plaies chez un animal. Chez des lapins de 2,5 kilogrammes, H. Paul Ehrlich a découvert que l'injection de 1 milligramme de GHK-Cu (formulé dans un rapport de 2 molécules de peptide pour une molécule de cuivre) dans le tissu musculaire stimulait nettement la cicatrisation dans les zones éloignées du site d'injection et augmentait la concentration des macrophages circulants de la plaie. Si cette technique était utilisée chez l'homme, l'injection d'une très faible quantité de GHK-Cu (environ 30 milligrammes) avant une intervention chirurgicale accélérerait la réparation tissulaire. La quantité de cuivre contenue dans 30 milligrammes de GHK-Cu correspond à environ l'AJR quotidien.

Une telle technique serait d'une grande valeur dans les opérations difficiles telles que la chirurgie de transplantation de la hanche chez les personnes âgées et dans les opérations chez les patients immunodéprimés. Des expériences avec des rats immunodéprimés par H. Paul Ehrlich ont montré que le GHK-Cu normalisait la réparation des plaies dans de telles situations.

Greffe de peau et de cheveux

Le GHK-Cu a amélioré les greffes de greffes de peau chez les porcs, les souris et les humains. Pour les greffes de peau de porc, les meilleurs résultats ont été obtenus en utilisant du GHK-Cu dissous dans une petite quantité de DMSO (diméthylsulfoxyde). Normalement, dans les greffes de peau, la majeure partie de la peau greffée meurt et une nouvelle peau pousse vers l'extérieur à partir du noyau survivant de la greffe de peau. Cependant, l'ajout de DMSO a souvent tellement amélioré la « prise » du greffon que la zone de « prise » finale du greffon dépassait la taille réelle du greffon cutané.

Étudier Résultat Référence
Brevets américains décrivant des méthodes utilisant le GHK-Cu pour stimuler la cicatrisation des plaies et des méthodes pour améliorer la cicatrisation des plaies chez un animal Brevet US 4 665 054 Nouveaux dérivés de cuivre glycyl-L-histidyl-L-lysine d'une résistance améliorée aux enzymes protéolytiques et d'une meilleure solubilité dans les graisses pour une utilisation dans l'inhibition de la production de thromboxane et l'amélioration de la cicatrisation des plaies. Brevet américain Pickart 4 760 051 Les compositions contenant du cuivre glycyl-1-histidyl-1-lysine (II) améliorent le processus de cicatrisation des plaies sans provoquer de réponse antigénique Brevet américain Pickart 4 810 693 Les complexes de cuivre glycyl-L-histidyl-L-lysine améliorent la cicatrisation des plaies et plaies. Pickart Brevet US 4 877 770 Nouveaux composés complexes de cuivre d'ester de glycyl-histidyl-lysine avec une activité anti-inflammatoire et superoxyde dismutase utile pour améliorer la cicatrisation des plaies
Pickart Brevet US 4 937 230 Méthode de cicatrisation des plaies chez les chevaux utilisant un complexe de cuivre de Glycyl-L-Histidyl-L-lysine ou des dérivés sur la zone touchée. Pickart Brevet US 5 164 367 Compositions pour accélérer la cicatrisation des plaies chez les mammifères contenant du sel cuivrique ou des complexes avec un acide aminé ou un peptide
Cicatrisation des plaies chez le rat Accélération de la cicatrisation des plaies à l'aide de glycyl-histidyl-lysine cuivre (II) Downey, Larrabee, Voci et Pickart (Virginia Mason Research Center) Surg. Forum 573-575, 1985
Cicatrisation des plaies du rat Chimioattraction des cellules endothéliales capillaires Actions antioxydantes Le GHK-Cu a été testé sur la cicatrisation des plaies du rat, la chimioattraction des cellules capillaires et l'activité de type superoxyde dismutase. Le GHK-Cu a accéléré la cicatrisation des plaies du rat et a agi comme chimiotactique pour les cellules endothéliales capillaires à 10exp (-12) M. Le GHK-Cu possède également une activité significative de type superoxyde dismutase. Cuivre Gly-l-his-l-lys (II) - Un facteur de croissance humain avec des activités de type superoxyde dismutase et cicatrisante Pickart, Downey, Lovejoy et Weinstein (Université de Washington) In: Superoxide and Superoxide Dismutase (Elsevier, 1986) pp.555-558
Cicatrisation et greffe de peau chez la souris GHK-Cu a été testé par injection pour améliorer la cicatrisation des plaies chirurgicales et la prise de greffes de peau GHK-Cu a accéléré la cicatrisation des plaies chirurgicales et améliore la prise de greffes de peau Iamin : Un facteur de croissance humain avec de multiples propriétés cicatrisantes Pickart In : Biology of Copper Complexes Plenum Press 1987, pp.273-282
Guérison des blessures chez la souris Le GHK-Cu a été testé pour améliorer la fermeture des plaies chirurgicales Le GHK-Cu a accéléré la cicatrisation des plaies chirurgicales chez la souris Activité biologique du facteur de croissance de liaison au cuivre plasmatique humain glycyl-L-histidyl-L-lysine. Méthodes Pickart et Lovejoy Enzymol 1987147:314-28
Guérison des plaies chez les porcs Périphérie de la plaie injectée avec 50 microgrammes de GHK-Cu dans 1% de DMSO. Les plaies témoins n'ont reçu que 1 % de DMSO. 17 jours après la blessure, le GHK-Cu a accéléré la cicatrisation et a induit un modèle "en étoile" de forte contraction de la plaie. Pickart, 1984, non publié
Guérison des plaies chez les porcs La cicatrisation des biopsies à l'emporte-pièce chez les porcs a été déterminée. GHK-Cu a stimulé de manière marquée la cicatrisation des plaies et la synthèse de collagène. L'effet est très localisé à la zone immédiate de la peau qui est traitée Counts, D, Hill E, Turner-Beatty M, Grotewiel M, Fosha-Thomas S, Pickart L. Effet de laminage sur la cicatrisation des plaies en pleine épaisseur. Fed Am Soc Exp Biol 1992 A1636
Guérison des pattes chez le chien Testé GHK-Cu sur la cicatrisation des pattes chez le chien. Le complexe tripeptide-cuivre a amélioré la cicatrisation des plaies des coussinets chez 12 pointeurs anglais matures. La production de collagène était significativement plus élevée dans les tampons traités. La guérison était meilleure avec un léger bandage. Les bandages humides ont annulé l'effet tripeptide-Cu.
Les plaies chirurgicales du chien Effet du GHK-Cu et du GHKF-Cu sur la cicatrisation des plaies chirurgicales chez le chien. Le GHK-Cu et le GHKF-Cu ont augmenté la fermeture et la contraction de la plaie et augmentent considérablement la production de tissu de granulation.
Humain - Ulcères de stase veineuse réfractaire et ulcères diabétiques L'effet de la crème non ionique GHK-Cu avec un minimum de conservateur a été testé sur 60 patients. La crème GHK-Cu a accéléré la réépithélialisation de la plaie Effets du tripeptide glycyl-l-histidyl-l-lysine cuivre(II) sur la cicatrisation. Corrélations cliniques et biochimiques. Aupaix, Maquart, Salagnac, Pickart, Gillery, Borel et Kalis J Invest Derm 94:390, 1990
Humain - Plaies chirurgicales aiguës Crème GHK-Cu testée avec de l'alcool benzoylique comme conservateur sur la cicatrisation après la chirurgie de Moh. GHK-Cu a augmenté la cicatrisation des plaies et la réépithélialisation de la peau Fish S, Katz I, Hien NR, Briden ME, Johnson JA, Patt, L, Évaluation du complexe de cuivre glycyl-1-histidyl-1-lysine dans la cicatrisation aiguë. Blessures 1991, 3:171-177
Guérison chez les rats immunodéprimés Stimulation de la cicatrisation cutanée chez des rats immunodéprimés H. P. Ehrlich (Harvard Medical School, Boston, USA) Présenté au Symposium sur le collagène et la réparation cutanée Reims, France 12-13 septembre 1991
Humain - Ulcères cutanés diabétiques Massey P, Patt L, D'Aoust JC, Les effets du chélate de cuivre glycyl-l-histidyl-l-lysine sur la guérison des ulcères diabétiques, Blessures 4:21-28, 1992
Humain - Ulcères cutanés diabétiques Crème GHK-Cu testée sur la cicatrisation des ulcères cutanés GHK-Cu augmente la réépithélialisation des ulcères cutanés Les effets combinés du cuivre glycyl-l-histidyl-l-lysine (II) et Cell-Tak sur la cicatrisation des plaies d'incision linéaire. Schmidt SP, Resser JR, Sims RL, Mullins DL et Smith DJ (Université d'Akron, Ohio, États-Unis) Blessures 6, 62-67, 1994
Cicatrisation des plaies et production de fibroblastes de collagène chez le cobaye Les effets du GHK-Cu et de trois analogues synthétiques sur la cicatrisation de la peau dorsale du cobaye, ainsi que sur les fibroblastes en culture, ont été examinés. L'hydroxyproline, les protéines, l'ADN et l'amine oxydase sensibles au semicarbazide, avec une forte affinité pour la benzylamine, ont été mesurés, et l'histologie des plaies a été observée après coloration à l'hématoxyline/éosine.GHK-Cu et les analogues ont provoqué une diminution de l'activité de amine oxydase sensible au semicarbazide, avec une affinité élevée pour la benzylamine, 4 à 8 jours après la chirurgie, suivie d'une augmentation au jour 11 plus élevée que dans le groupe témoin. Une réorganisation plus lente de la peau et une activation retardée des fibroblastes sont observées avec ces complexes peptides-Cu. Les peptides ont un effet direct sur les fibroblastes. Les produits à une concentration de 10exp (-7) M, ont diminué la reproduction cellulaire et augmenté l'expression du collagène. Effet des complexes tripeptide-cuivre sur le processus de cicatrisation des plaies cutanées et sur les fibroblastes en culture. Buffoni, Pino et Dal Pozzo (Département de pharmacologie, Université de Florence, Firenze, Italie) Arch Int Pharmacodyn Ther 1995 330(3):345-60
Souris L'utilisation de peptides de cuivre résistants à la dégradation pour stimuler la réparation de la peau et la cicatrisation des plaies Brevet US 5 382 431 Compositions protectrices et régénératrices des tissus Pickart
Réparation de la peau humaine Dermatite de contact au nickel in vivo : modèle humain pour la thérapeutique topique. Zhai, Chang, Singh et Maibach (Université de Californie, San Francisco, États-Unis) Contact Dermatitis Vol. 40, p. 205-208, 1999
Réparation de la peau humaine Modèle de peau dénudée pour prédire le potentiel d'irritation des agents topiques in vivo chez l'homme. Zhai, Poblete et Maibach (Université de Californie, San Francisco, États-Unis) International Journal of Dermatology, Volume 37, pages 386-389, 1998
Réparation de la peau humaine Peau endommagée par le laurylsulfate de sodium in vivo chez l'homme : un modèle de réparation de la barrière d'eau. Zhai, Leow et Maibach (Université de Californie, San Francisco, États-Unis) Skin Research and Technology, Volume 4, pages 24-27, 1998
Réparation de la peau humaine Récupération de la barrière humaine après perturbation aiguë de l'acétone : un modèle de dermatite irritante. Zhai, Leow et Maibach (University of California, San Francisco, USA) Clinical and Experimental Dermatology, Volume 23, pages 11-13, 1998
Effet de GHK-Cu sur la cicatrisation des plaies ouvertes ischémiques chez le rat. Le GHK-Cu a provoqué une diminution significative de la surface de la plaie (64,5 % de GHK-Cu contre 28,2 % de contrôle) au jour 13. Le GHK-Cu a également considérablement réduit les concentrations de TNF-alpha et de MMP-2 et MMP-9.

Canapp SO Jr, Farese JP, Schultz GS, Gowda S, Ishak A.M, Swaim SF, Vangilder J, Lee-Ambrose L, Martin FG, L'effet du complexe topique tripeptide-cuivre sur la guérison des plaies ischémiques ouvertes, Vet Surg. 2003 nov.-déc.32(6):515-23
Réparation dermique de la peau du rat La biotine a été attachée à GHK puis liée à des films de collagène. Cela a entraîné une contraction accrue de la plaie, une prolifération cellulaire accrue et une expression élevée de l'antioxydant superoxyde dismutase. Les niveaux de cuivre dans les tissus ont été multipliés par 9. Arul V, Gopinath D, Gomathi K, Jayakumar R. Le peptide GHK biotinylé a incorporé une matrice collagène : un nouveau biomatériau pour la cicatrisation des plaies cutanées chez le rat. Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2005 Mai73(2) :383-91
Comparez les crèmes GHK-Cu et à l'oxyde de zinc pour la cicatrisation des plaies La zone de plaie non cicatrisée était plus petite et la contraction de la plaie était plus élevée dans le groupe GHK-Cu que dans le groupe oxyde de zinc et le groupe témoin. Le temps médian pour la couverture du lit de la plaie avec du tissu de granulation était significativement plus court dans le groupe GHK-Cu que dans les autres groupes. Le remplissage de la plaie ouverte avec du tissu de granulation jusqu'au niveau de la peau était significativement plus lent dans le groupe témoin que dans les deux autres groupes. La néovascularisation a été mieux observée dans le groupe GHK-Cu. Les auteurs suggèrent que le GHK-Cu est un meilleur choix dans les protocoles de traitement des plaies ouvertes que l'oxyde de zinc.
Le peptide GHK biotinylé (BioGHK) incorporant un biomatériau de collagène (PIC) a été testé pour la cicatrisation des plaies chez des rats diabétiques. Chez les rats diabétiques traités avec du collagène BioGHK, la guérison a été accélérée avec un taux accru de contraction de la plaie. Les niveaux de glutathion (GSH) et d'acide ascorbique dans la peau des rats diabétiques induits par la streptozotocine étaient plus élevés dans le groupe PIC par rapport aux groupes témoins (non traités) et au collagène (collagène film--CF). L'activité de la superoxyde dismutase (SOD) et de la catalase (CAT) était altérée dans tous les groupes. Des études de culture de cellules de fibroblastes suggèrent que le PIC favorise la croissance des fibroblastes, a révélé une épithélialisation, une synthèse accrue de collagène et l'activation des fibroblastes et des mastocytes dans le groupe PIC. Le collagène incorporé au BioGHK peut être une approche pour améliorer la cicatrisation des plaies diabétiques.

Photographier:
Gauche - Greffe de contrôle environ 20 % de la greffe de peau (au centre) établie - il s'agit d'une « prise » de greffe typique.
A droite - Greffe imbibée de GHK-Cu dans des liposomes. Le greffon d'origine a envahi la zone de transplantation

.

Étudier Résultat Référence
Amélioration des greffes de peau chez le porc Pickart Brevet US 4 760 051 Les compositions contenant du glycyl-1-histidyl-1-lysine cuivre(II) améliorent le processus de cicatrisation des plaies sans provoquer de réponse antigénique.
GHK-Cu testé sur des greffes de peau chez la souris Greffes de peau pleine épaisseur de 1,5 cm de diamètre transplantées chez la souris. Ceci est considéré comme une expérience de greffe « impossible » 40 % des greffes de pleine épaisseur sont devenues des greffes permanentes Pickart Iamin : Un facteur de croissance humaine avec de multiples propriétés de cicatrisation. dans Biology of Copper Complexes, Clifton, NJ, 1987, pp. 273-285.
Greffes de cheveux humains .Étude de l'effet de l'analogue GHK-Cu sur les greffes de cheveux. Les patients traités ont vu de nouveaux cheveux pousser en six semaines, contre 10 à 14 semaines normalement. Dans la plupart des cas, l'encroûtement cutané après transplantation est réduit de 10 à 14 jours à cinq jours. Augmentation du degré d'excroissance des cheveux des greffes de cheveux humains Perez-Meza et al, (International Journal of Cosmetic Surgery (Vol. 6, 1998, pp 80-84)
Greffes de cheveux humains 30 patients ayant subi une greffe de cheveux ont découvert que l'analogue du GHK-Cu réduisait la chute des cheveux greffés de 30 pour cent avec une solution saline à 10 pour cent. Le temps de cicatrisation des greffons transplantés a été réduit de moitié.La repousse de nouveaux cheveux à partir des greffes s'est produite en six à huit semaines avec une solution saline et en quatre à six semaines avec l'analogue GHK-CU. La satisfaction des patients après la transplantation est passée de 80 à 95 %. Hitzig, G. Amélioration de la guérison et de la croissance de la greffe de cheveux à l'aide de peptides de cuivre, Cosmetic Dermatol 2000 (juin) 13, 18-21

GHK a été isolé à l'origine par ses actions sur l'augmentation de la survie des cultures d'organes de foie de rat. Le GHK augmente également la réparation des dommages au foie chez le rat.

Le GHK-Cu a été testé pour la cicatrisation du tissu osseux

Croissance des chondrocytes osseux

L'effet du GHK-Cu sur la stimulation de la nouvelle production osseuse chez le cobaye a été étudié. Les auteurs ont préparé des gels de collagène à 7,5% et 12,5%, complétés par le tripeptide GHK-Cu, de la perfloxacine et du glycosaminoglycane hypersulfaté (HSGAG).

Le GHK-Cu stimule la cicatrisation osseuse chez les animaux et les fonctions des cellules réparatrices osseuses en culture. Le développement du GHK-Cu à usage clinique est mené sous la direction du Prof. Milan Adam (Université de Prague, Photographie - à gauche) . Adam a développé un copolymère de collagène-greffe-glycosaminoglycane complété par du GHK-Cu pour la cicatrisation osseuse.


Actions anti-inflammatoires : Tissu endommagé

Les actions antioxydantes du GHK et du GHK-Cu qui aident à protéger les tissus lésés semblent avoir de multiples actions. Ce sont (1) un anti-inflammatoire direct du complexe cuivre-peptide, (2) une activité qui bloque la libération de fer libre des molécules de ferritine, (3) une capacité à bloquer les dommages tissulaires causés par l'interleukine-1 à un GHK -Concentration en Cu d'environ 10exp(-10) M, et (4) une capacité à bloquer l'oxydation des lipoprotéines de basse densité (LDL) par le cuivre libre.

Actions Anti-Oxydantes

Les réactions entre les ions nickel et le GHK et des oligopeptides similaires ont été caractérisées par des expériences de piégeage de spin.

GHK-Cu possédait des activités de type superoxyde dismutase et catalase.

Beretta G, Artali R, Regazzoni L, Panigati M, Facino RM, Glycyl-histidyl-lysine (GHK) est un extincteur d'alpha,beta-4-hydroxy-trans-2-nonenal : une comparaison avec la carnosine. aperçu du mécanisme de réaction par spectrométrie de masse à ionisation électrospray, RMN 1H et techniques de calcul.
Chem Res Toxicol. 2007 septembre 20(9) : 1309-14.

Beretta G, Arlandini E, Artali R, Anton JM, Maffei Facino R.

Capacité de séquestration de l'acroléine du tripeptide endogène glycyl-histidyl-lysine (GHK) : Caractérisation des produits de conjugaison par ESI-MS(n) et calculs théoriques.
J Pharm Biomed Anal. 2008 juil. 1547(3) : 596-602.

Actions anti-inflammatoires : générales

Actions anti-oxydantes et anti-inflammatoires du GHK et du GHK-Cu

Le GHK et le GHK-Cu peuvent fonctionner comme les anti-inflammatoires non stéroïdiens humains (AINS) circulants. Dans le plasma humain, il y a environ 200 nanogrammes par millilitre de GHK et de GHK-Cu à 20 ans. Cela tombe à environ 80 nanogrammes par millilitre à 60 ans, mais ces niveaux sont très variables. Compte tenu des constantes de liaison respectives pour le cuivre(+2) entre la GHK et l'albumine dans le plasma humain, il est probable que seulement environ 10 % de la GHK circulante soit chélatée avec du cuivre(+2). Dans les zones de lésions tissulaires, ce rapport pourrait être plus élevé en raison de concentrations d'albumine plus faibles. Il existe des similitudes très étroites entre les structures chimiques tridimensionnelles des antagonistes des récepteurs GHK-Cu et H2 utilisés comme médicaments anti-ulcéreux tels que la cimétidine, la ranitidine, la famotidine et la nizatidine. Étant donné que le GHK-Cu est un composant normal de la salive présent à environ 40 nanogrammes/millilitre, il peut fonctionner comme un protecteur naturel des muqueuses gastro-intestinales. En outre, les médicaments anti-ulcéreux les plus courants sont de puissants liants du cuivre ionique (II). Il existe également des similitudes, bien que moins évidentes, entre la plupart des médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (NAISD) et le GHK. Pratiquement tous les AINS se lient avidement au cuivre(+2).

Étudier Résultat Référence
Développement d'analogues protecteurs tissulaires du GHK-Cu Le GHK-Cu et ses analogues ont été testés pour leurs propriétés antioxydantes et protectrices des tissus. Le GHK-Cu et ses analogues se sont avérés améliorer ou restaurer la résistance aux dommages oxydatifs ou inflammatoires. Certains analogues étaient 100 fois plus efficaces que le GHK-Cu. Brevet US 5 118 665 Nouveaux complexes de peptides métalliques antioxydants et anti-inflammatoires - contenant des résidus de glycine, d'histidine et de lysine utilisés pour améliorer ou restaurer la résistance aux dommages oxydatifs ou inflammatoires. Pickart
Blocage de l'oxydation du fer Une étude visant à déterminer si certaines des propriétés cicatrisantes du GHK-Cu sont dues à un effet sur le métabolisme du fer. La présence de complexes de fer dans les tissus endommagés est préjudiciable à la cicatrisation des plaies, en raison d'une inflammation locale, ainsi que d'une infection microbienne médiée par le fer. Les effets de GHK:Cu(II) sur la peroxydation lipidique catalysée par le fer. GHK:Cu(II) a inhibé la peroxydation lipidique si la source de fer était la ferritine. Alors que GHK:Cu(II) a inhibé la libération de ferritine, il n'a pas présenté d'activité significative de type superoxyde dismutase ou céruloplasmine. Il apparaît que le GHK-Cu se lie aux canaux de ferritine impliqués dans la libération de fer et empêche physiquement la libération de frais). Ainsi, un effet biologique du GHK:Cu(II), lié à la cicatrisation des plaies, pourrait être l'inhibition de la libération de ferritine dans les tissus endommagés, empêchant ainsi l'inflammation et les infections microbiennes. Effets du Cu (II) chélaté par le glycyl-histidyl-lysyle sur la peroxydation lipidique dépendante de la ferritine. Miller, DeSilva, Pickart, Aust. Pickart et Aust (Centre de biotechnologie, Utah State University, Logan, UT, États-Unis) Adv. Exp Med Biol 1990264:79-84
Découverte d'activités de type superoxyde dismutase et catalase dans les complexes GHK Nickel Chimie redox des complexes de nickel) avec certains peptides biologiquement importants en présence d'espèces oxygénées réduites. Coterie N Tremolieres E Berliner JCL Cattier JP Henichart JP (INSERM, Ill, France) J Internat BioPharm 1992 Apr46(1):7-15
Actions cytoprotectrices contre les radicaux libres d'oxygène Le GHK-Cu a inhibé de façon marquée le tissu muqueux intestinal de la peroxydation lipidique par les radicaux libres dérivés de l'oxygène. Alberghina M, Lupo G, La Spina G, Mangiameli A, Gulisano M, Sciotto D, Rizzarelli E, Effet cytoprotecteur des complexes de cuivre (II) contre les dommages induits par l'éthanol sur la muqueuse gastrique du rat, J Inorg Biochem. 1992 Mar45(4):245-59.
Protection antioxydante des cellules sécrétrices d'insuline après une blessure. L'interleukine bêta (IL-1 bêta) est libérée lors de blessures et après des lésions tissulaires. L'IL-1 inhibe la libération d'insuline par les cellules pancréatiques. L'étude a testé si le GHK-Cu bloquerait les dommages causés par l'IL-1 aux cellules pancréatiques sécrétant de l'insuline. Des cellules d'îlots pancréatiques de rat ont été incubées avec ou sans 50 U/ml d'IL-1 bêta, en présence ou en l'absence de diverses concentrations de Cu(II)-GHK ou CuSO4 (1-1000 ng/ml). Après incubation, la sécrétion d'insuline a été évaluée en présence soit de 2,8 mmol/l (sécrétion basale d'insuline) soit de 16,7 mmol/l de glucose (libération induite par le glucose). Dans les îlots témoins, la sécrétion basale d'insuline était de 92 ± 11 (pg/îlot) et la libération induite par le glucose était de 2824 ± 249. Dans les îlots pré-exposés à 50 U/ml d'IL-1 bêta, la libération basale d'insuline n'était pas significativement affectée, mais la libération d'insuline induite par le glucose était considérablement réduite (841 ± 76 ). Dans les îlots incubés avec de l'IL-1 bêta et du Cu-GHK (0,4 µmol/l, effet maximal), la sécrétion basale était de 119,0 +/- 13 et la libération induite par le glucose était de 2797 +/- 242. CuSO4 était sans action protectrice. L'ajout de cuivre prévient les effets inhibiteurs de l'interleukine 1-bêta sur les îlots pancréatiques de rat, Vinci, Caltabiano, Santoro, Rabuazzo, Buscema, Purrello, Rizzarelli, Vigneri et Purrello (Université de Catane en endocrinologie médicale, faculté de médecine de l'Université de Catane, Italie) Diabetologia 1995 38(1):39-45
Effet du GHK sur le blocage des dommages oxydatifs qui produisent la maladie d'Alzheimer Le cuivre (II) faiblement lié peut produire l'oxydation de la protéine amyloïde de la maladie d'Alzheimer et provoquer une neurodégénérescence Le cuivre (II) faiblement lié peut produire l'oxydation de la protéine amyloïde de la maladie d'Alzheimer et provoquer une neurodégénérescence La protéine précurseur amyloïde de la maladie d'Alzheimer dans la réduction du cuivre(II) en cuivre(I). Multhaup Schlicksupp Hesse Beher Ruppert Masters Beyreuther (ZMBH-Center for Molecular Biology University of Heidelberg, Allemagne) Science 1996 mars 8271 (5254): 1406-9
Augmenter la superoxyde dismutase dans les plaies La biotine a été attachée à GHK puis liée à des films de collagène. Cela a entraîné une contraction accrue de la plaie, une prolifération cellulaire accrue et une expression élevée de l'antioxydant superoxyde dismutase. Les niveaux de cuivre dans les tissus ont été multipliés par 9. Arul V, Gopinath D, Gomathi K, Jayakumar R. Le peptide GHK biotinylé a incorporé une matrice collagène : un nouveau biomatériau pour la cicatrisation des plaies cutanées chez le rat. Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2005 Mai73(2) :383-91
Le GHK détoxifie le 4-hydroxy-2-nonénal, une molécule toxique Le GHK bloque les actions toxiques du 4-hydroxy-2-nonénal (HNE), un produit de décomposition des acides gras considéré comme responsable du développement du diabète, de la néphropathie, de la rétinopathie et des maladies neurodégénératives.
Les blocs GHK bloquent la production d'acroléine L'acroléine est une toxine créée par les radicaux carbonyle des acides gras polyinsaturés. Le GHK détoxifie l'acroléine. Les auteurs suggèrent que le GHK peut être utile dans la prévention de l'athérosclérose, du diabète, de la neuropathie et de la maladie d'Alzheimer.
Similitudes entre GHK et Anti-Ulcers Pharmaceutics
Notez les 3 composants principaux -
(1) un changement de côté N-terminal,
(2) et anneau central imidazole,
(3) un groupe C-terminal - semblable à la lysine - très basique

Guérison intestinale et gastrique

Le GHK-Cu a des effets puissants sur la guérison des ulcères d'estomac et des inflammations intestinales. Une petite étude humaine a révélé un effet très positif du GHK-Cu sur la guérison des lésions intestinales chez les personnes atteintes d'une maladie intestinale inflammatoire réfractaire.

Effets du GHK-Cu sur l'acidité gastrique, la production de mucus et le développement des ulcères
(Modèle d'ulcère gastrique de Shay (éthanol à 95 %) chez le rat)
Posologie de GHK-Cu pH de l'estomac Rats présentant des ulcères gastriques visibles Production de mucus gastrique
rien 2.3 72% Inobservable
1 milligramme 3.8 33% ++
3 milligrammes 4.7 rien ++++
10 milligrammes 6.7 rien ++++

De même, GHK-Cu a produit un blocage similaire de la formation d'ulcère duodénal chez le rat (induit par la cystamine).

Guérison des ulcères intestinaux et gastriques

Le GHK-Cu a été testé pour la guérison des ulcères d'estomac expérimentaux et des dommages intestinaux chez le rat.

GHK-Cu a guéri les ulcères d'estomac expérimentaux et l'inflammation et les dommages intestinaux

Alberghina M, Lupo G, La Spina G, Mangiameli A, Gulisano M, Sciotto D, Rizzarelli E, Effet cytoprotecteur des complexes de cuivre (II) contre les dommages causés par l'éthanol à la muqueuse gastrique du rat, J Inorg Biochem. 1992 Mar45(4):245-59.

16 patients atteints d'une maladie intestinale inflammatoire réfractaire ont été traités avec des solutions administrées par voie rectale de GHK-Cu.

Après le traitement de 12 semaines, il y avait une réduction de 60% de la sévérité mesurée par endoscopie, histopathologie et symptômes

Étudier Résultat Référence
Guérison des ulcères gastriques et intestinaux Pickart Brevet US 4 767 753 Complexes de cuivre de polypeptide(s) histidyl-lysine pour réduire les sécrétions gastriques, augmenter la muqueuse gastrique et prévenir les ulcères. Brevet US 5 023 237 Utilisation d'un polypeptide ou de son complexe de cuivre pour la cytoprotection dans le traitement des ulcères intestinaux et gastriques, et pour faciliter la cicatrisation des plaies. Brevet US 5 145 838 Méthodes et compositions pour la cicatrisation des ulcères et dérivés peptidiques.
Actions cytoprotectrices contre les radicaux libres d'oxygène Le GHK-Cu a inhibé de manière marquée le tissu muqueux intestinal de la peroxydation lipidique par les radicaux libres dérivés de l'oxygène Une étude ouverte de la solution rectale PC1020 (GHK-Cu) dans le traitement de la maladie intestinale inflammatoire distale. Levine, Patt, Koren (Université de Washington) Congrès mondial de dermatologie, octobre 1994, Plus de détails présentés lors de la 25e réunion annuelle de DDW, Levien, Patt, Koren, Joslin (Université de Washington) mai 1995

Anti-douleur, anti-anxiété, confiance en soi

GHK possède des actions anti-douleur, anti-anxiété et probablement une confiance en soi accrue. De telles actions pourraient avoir surgi comme un mécanisme évolutif pour augmenter la survie d'un animal après des blessures physiques.

L'effet anti-douleur chez les rats commence à 0,5 milligrammes/kg tandis que les effets anti-anxiété commencent à 0,5 microgrammes/kg, ce qui est le niveau auquel les groupes russes et ukrainiens ont observé la cicatrisation des plaies cutanées et des os.

Bobyntsev II, Chernysheva OI, Dolgintsev ME, Smakhtin MI, Belykh AE. [Effet du peptide Gly-His-Lys et de ses analogues sur la sensibilité à la douleur chez la souris]. [Article en russe]. Eksp Klin Farmakol. 201578(1):13-5.

Application du peptide gly-his-lys pour un effet analgésique dans la douleur causée par l'irritation thermique.

Voir aussi le brevet RU 2421235.

Bobyntsev II, Chernysheva OI, Dolgintsev ME, Smakhtin, Belykh AE. Effets anxiolytiques du peptide gly-his-lys et de ses analogues. Bull Exp Biol Med 2015 avril 158: 72608.

Chernysheva O.I. 1, Bobyntsev I.I. 1, Dolgintsev M.E. LE TRIPEPTIDE GLY-HIS-LYS INFLUENCE SUR LE COMPORTEMENT DES RATS DANS LE TEST «OPEN FIELD»

Université médicale d'État de Koursk

Un entraîneur appelé Skin Biology et a déclaré que les combattants s'injectaient 1 milligramme de GHK avant les combats majeurs pour augmenter leur confiance en eux et guérir plus rapidement après le match.

Il est possible que le GHK augmente la confiance en soi. Dans certaines des expériences sur le rat, la dose efficace était de 0,5 microgrammes/kg. Si cela est recalculé pour un poids humain de 70 kg, alors 0,035 milligramme serait efficace. Ensuite, le milligramme utilisé par les combattants peut être suffisant.

Biochimie SRCP liée à la régénération tissulaire

Lorsque la cicatrisation est insuffisante, la zone cicatrisée est souvent dépourvue de capacités sensorielles.

Étudié l'effet du GHK sur la croissance nerveuse.

Gly-His-Lys a soutenu la différenciation et la viabilité des neurones de poulet dans la culture cellulaire de divers neurones - PNS d'embryon de poulet (ganglion trigeminale) et du SNC de rats embryonnaires (hippocampe) et cellules dissociées du tissu cérébral d'embryon de poulet. Les concentrations optimales de GHK pour l'excroissance des neurones étaient de 10 ng/ml. La GHK a augmenté le rapport neurones/cellules gliales en culture.

GHK et production d'énergie cellulaire

GHK a été testé pour les effets sur l'activation de la phosphoylase A.

La GHK a stimulé de manière dose-dépendante l'activité de la phosphorylase a dans des hépatocytes de rat isolés. Cet effet était associé à des augmentations à la fois de la production d'IP3 et de [Ca++]. Ces effets de Gly-His-Lys ont été antagonisés par le losartan, un antagoniste non peptidique des récepteurs de l'angiotensine II (sélectif AT1), ce qui a suggéré que ces récepteurs étaient impliqués dans son effet. Les expériences de compétition de liaison ont clairement indiqué que Gly-His-Lys interagit avec les récepteurs AT1.

Étudier Résultat Référence
Recherche dans une banque de données de source de GHK humain - Effet du GHK-Cu sur la synthèse du collagène Déterminé les sources possibles de GHK et l'effet de GHK-Cu sur la synthèse de collagène dans deux souches de fibroblastes humains et de fibroblastes pulmonaires embryonnaires. La GHK est une séquence très rare apparaissant dans seulement 8 séquences de protéines humaines en 1990. Elle apparaît trois fois dans le collagène et existe également dans plusieurs protéines inflammatoires - Toutes les lignées de fibroblastes ont stimulé la synthèse de collagène à 10exp (-12) M et au maximum à 10exp (- 9) M La glycyl-l-histidyl-l-lysine, un triplet de la chaîne a2(I) du collagène humain de type I, stimule la synthèse de collagène par les cultures de fibroblastes Maquart, Gillery, Monboisse, Pickart, Laurent et Borel Ann. N.Y. Acad. Sci. 580:573-575, 1990
Rechercher la source de GHK Études sur une protéine structurelle de la peau appelée SPARC. GHK et HGHK, deux peptides à très haute affinité de liaison au cuivre, sont angiogéniques. Ils sont générés par la dégradation de SPARC, une protéine structurelle de la peau riche en cystéine. SPARC peut fonctionner à plusieurs niveaux pour contrôler la progression des néovaisseaux. La protéolyse de SPARC par la plasmine conduit à la libération de peptides contenant la séquence Gly-His-Lys, qui sont angiogéniques in vitro et in vivo. Aux stades ultérieurs de l'angiogenèse, lorsque la prolifération des cellules endothéliales cesse, SPARC peut exercer des effets inhibiteurs sur l'angiogenèse. Régulation de l'angiogenèse par la matrice extracellulaire : la croissance et la colle. Sage et Vernon (École de médecine de l'Université de Washington, Seattle, WA, États-Unis) J Hypertens Suppl 1994 12(10):S145-52
Effet du GHK sur la chimioattraction des cellules immunitaires associées à la guérison Comparaison du GHK à des agents chimiotactiques puissants connus et à des analogues du GHK. Le GHK était le chimiotactique le plus puissant testé pour les mastocytes, mais Gly-His-Gly, His-Lys et His-Gly-Gly étaient inactifs. Stimulation de la migration des mastocytes péritonéaux de rat par des peptides dérivés de tumeurs. Poole et Zetter (Harvard Medical School) Cancer. Rés. 43, 5857-5861, 1983
Effet du GHK sur la chimioattraction des cellules immunitaires associées à la guérison Comparaison du GHK à des agents chimiotactiques puissants connus et à des analogues du GHK. Un dispositif implantable a été utilisé pour l'étude de la chimioattraction des leucocytes chez le rat jusqu'à 18 jours. Le GHK a attiré les cellules immunitaires cicatrisantes (mastocytes, macrophages, leucocytes polymorphonucléaires) à environ 10exp (-10) M. Un test in vivo pour l'activité chimiotactique. Zetter, Rasmussen et Brown (Harvard University Medical School, Boston, MA, États-Unis) Lab Invest 1985 53(3):362-8
L'héparine est ressentie comme médiateur de certains événements de guérison GHK-Cu et héparine qui est un anticoagulant naturel et un médiateur de la cicatrisation. GHK s'est avéré se lier à l'héparine dans des études de spectroscopie de résonance magnétique nucléaire. Liaison du facteur de croissance glycyl-L-histidyl-L-lysine par l'héparine. Rabenstein, Robert et Hari (Université de Californie à Riverside, USA) FEBS Lett 1995, 376, pp. 216-20
Angiogenèse dans un modèle de cornée de lapin et migration des cellules capillaires GHK-Cu testé pour l'activité angiogénique. Des complexes de cuivre de glycyl-L-histidyl-L-lysine et d'héparine ont induit l'angiogenèse chez le lapin. Les lapins déficients en cuivre ne peuvent pas induire l'angiogenèse. Céruloplasmine, ions cuivre et angiogenèse. Raju, Alessandri, Ziche et Gullino (Institut national du cancer, Bethesda, MD, États-Unis) J Natl Cancer Inst 1982 69(5):1183-8
Angiogenèse dans un modèle de cornée de lapin et migration des cellules capillaires GHK-Cu testé pour l'activité angiogénique et l'effet sur la migration des cellules capillaires. Augmentation de l'angiogenèse dans le modèle de cornée de lapin - Augmentation de 8 fois la migration in vitro des cellules capillaires Caractérisation d'un chimiotactique de l'endothélium induit par les effecteurs de l'angiogenèse. Raju, Alessandri, Gullino (Institut national du cancer, Bethesda, MD, États-Unis) Cancer Res. 44:1579-1584, 1984
Croissance nerveuse - commentaire
Croissance nerveuse Étudié l'effet du GHK sur la croissance nerveuse. Gly-His-Lys a soutenu la différenciation et la viabilité des neurones de poulet en culture cellulaire et a augmenté l'excroissance nerveuse. Les concentrations optimales de GHK pour la fonction neuronale étaient de 100 à 400 ng/ml. Effets du tripeptide synthétique sur la différenciation des cellules nerveuses de l'hémisphère cérébral dissociées en culture. Sensenbrenner Jaros Moonen, Mandel (Université de Strausbourg, France) Neurobiologie 1975 5(4):207-13
Croissance nerveuse Uber die Wirkung eines synthetischen Tripeptids auf in vitro kultiviertes Nervengewebe (L'effet d'un tissu nerveux tripeptide synthétique cultivé in vitro), Lindner, Grosse, Halle et Henklein (Université Karl Marx, Berlin, Allemagne) Z Mikrosk Anat Forsch 197993(5) : 820-8
Croissance nerveuse Les nerfs sectionnés sont placés dans un tube de collagène imprégné de GHK. Cela a provoqué une augmentation de la production de Nerve Growth Factor et des neurotrophines NT-3 et NT-4 Ahmed MR, Basha SH, Gopinath D, Muthusamy J, Jayakumar RJ, Régulation positive initiale des facteurs de croissance et des médiateurs inflammatoires pendant la régénération nerveuse en présence de tubes de collagène incorporés dans des peptides adhésifs cellulaires, J Peripher Nerv Syst. 2005, 10:17-30
GHK a été testé pour maintenir la viabilité des fibroblastes dans un milieu sans sérum Les fibroblastes de poussin ont été maintenus dans un milieu sans sérum après l'ajout de GHK.Le milieu de culture contenant du GHK a permis d'étudier les facteurs affectant le métabolisme du collagène sans les complications des protéines du sérum. Un modèle in vitro de fibroblasie - Quantification simultanée de la prolifération, de la migration et de la synthèse du collagène des fibroblastes. Graham, Diegelmann et Cohen (Medical College of Virginia, Richmond, VA, États-Unis) Proc Soc Exp Bio Med 176, 302-308, 1984
Synthèse de collagène dans les fibroblastes cultivés L'effet de GHK-Cu a été déterminé. GHK-Cu a stimulé la synthèse de collagène dans les fibroblastes en culture. La stimulation a commencé entre 10exp (-12) et 10exp (-11) M, maximisée à 10exp (-9) M, et était indépendante de tout changement dans le nombre de cellules. La présence d'un triplet GHK dans la chaîne alpha 2(I) du collagène de type I suggère que le tripeptide pourrait être libéré par des protéases au site d'une plaie et exercer des effets cicatrisants in situ. Stimulation de la synthèse de collagène dans les cultures de fibroblastes par le complexe tripeptide-cuivre glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+. Maquart, Pickart, Laurent, Gillery, Monboisse et Borel (Laboratoire de Biochimie, CNRS URA 84, Faculté de Médecine, Reims, France. FEBS Lett 1988, 238(2):343-6
Synthèse de collagène dans les fibroblastes cultivés L'effet de GHK-Cu sur la production de collagène a été déterminé. GHK-Cu a augmenté la synthèse de collagène à 10exp (-9) M Exigence de la formation d'un complexe de cuivre et de tripeptide glycyl-L-histidyl-L-lysine pour l'activité de synthèse du collagène dans les fibroblastes dermiques humains normaux. Oddos, T, Jumeau-Lafond, A Johnson & Johnson, Val de Reuil, France, Ries, G, Johnson & Johnson, Düsseldorf, Allemagne Résumé P72, American Academy of Dermatology Meeting, février 2002
Synthèse des glycosaminoglycanes sulfatés (protéines qui retiennent l'eau) dans les fibroblastes en culture. L'effet de GHK-Cu sur la synthèse de glycosaminoglycane sulfaté (protéines de rétention d'eau) dans des fibroblastes en culture a été déterminé. Le GHK-Cu a induit une augmentation dose-dépendante de la synthèse des GAG totaux sécrétés dans le milieu de culture et ceux associés à la couche cellulaire. L'effet de GHK-Cu augmentait avec le dosage et était optimal à 10exp (-9) à 10exp (-8) M. Des concentrations plus élevées avaient moins d'effet sur la vitesse de synthèse. GHK-Cu a stimulé préférentiellement la synthèse de sulfate de dermatane extracellulaire et de sulfate d'héparine associé à la couche cellulaire. Stimulation des glycosaminoglycanes sulfatés par le complexe de cuivre tripeptide glycyl-l-histidyl-l-lysine cuivre(II). Wegrowski, Maquart, Borel (Université de Reims, France) Life Sci. 51, 1049-1056, 1992
Les effets du GHK-Cu sur la synthèse des glycosaminoglycanes et des petits protéoglycanes majeurs ont été déterminés. Une étude des effets du GHK-Cu in vivo, en utilisant le modèle de chambre de plaie. Des cylindres en treillis métallique en acier inoxydable ont été implantés par voie sous-cutanée sur le dos des rats. Les fibroblastes cultivés traités au GHK-Cu et les chambres des plaies des rats présentaient une augmentation de l'ARN messager pour la décorine par rapport au biglycane. Dans les deux systèmes, le GHK-Cu a augmenté la synthèse de décorine, de dermatine sulfate et de chondroïtine sulfate. Expression des glycosaminoglycanes et des petits protéoglycanes dans les plaies : modulation par le complexe tripeptide cuivre glycyl-histidyl-lysine Cu(II). Simeon, Wegrowski, Bontemps et Maquart J Invest Dermatol 2000 Dec115(6):962-968
Les événements de cicatrisation des plaies dans les « chambres des plaies » ont été étudiés chez le rat Une étude des effets du GHK-Cu in vivo, en utilisant le modèle de chambre de blessure du rat. Les plaies de rat traitées au GHK-Cu présentaient une augmentation dépendante de la concentration du poids sec, de l'ADN, des protéines totales, du collagène et du glycosaminoglycane. La stimulation de la synthèse du collagène était deux fois celle des protéines non collagènes. Les ARNm de collagène de type I et de type III ont augmenté. Une augmentation de la quantité relative de sulfate de dermatane a également été trouvée. Stimulation in vivo de l'accumulation de tissu conjonctif par le complexe tripeptide-cuivre glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+ dans des plaies expérimentales chez le rat. Maquart, Bellon, Chaqour, Wegrowski, Monboisse, Chastang, Birembaut et Gillery (Université de Reims, France) J Clin Invest 92 : 2368-76, 1993
Métalloprotéinases qui éliminent les protéines endommagées et le tissu cicatriciel Les métalloprotéinases sont une famille de protéines qui éliminent les protéines endommagées et le tissu cicatriciel. L'expression et l'activation des métalloprotéinases matricielles ont été étudiées dans un modèle de plaies expérimentales chez le rat, et leur modulation par GHK-Cu. Des chambres de plaies ont été insérées sous la peau de rats et ont reçu quotidiennement des injections soit de 2 mg de GHK-Cu soit du même volume de solution saline. Le liquide de la plaie et le tissu conjonctif néosynthétisé déposés dans les chambres ont été collectés et analysés pour l'expression et/ou l'activité de la métalloprotéinase matricielle. La collagénase interstitielle a augmenté dans le liquide de la plaie tout au long de l'expérience et la GHK-Cu n'a pas modifié son activité. La métalloprotéinase matricielle-9 (gélatinase B) et la métalloprotéinase matricielle-2 (gélatinase A) étaient les deux principales activités gélatinolytiques exprimées au cours du processus de cicatrisation. La pro-matrice métalloprotéinase-9 a été fortement exprimée au cours des premiers stades de la cicatrisation (jour 3) mais a diminué rapidement alors que dans les chambres traitées par GHK-Cu, elle a persisté jusqu'au jour 22. La pro-matrice métalloprotéinase-2 a augmenté progressivement jusqu'au jour 7, puis a diminué jusqu'au jour 18. La métalloprotéinase-2 matricielle activée a augmenté jusqu'au jour 12, puis a diminué progressivement tandis que GHK-Cu a augmenté la métalloprotéinase-2 pro-matrice et la métalloprotéinase-2 matricielle activée au cours des derniers stades de la cicatrisation. Le GHK-Cu a augmenté l'activité des métalloprotéinases jusqu'à 4 fois, ce qui peut augmenter l'activité des processus de remodelage de la plaie qui éliminent les protéines endommagées et le tissu cicatriciel. Expression et activation de métalloprotéinases matricielles dans les plaies : modulation par le complexe tripeptide-cuivre glycyl-L-histidyl-L-lysine-Cu2+, Simeon Monier Emonard Gillery Birembaut, Hornebeck et Maquart (Faculté de Médecine, Reims, France) J Invest Dermatol 1999 112(6) :957-64
Métalloprotéinases et antiprotéinases - commentaire La GHK-Cu augmente la MMP-2 dans les fibroblastes cultivés mais dans les plaies du rat, elle diminue la MMP-2 et la MMP-9. GHK-Cu augmente également les inhibiteurs des métalloprotéinases TIMP-1 et TIMP-2 dans les fibroblastes en culture. Les actions globales semblent réduire la protéolyse mais la maintiennent peut-être à un niveau inférieur à celui des plaies à un stade précoce.
Métalloprotéinases et antiprotéinases qui remodèlent les tissus L'effet de GHK-Cu sur l'induction de métalloprotéinases dans les fibroblastes de plaies en culture. GHK-Cu à 10exp(-10) M a augmenté l'ARNm de MMP-2 ainsi que les inhibiteurs des métalloprotéinases TIMP-1 et TIMP-2. Les auteurs soutiennent que cela indique que GHK-Cu module le remodelage tissulaire. Le complexe tripeptide-cuivre GHK-Cu stimule l'expression des métalloprotéinases matricielles 2 par des cultures de fibroblastes. Siméon, Emonard, Hornebeck & Maquart Laboratoire de Biochimie-UPRESA CNRS 6021, Faculté de Médecine, Reims, France. Sciences de la vie 2000 sept. 2267(18):2257-65
Métalloprotéinases et antiprotéinases qui remodèlent les tissus Le GHK-Cu a provoqué une diminution significative de la surface de la plaie (64,5 % de GHK-Cu contre 28,2 % de contrôle) au jour 13. Le GHK-Cu a également considérablement réduit les concentrations de TNF-alpha et de MMP-2 et MMP-9. Canapp SO Jr, Farese JP, Schultz GS, Gowda S, Ishak A.M, Swaim SF, Vangilder J, Lee-Ambrose L, Martin FG, L'effet du complexe topique tripeptide-cuivre sur la guérison des plaies ischémiques ouvertes, Vet Surg. 2003 nov.-déc.32(6):515-23
La glycyl-histidyl-lysine interagit avec le récepteur AT1 de l'angiotensine II. juge Garcia-Sainz, juge Olivares-Reyes. Departamento de Bioenergetica, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Mexique D. F. Peptides 199516(7):1203-7
Examen de la régénération tissulaire au peptide de cuivre - Année 2000 Aperçu des résultats biologiques et cliniques. Lien vers le résumé du discours Prague, République tchèque, 19 mai 2000
GHK est une matrikine qui stimule le remodelage tissulaire Le terme « matrikine » a été proposé pour désigner de tels peptides dérivés de l'ECM capables de réguler l'activité cellulaire. Le GHK est une matrikine et un puissant activateur de la synthèse et du remodelage de l'ECM Régulation de l'activité cellulaire par la matrice extracellulaire : le concept de matrikines. Maquart FX Simeon A Pasco S Monboisse JC. J Soc Biol 1999193(4-5):423-8
GHK-Cu et réduction de la formation de cicatrices chéloïdes Le GHK-Cu a été testé pour ses effets sur la production de l'hormone productrice de chéloïdes TGF-beta1 par des fibroblastes normaux et producteurs de chéloïdes. GHK-Cu, à 10exp (-9) M a réduit la production de TGF-beta1 dans les fibroblastes normaux et producteurs de chéloïdes. En revanche, l'acide rétinoïque (Retin-A, Tretinoin) augmente la production de cicatrice produisant du TGF-beta1 dans ces lignées. L'effet du tripeptide de cuivre et de la trétinoïne sur la production de facteur de croissance dans un modèle de fibroblaste sans sérum. McCormack, M., Nowak KC, Koch, J. Arch Facial Plast Surg 2001 3: 28-32
Examen de la régénération tissulaire du peptide de cuivre - Année 2002 Aperçu des résultats biologiques et cliniques Pickart, L. Peptides de cuivre pour la régénération tissulaire. Produits chimiques de spécialité 9 octobre 2002, 29-31.

Stimulation de la croissance des ongles

Pendant les périodes de pluie prolongées dans l'État de Washington, les chevaux développent souvent de graves irritations dans leurs membres inférieurs, en particulier là où la peau couverte de poils rejoint les sabots. Cette zone cutanée peut développer des irritations, des infections et des saignements. Lors d'expériences pour soigner ces peaux irritées avec des crèmes contenant des peptides de cuivre, l'application de la crème de peptide de cuivre était souvent imprécise en raison des mouvements des chevaux et la crème était généreusement appliquée sur la peau inférieure de la jambe et une partie des sabots supérieurs. Alors qu'il a été observé que les crèmes cicatrisaient rapidement les zones de la peau, nous avons également observé de manière inattendue que les sabots endommagés semblaient s'améliorer considérablement en santé. Plus tard, nous avons expérimenté une application plus contrôlée des crèmes au peptide de cuivre dans les fissures des sabots gravement endommagés. Nous avons constaté que la crème au peptide de cuivre produisait généralement une guérison remarquable des sabots et une fermeture des fissures.

Étant donné que les sabots des chevaux et les ongles des humains sont similaires en termes de biochimie et de biologie cellulaire, nous avons testé l'application de ces crèmes peptidiques de cuivre sur les ongles et les orteils humains endommagés. Nous avons observé qu'un tel traitement produisait chez l'homme, comme chez le cheval, une amélioration remarquable de la santé et de la croissance des ongles. Ces types de peptides de cuivre, lorsqu'ils sont appliqués sur la matrice de l'ongle et la zone du lit de l'ongle, améliorent le processus de croissance des ongles, ce qui donne des ongles plus forts, plus épais et plus lisses. De tels types de peptides de cuivre ont déjà été trouvés pour améliorer fortement la production de la protéine collagène et également accélérer la réparation de la peau endommagée. Cependant, étant donné que les ongles sont principalement composés de kératine, une protéine dure, on ne s'attendait pas à ce que les peptides de cuivre augmentent la production de kératine et la croissance des ongles.

Nous avons ensuite étudié les actions d'une crème au peptide de cuivre dans une étude pilote informelle sur la croissance des ongles chez l'homme. Les ongles du contrôle placebo ont été traités avec une crème similaire qui ne contenait pas de peptide de cuivre. Pour tester les expériences, les taux de croissance des ongles de l'index ont été utilisés comme mesure. Dans la première série d'expériences, le peptide de cuivre a été appliqué sur l'ongle de l'index et la cuticule de la main droite tandis que l'ongle de la main gauche n'a pas été traité et a été utilisé comme témoin. Dans la deuxième série d'expériences avec différents volontaires, la crème a été appliquée sur l'ongle de l'index et la cuticule de la main gauche tandis que l'ongle de la main droite a été traité avec la crème placebo et utilisé comme contrôle. Les ongles ont été traités pendant quatre semaines. La longueur de l'ongle a été mesurée de l'extrémité du lit de l'ongle à la pointe de l'ongle en son centre en poussant une petite règle en plastique sous l'ongle et fermement contre le lit de l'ongle. Les ongles ont également été inspectés visuellement pour déterminer que les ongles traités semblaient être plus longs sur la main traitée et cela était facilement apparent dans tous les cas. L'effet de la stimulation de la croissance des ongles était approximativement similaire si le groupe traité par la main droite ou le groupe traité par la main gauche était utilisé. Comme le montre le tableau 1, les ongles traités avec le complexe cuivre-peptide présentaient une meilleure croissance des ongles. Cependant, il faut souligner qu'il ne s'agissait pas d'une étude en aveugle.

Tableau 1 - Effet du produit peptidique de cuivre sur la croissance des ongles
Première expérience (Sexe : M ou F) Croissance des ongles des doigts avec une crème peptidique de cuivre
(Millimètres en quatre semaines)
Croissance des ongles des doigts avec crème placebo
(Millimètres en quatre semaines)
Main droite Main gauche
Personne 1M 4.2 2.7
Personne 2M 3.2 2.1
Personne 3F 4.3 3.2
Personne 4F 3.8 2.9
Personne 5F 3.9 2.6
Deuxième expérience main gauche Main droite
Personne 6M 2.8 1.5
Personne 7M 3.7 2.6
Personne 8F 4.1 3.0
Personne 9F 4.1 2.6
Personne 10F 3.5 2.2

Améliorer le bronzage et réduire la desquamation de la peau

Ce brevet contient des méthodes pour augmenter l'efficacité de la formation de mélanine et réduire les dommages causés par le pelage après le bronzage. La diminution du temps d'exposition au soleil et le peeling post-bronzage réduiraient l'exposition globale aux ultraviolets.

Toute l'approche du bronzage et de la protection solaire est en pleine mutation. De nombreux écrans solaires chimiques sont interdits en raison d'actions œstrogéniques et d'autres toxicités. La combinaison de crèmes réparatrices pour la peau et de réflecteurs ultraviolets tels que l'oxyde de zinc ou le dioxyde de titane peut être une meilleure approche de la protection solaire.

Tableau 9. Améliorer le bronzage et réduire les dommages causés par les UV aux cellules de la peau

Méthodes de bronzage améliorées Compositions et méthodes de bronzage et de protection de la peau. Brevet américain 5 698 184 Pickart
Bloque les dommages mortels des rayons ultraviolets et inhibe la glycation dommageable Le GHK bloque les dommages mortels causés par les rayons ultraviolets aux kératinocytes cutanés en culture en liant et en inactivant les espèces carbonylées réactives telles que le 4-hydroxynoneal, l'acroléine, le malondialdehye et le glyoxal. Voir les microphotographies ci-dessous qui sont une gracieuseté de Lipotec Corporation (www.lipotec.com) . Cette protection a été trouvée à un niveau relativement élevé de GHK, 20 mg/ml ou 0,2%, mais cette concentration peut être facilement ajoutée aux écrans solaires protecteurs. Les écrans solaires actuels sont construits autour de molécules, telles que l'oxybenzone, l'avobenzène, l'anthranilate de menthyle, le méthoxycinnamate d'octyle, qui absorbent fortement le rayonnement ultraviolet, puis libèrent l'énergie en la libérant sous forme de radicaux libres. De tels produits chimiques absorbant les radicaux libres empêchent les coups de soleil, mais bon nombre de ces produits chimiques ont de fortes activités œstrogéniques et leur accumulation dans les tissus humains suscite des inquiétudes. Le GHK inhibe également la glycation dommageable du cuivre et de la superoxyde dismutase de zinc causée par le fructose. Le GHK est plus actif que la carnosine à cet égard. J. Cebrian, A. Messeguer, R.M. Facino et J.M. Garcia-Anton, Inter. J.Cosm. Sci. 27, 271-278 (2005)

Rayonnement UVB + HNE (4-Hydroxynonénal)

GHK + UVB + HNE (4-Hydroxynonénal)

Le GHK-Cu a émergé lors de mes tentatives pour inverser certains changements qui se produisent au cours du vieillissement humain. L'objectif était de supprimer la synthèse du fibrinogène sanguin, une protéine qui augmente avec l'âge et augmente encore plus après l'infarctus du myocarde. Sa concentration sanguine est un excellent prédicteur de mortalité. Des taux élevés de fibrinogène augmentent la coagulation sanguine et diminuent la perfusion tissulaire, en augmentant les propriétés thixotropes du sang dans la microcirculation.

J'ai découvert que la fraction albumine du plasma sanguin humain a une action suppressive sur la synthèse du fibrinogène et améliore également la survie des cellules hépatiques cultivées qui produisent le fibrinogène. D'autres isolements ont révélé que ces activités étaient concentrées dans une fraction de faible poids moléculaire qui contenait du GHK-Cu. Des travaux ultérieurs ont défini la structure en solution tridimensionnelle du GHK-Cu et les affinités de liaison entre le GHK et le cuivre (II). Mes collègues de l'Université de Washington (Seattle) et moi avons utilisé la structure du GHK-Cu pour créer des analogues qui étaient des inhibiteurs de croissance cellulaire très puissants, inhibant la réplication des fibroblastes à des concentrations équivalentes aux médicaments chimiothérapeutiques tels que le cisplatine et la bléomycine. Au cours des procédures chirurgicales pour tester ces inhibiteurs sur la suppression de la croissance tumorale chez la souris, le GHK-Cu a été utilisé comme substance témoin. Il est devenu évident que le GHK-Cu cicatrisait rapidement les incisions chirurgicales.

Des recherches ultérieures ont révélé que Iamin est généré lors de lésions tissulaires et suggèrent que, après une lésion tissulaire, le GHK-Cu sert de signal de rétroaction humain qui possède de puissantes propriétés protectrices des tissus et stimule le remodelage des tissus après la phase initiale de cicatrisation. Il est postulé qu'une génération localisée de GHK-Cu après une lésion tissulaire provoque un afflux de cellules réparatrices de la peau appelées macrophages qui initient les mécanismes de réparation cutanée. La diminution des concentrations sanguines de GHK-Cu au cours du vieillissement humain peut être un facteur de la diminution de la réparation tissulaire et de l'augmentation subséquente de la défaillance d'organes qui se produit au cours du vieillissement.

GHK-Cu - Fonction dans le corps humain

Un certain nombre de noms ont été utilisés dans la littérature scientifique pour GHK.

Noms et identifications utilisés pour GHK
Nom systématique N(2)-(N-glycyl-L-histidyl)-L-lysine
Numéro d'enregistrement CAS 49557-75-7
Formule moléculaire C14-H24-N6-O4
Nom général Glycyl-histidyl-lysine
Synonymes Cuivre glycyl-histidyl-lysine
Cuivre(II)ghk
Glycylhistidyllysine
Gly-son-lys
Je suis dedans
NSC 379527
Prezatide (ou Prezatide Cuivre en tant que complexe)

Quelle est la fonction du GHK-Cu dans le corps humain ? La molécule est présente dans le plasma sanguin, la salive et l'urine en quantités physiologiquement actives. Les preuves suggèrent qu'il s'agit d'un signal de rétroaction biochimique qui est généré après une lésion tissulaire. Il semble avoir deux fonctions principales : (1) d'abord comme un puissant agent anti-inflammatoire protecteur des tissus qui limite les dommages oxydatifs après une lésion tissulaire, et (2) comme un signal qui active le remodelage des tissus, c'est-à-dire les processus d'élimination des protéines endommagées et tissus cicatriciels et leur remplacement par des tissus normaux. Ainsi, GHK-Cu relie les processus d'élimination des tissus cicatriciels endommagés et le dépôt de nouveaux tissus.

Le GHK, qui est généré dans les tissus endommagés, accélère directement de nombreuses propriétés associées à la guérison à une concentration d'environ 10exp(-10)M. Certains des effets stimulés par le GHK semblent être directement médiés par le GHK ou le GHK-Cu après avoir obtenu du cuivre (II) à partir de l'albumine. D'autres actions de GHK et GHK-Cu sont susceptibles de résulter de l'attraction par GHK-Cu des macrophages de la plaie et d'autres cellules immunitaires associées à la guérison qui, à leur tour, libèrent des familles de protéines de facteur de croissance appropriées à la réparation du tissu endommagé.

François Maquart et ses collègues de Reims ont soutenu que le GHK-Cu agit sur la deuxième phase de la cicatrisation en tant qu'inducteur des processus de remodelage tissulaire.Un autre support pour ce concept est que le poids moléculaire des fragments de collagène induits par GHK-Cu sont beaucoup plus petits que ceux produits dans la phase précoce de la réparation des plaies. Cela suggère qu'avec le complexe de cuivre, la synthèse et la dégradation du collagène se produisent simultanément. De plus, en culture cellulaire, le GHK-Cu réduit la sécrétion de la protéine productrice de cicatrice, TGF-beta-1, par les fibroblastes normaux et les fibroblastes producteurs de chéloïdes. Ceci, combiné aux activités de guérison du GHK-Cu, suggère qu'une guérison sans cicatrice nécessite à la fois une activation des métalloprotéinases et une réduction de la production de TGF-beta-1.

Mécanisme proposé Actions Cuivre-Peptide GHK-Cu après une lésion tissulaire

Des informations provenant de diverses sources nous permettent de proposer un mécanisme pour les effets du GHK-Cu. La séquence d'événements des effets induits par le GHK-Cu semble être la suivante :

1. Initialement après une lésion tissulaire, la première étape des processus de cicatrisation est activée. Ceux-ci incluent la coagulation sanguine localisée, une invasion précoce des neutrophiles qui sécrètent des radicaux oxygénés stérilisants, et plus tard une induction par des facteurs de croissance, tels que le TGF-beta-1, de grandes quantités de collagène cicatriciel pour former un revêtement protecteur sur la blessure.

2. Une deuxième étape de guérison commence à être activée lorsque les cellules perturbées libèrent des protéases qui génèrent une population de peptides comprenant Gly-His-Lys et His-Gly-His-Lys, qui ont tous deux une très grande affinité pour le cuivre (+ 2) ionique.

3. Les Gly-His-Lys et His-Gly-His-Lys commencent à accumuler des ions cuivre (+2) à partir de l'albumine et forment GHK-Cu et HGHK-Cu.

4. L'accumulation d'ions de cuivre liés aux peptides produit de multiples effets anti-inflammatoires qui aident à arrêter les actions des radicaux d'oxygène stérilisants et permettent le déclenchement d'événements de guérison. Le GHK-Cu bloque les canaux de ferritine et la libération de fer libre (oxydant), bloquant ainsi la peroxydation lipidique catalysée par le fer qui se produit après une blessure. Le GHK-Cu bloque également les dommages causés par l'interleukine-1 aux cellules tissulaires.

5. Le GHK-Cu libéré dans la circulation sanguine augmente la production par le corps et la concentration sanguine circulante de macrophages de la plaie qui améliorent la réparation.

6. GHK-Cu supprime la synthèse du développement de la cicatrice en réprimant la production de fibroblastes de TGF-beta-1.

7. GHK-Cu attire également les macrophages de la plaie vers la zone de la plaie. Ces macrophages agissent directement pour stimuler la cicatrisation en éliminant les débris cellulaires et en sécrétant une famille d'environ 20 protéines de facteur de croissance.

8. GHK-Cu agit directement sur les fibroblastes pour stimuler les ARNm pour le collagène, l'élastine, les protéoglycanes, les métalloprotéinases et TIMP-1 et TIMP-2. Cela augmente à son tour les niveaux de ces protéines. Il en résulte une condition dans laquelle la synthèse et le dépôt des protéines se produisent en même temps que la dégradation des protéines qui élimine le tissu cicatriciel et les débris cellulaires restants de la rupture des tissus. Ainsi, le GHK-Cu relie la réduction des cicatrices et la reconstruction des tissus.

9. GHK-Cu induit l'angiogenèse en servant de chimiotactique pour diriger de nouveaux capillaires sanguins vers la zone de la plaie et en induisant la production de plusieurs protéines essentielles à l'angiogenèse.

10. GHK-Cu induit l'excroissance neuronale et la réinnervation des tissus endommagés.

11. Ce mécanisme de réparation tissulaire induite par le peptide de cuivre semble fonctionner pour la peau, les follicules pileux, la muqueuse de l'estomac, la muqueuse intestinale, le tissu osseux, les sabots et les ongles.

12. Ce mécanisme de régénération du cuivre-peptide est différent de la plupart des modèles de réponse hormonale biochimique connus tels que le système insuline-glucose ou le système érythropoïétine-globule rouge. Avec ces systèmes, un petit changement dans les concentrations de glucose ou de globules rouges entraîne une libération contrôlée avec précision des hormones pour rétablir des taux normaux de glucose ou de globules rouges.

13. Le remodelage tissulaire cuivre-peptide est un système stimulus-réponse beaucoup plus souple - un peu comme une réponse "logique floue". Les lésions tissulaires traumatiques sont une affaire intrinsèquement désordonnée - les lésions peuvent être légères ou massives. Les systèmes de réparation corporelle ne reçoivent pas toujours des informations rapides et claires quant à l'étendue des dommages tissulaires - les dommages peuvent être soudains et aigus - ou le résultat d'une maladie dégénérative lente. Cela peut expliquer pourquoi les cicatrices et les lésions cutanées durent si longtemps chez les adultes que le corps ne reconnaît tout simplement pas la nécessité d'éliminer les imperfections.

Le besoin de peptides de cuivre régénérants améliorés pour la peau

Les produits de première génération conçus autour du GHK-Copper ont donné de bons résultats dans de nombreux tests contrôlés, cependant, les produits ont échoué dans les essais cliniques de la FDA sur la cicatrisation des plaies humaines très difficiles à cicatriser (comme de nombreuses autres approches). La fragilité et la dégradation rapide du GHK et des peptides similaires sont le problème majeur dans le développement de produits à usage clinique et cosmétique. Dans le corps humain, le complexe GHK-Cu peut être généré en permanence. Cependant, lorsqu'il est utilisé comme thérapie à dose unique, sa fragilité entraîne une dégradation rapide, une clairance du derme et une perte d'efficacité.

En 1975, lors de tentatives pour isoler le GHK du sang humain, nous avons découvert que la molécule était particulièrement vulnérable aux carboxypeptidases et était rapidement dégradée par les enzymes du sang. Les injections intradermiques de GHK sont éliminées de la peau en 30 secondes environ. S'il est ajouté au sang, le GHK est rapidement dégradé en acides aminés constitutifs par les enzymes du sang. Endo, Miyagi et Ujie ont également signalé que la GHK était rapidement dégradée par le plasma sanguin et rapidement éliminée des rats. (Référence, Endo, Miyagi et Ujie, Kissei Pharmaceutical Co., Détermination simultanée de la glycyl-L-histidyl-L-lysine et de son métabolite, la L-histidyl-L-lysine, dans le plasma de rat par chromatographie liquide haute performance avec post -dérivatisation de la colonne.J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Apr 25692 (1):37-42)

Cette fragilité et cette dégradation rapide du GHK et d'autres complexes simples de peptides de cuivre constituent le problème majeur dans le développement de produits à usage clinique et cosmétique. Dans le corps humain, le complexe GHK-Cu peut être généré en permanence. Cependant, lorsqu'il est utilisé comme thérapie à dose unique, sa fragilité entraîne une dégradation rapide, une clairance du derme et une perte d'efficacité. Une variété de modifications chimiques du GHK ont produit des complexes de cuivre bioactifs avec une résistance à la rupture améliorée. Le problème avec cette approche classique de la chimie organique est que chaque nouveau produit chimique devient, en termes réglementaires de la FDA, une nouvelle entité chimique. Cela augmente la possibilité d'effets secondaires indésirables et d'approbations réglementaires beaucoup plus lentes.

Développement actuel de peptides de cuivre améliorés

Actuellement, des peptides de cuivre plus efficaces avec des actions de régénération tissulaire ont été développés. Plusieurs centaines de complexes cuivre-peptide ont été évalués mais aucun n'était significativement meilleur que GHK-Cu. Certains complexes, tels que f-Met-Leu-Phe-Cu, produisaient en fait plus de formation de cicatrices. Les principaux défauts des peptides isolés étaient un manque de stabilité et une mauvaise adhérence à la surface de la peau.

Nous avons ensuite testé les fractions de peptides restantes après digestion enzymatique de diverses protéines. Ces peptides, étant les produits finaux de la digestion enzymatique, se sont avérés très résistants à une digestion enzymatique ultérieure. Des tests supplémentaires ont révélé que les peptides les plus prometteurs étaient une fraction de fragments peptidiques qui restaient après la protéolyse partielle des protéines de soja. Ces peptides de soja ont une très faible antigénicité et une longue histoire d'utilisation sûre dans les produits cosmétiques et dans les solutions utilisées en clinique pour l'alimentation intraveineuse. Pour augmenter l'adhérence à la peau, une fraction peptidique avec un pourcentage significatif de résidus de sucre a été utilisée. Les digestions peptidiques avec des sucres attachés ont des propriétés similaires à celles du mucus et des fragments peptidiques du collagène ont été utilisés comme colles telles que les colles "Le Pages" autrefois utilisées par les écoliers. Cela aide à faire adhérer les composants actifs de la crème à la peau ou aux plaies humides.

Des digestions peptidiques mixtes similaires de protéines ont été utilisées pour attirer et concentrer les macrophages des plaies dans les années 1930. Le produit de digestion a été injecté par voie intrapéritonéale à des rats et 24 heures plus tard, les macrophages se sont concentrés dans la cavité intrapéritonéale et ont été récoltés.

Lorsque le cuivre (II) est chélaté en cette fraction peptidique, cela produit des peptides de cuivre avec de très fortes propriétés réparatrices de la peau. Dans des études sur des personnes allergiques au nickel, ces peptides de cuivre se sont également avérés avoir de fortes actions anti-inflammatoires, approximativement égales à celles observées pour la cortisone. En raison de leur résistance à la dégradation, ces peptides de cuivre peuvent être utilisés avec des hydroxyacides exfoliants pour la peau pour un renouvellement cutané plus rapide et pour la réduction des cicatrices. Ces peptides ont une puissance améliorée, une résistance à la dégradation, une durée d'action plus longue et une très haute adhérence à la peau.

Dans des études vétérinaires, les crèmes fabriquées à partir de ces nouveaux complexes de cuivre ont produit une guérison rapide et sans cicatrice chez les chiens après des opérations de stérilisation et chez les jeunes chevaux après des opérations de redressement des jambes. Cela a permis de rendre les chiens à leurs propriétaires en quatre jours au lieu des cinq habituels, tandis que les poulains ont été rendus en cinq jours au lieu de sept. Chez l'homme, quatre petites études contrôlées par placebo ont révélé une guérison plus rapide de la peau après des lésions cutanées induites par le retrait du ruban adhésif, des brûlures à l'acétone (élimination des lipides cutanés), une irritation des détergents sur 24 heures et une inflammation allergique au nickel.

Synthèse chimique vs méthodes biologiques pour la création de peptides de cuivre à action prolongée

Le résidu d'histidine a été remplacé par un acide aminé synthétique, la L-spinacine ou l'acide L-1,2,3,4-tétrahydro-isoquinoléine-3-carboxylique. Étudié avec potentiométrie, calorimétrie de solution, spectrophotométrie UV-VIS, dichroïsme circulaire et spectroscopies de résonance paramagnétique électronique. Tous les ligands ont formé des complexes de cuivre ayant des stoechiométries et des stabilités différentes.

Après 3 heures dans le sérum, la GHK était dégradée mais les composés synthétiques n'ont montré aucune dégradation significative.

Méthode pour développer des peptides de cuivre à longue durée d'action Résultat Problèmes potentiels Référence
Synthèse chimique. Un analogue partiellement rétro-inverso de GHK a été synthétisé, dans lequel la liaison -CONH- entre l'histidine et la lysine a été modifiée en -NHCO-. Le nouvel analogue peptidique a montré une stabilité d'environ dix fois supérieure à celle du peptide parent. Il s'agit d'une nouvelle entité chimique - Nécessiterait des tests de sécurité approfondis. Peut perdre son activité anti-inflammatoire H-Gly-His psi (NHCO)Lys-OH, analogue rétro-inverso partiellement modifié du facteur de croissance glycyl-L-histidyl-L-lysine avec une stabilité enzymatique améliorée. Dalpozzo A, Kanai K, Kereszturi G, Calabrese G. Int J Pept Protein Res 1993 Jun41 (6): 561-6
Synthèse chimique. GHK synthétiquement modifié avec des groupes résistants aux pannes - Ce sont de nouvelles entités chimiques - Nécessiteraient des tests de sécurité approfondis. Peut perdre son activité anti-inflammatoire Complexes de cuivre de glycyl-histidyl-lysine et de deux de ses analogues synthétiques : comportement chimique et activité biologique, Conato et al, Biochim Biophys Acta 1526, 199-210, 2001
Synthèse biologique. Utilisez une fraction de digestion enzymatique de protéine de soja - ces peptides de résultat final sont résistants à une dégradation enzymatique supplémentaire Après 3 heures dans le sérum, les complexes de cuivre du digestat de soja ont conservé des activités cicatrisantes et anti-inflammatoires par rapport au sérum natif. Aucun trouvé - A réussi tous les tests de sécurité. Ces types de peptides ont été largement utilisés pour l'alimentation intraveineuse, dans les compléments alimentaires et dans les shampooings et revitalisants. Pickart Brevet US 5 382 431 Compositions protectrices et régénératrices des tissus Brevet US 5 554 375 Compositions protectrices et régénératrices des tissus Brevet US 5 698 184 Compositions et méthodes pour le bronzage et la protection de la peau Brevet US 5 888 522 Compositions protectrices et régénératrices des tissus .

Howard Maibach a dirigé quatre études sur la réparation de la peau humaine à l'aide de ces peptides de cuivre résistants à la dégradation formulés dans une base de crème non ionique. Ces études contrôlées par placebo et en double aveugle ont donné des résultats positifs statistiquement significatifs selon lesquels les crèmes au peptide de cuivre ont nettement accéléré le taux de récupération de la peau et réduit l'irritation après de graves lésions cutanées. Les études comprenaient (1) la peau endommagée par l'acétone a eu les graisses retirées de la peau et produit des dommages similaires à une peau très sèche et craquelée, (2) la peau endommagée par le détergent a de nombreuses graisses éliminées ainsi que des dommages importants à la couche externe des protéines de la barrière cutanée . Il s'agit du test standard pour la dermatite de contact. (3) La peau endommagée par l'allergie au nickel est produite en appliquant des sels de nickel sur la peau des patients sensibilisés. Ceci est similaire aux dommages cutanés causés par d'autres réactions allergiques telles que le sumac vénéneux, le sumac vénéneux et d'autres allergènes, et (4) la peau dénudée de ruban adhésif qui est similaire à des restes dommageables, des abrasions et de petites coupures à la surface de la peau. Une bande de scotch est posée sur la peau, puis rapidement arrachée. Ce processus est répété environ 50 fois au même endroit, produisant finalement une petite blessure sur la peau.


Le mélange cuivre-peptides utilise une approche différente de la méthode GHK-Cu à molécule unique. Le digest contient des millions de variantes de complexes d'ions de cuivre peptidiques, ressemblant davantage à la situation qui se produit après une lésion tissulaire et une protéolyse ultérieure. Le mécanisme physiologique par lequel la peau ou d'autres organes signalent une réparation est assez complexe. Cependant, pour un usage thérapeutique, une approche beaucoup plus simple suffit souvent pour induire une régénération tissulaire. In vivo, les peptides actifs doivent avoir une très grande affinité pour le cuivre (+2) pour obtenir l'ion cuivre et former des complexes peptidiques cuivre. Mais de manière exogène, nous pouvons facilement complexer des mélanges de peptides, même avec une affinité beaucoup plus faible pour l'ion cuivre, en cuivre (+2) simplement en ajoutant des sels de cuivre à une solution de peptides. La justification scientifique de la bioactivité de ces peptides de cuivre est que de nombreux fragments peptidiques sont générés par des enzymes protéolytiques. Une fraction de ces peptides aura une affinité élevée pour le cuivre (+2) et une partie peut avoir des propriétés similaires à celles du GHK-Cu.

Comparaison des attributs de GHK et HGHK par rapport aux digestions enzymatiques de protéines
Paramètre biologique GHK et HGHK Nouveaux condensés de protéines enzymatiques
Plaie Macrophage Chemoattraction-Très élevé Haute
Affinité de liaison au cuivre - Très élevée Modéré, doit ajouter des ions de cuivre au mélange
Antigénicité - Aucune Aucun dans le type actuellement utilisé / Tests d'antigénicité humaine et tests sur animaux réussis
Activité de guérison dans les modèles animaux - Modérée Haute
Adhérence à la peau et aux plaies - Faible Très haut, forme une "colle" biologique
Dégagement de la zone appliquée - Rapide Lent

Importance de la formulation soigneuse des complexes peptidiques de cuivre

Avec les crèmes au cuivre-peptide, un grand soin doit être pris pour produire une crème qui a des interactions minimales avec le cuivre ionique dans la crème. Les formulateurs qui préparent des crèmes pour la peau n'ont généralement qu'une connaissance limitée de la chimie et ne savent pratiquement rien de la biologie cellulaire, des interactions hormonales et de la biochimie générale. Il est facilement possible de produire des crèmes, lotions et solutions contenant du cuivre qui neutralisent les effets cuivre-peptide par l'interaction de divers composants avec le cuivre ionique. Il est également possible de créer des complexes de cuivre qui inhibent la réplication cellulaire. Il convient de souligner que les travaux sur le GHK-Cu découlent de projets financés par le National Cancer Institute pour le développement d'analogues inhibiteurs de croissance du GHK-Cu. Au cours de ce projet, des analogues de GHK-Cu ont été synthétisés qui inhibent la réplication des fibroblastes à 10exp (-16) M. Certaines entreprises ont récemment vendu des produits cosmétiques pour la peau utilisant du cuivre EDTA, mais ce complexe inhibe la fonction des fibroblastes et la réparation de la peau. Tout produit doit être soigneusement testé pour son effet sur la réparation de la peau.

Pour les études cuivre-peptide, nous avons formulé une crème non ionique, mais stable. Pour la conservation de la crème, Germaben II a été utilisé et nos tests ont révélé qu'il n'avait aucune influence sur le processus de réparation des plaies. Ce produit contient de la diazolinydinylurée, du méthylparaben et du propylparaben et produit des crèmes auto-stérilisantes avec une excellente conservation pendant au moins quatre ans à température ambiante. Un inconvénient du système conservateur est que certaines personnes sont sensibilisées aux parabènes mais il n'existe pas de conservateur parfait pour les produits cicatrisants. L'alcool benzoylique ne doit jamais être utilisé comme conservateur pour les produits cicatrisants, car il inhibe la réplication des fibroblastes de la plaie.

GHK Suppression des gènes de métastases cancéreuses, de la décorine et des analogues inhibiteurs de croissance de la région de liaison au cuivre du GHK

Le GHK supprime les gènes des métastases cancéreuses humaines, mais en raison du système de culture cellulaire utilisé, il est probable que le GHK ait été converti en GHK-cuivre. Le cuivre GHK augmente également la protéine Decorin (nommée parce qu'elle "décore" les brins de collagène). La décorine a un mélange d'effets déroutants : régénération des muscles et des nerfs, réduction des cicatrices et inhibition de la croissance tumorale et des métastases cancéreuses chez les animaux.

GHL Suppression des métastases cancéreuses

Les auteurs ont recherché des substances capables d'inverser l'expression de ces gènes impliqués dans les métastases du cancer du côlon humain.

Pour déterminer l'expression des gènes des cellules humaines normales et cancéreuses, ils ont mesuré l'ARN produit par les cellules. Pour trouver des substances capables d'inverser l'expression de ces gènes impliqués dans les métastases, ils ont utilisé une base de données très fiable développée au Broad Institute (Massachusetts Institute of Technology et Harvard) de 7000 profils d'expression à l'échelle du génome après traitement de 4 lignées cellulaires humaines avec 1309 substances bioactives. Seules deux substances, la GHK et la securenine (un alcaloïde) du choix de 1309 ont pu calmer les gènes impliqués dans la propagation tumorale. Les auteurs mentionnent également la faible toxicité du GHK et la faible concentration (1 micromolaire) qui produit l'effet souhaité.

Le GHK supprime les gènes des métastases cancéreuses humaines

Métastase Clin Exp. 27 février 2010 (2) : 83-90. Publication en ligne du 9 février 2010.

Une signature « sujette aux métastases » pour les patients atteints d'un cancer colorectal sporadique à un stade précoce et compétents en matière de réparation des mésappariements et ses implications pour des traitements possibles.

Hong Y, Downey T, Eu KW, Koh PK, Cheah PY., Département de chirurgie colorectale, Hôpital général de Singapour, Singapour, 169608, Singapour.

Les métastases sont la principale cause de mortalité par cancer. Notre objectif était de trouver une signature sujette aux métastases pour les patients atteints d'un cancer colorectal sporadique (CCR) à un stade précoce et capables de réparer les mésappariements pour un meilleur pronostic et une utilisation éclairée de la chimiothérapie adjuvante. Les profils d'expression à l'échelle du génome de 82 patients appariés selon l'âge, l'origine ethnique et les tissus et des témoins sains ont été analysés à l'aide de la puce Affymetrix U133 Plus 2. Les patients avec métastases négatives ont 5 ans ou plus de suivi. Une conception de validation croisée emboîtée à deux niveaux 10 x 10 a été utilisée avec plusieurs familles de modèles de classification pour identifier le prédicteur optimal de métastase. Le meilleur modèle de classification a donné un ensemble de 54 gènes (74 ensembles de sondes) avec une précision de prédiction estimée à 71%. La spécificité, la sensibilité, les valeurs prédictives négatives et positives de la signature sont respectivement de 0,88, 0,58, 0,84 et 0,65, ce qui indique que l'ensemble de gènes peut améliorer le pronostic des patients atteints de CCR sporadique à un stade précoce.Ces 54 gènes, y compris les molécules nodales YWHAB, MAP3K5, LMNA, APP, GNAQ, F3, NFATC2 et TGM2, intègrent de multiples biofonctions dans divers compartiments dans un réseau moléculaire complexe, suggérant que des perturbations à l'échelle cellulaire sont impliquées dans la transformation des métastases. De plus, l'interrogation de la « carte de connectivité » avec un sous-ensemble (70 %) de ces gènes montre que Gly-His-Lys et la sécurinine pourraient inverser de manière significative les expressions différentielles de ces gènes, suggérant qu'ils ont un effet thérapeutique combinatoire sur les patients sujets aux métastases. . Ces deux perturbagènes favorisent la cicatrisation, le remodelage de la matrice extracellulaire et l'activation des macrophages, soulignant ainsi l'importance de ces voies dans la suppression des métastases pour le CCR à un stade précoce.

Le cuivre GHK augmente la décorine qui supprime la croissance du cancer et les métastases

Les métastases dans le cancer du sein sont une préoccupation vitale dans le traitement, le récepteur du facteur de croissance épidermique et ErbB2 étant fortement impliqués dans la médiation de l'invasion et de la propagation des tumeurs. Dans cette étude, nous avons étudié le rôle de la décorine dans la suppression des carcinomes mammaires primaires et des métastases pulmonaires. Nous montrons que la décorine provoque une suppression marquée de la croissance à la fois in vitro et in vivo en utilisant une lignée cellulaire de cancer du sein métastatique et un modèle de carcinome mammaire orthotopique. Le traitement avec le noyau protéique de la décorine a réduit la croissance tumorale primaire de 70 % et éliminé les métastases observées. Un vecteur adénoviral contenant le transgène de la décorine a provoqué un retard tumoral primaire de 70 %, en plus de réduire considérablement les métastases observées. De plus, nous démontrons que la phosphorylation d'ErbB2 et les niveaux de protéines totales du récepteur sont réduits dans ce système modèle lors de l'expression de novo de la décorine sous le contrôle d'un promoteur inductible par la doxycycline. La croissance tumorale primaire in vivo a été réduite jusqu'à 67 % lors de l'induction de la décorine, et les métastases pulmonaires ont également été fortement entravées. Ces effets se produisent probablement par la régulation négative à long terme de la cascade de tyrosine kinase ErbB2 par la décorine. Ces résultats démontrent un nouveau rôle de la décorine dans la réduction ou la prévention des métastases tumorales dans ce modèle de cancer du sein et pourraient éventuellement conduire à de meilleures thérapies pour le cancer du sein métastatique.

La décorine, un membre de la petite famille des gènes des protéoglycanes riches en leucine, régule à la baisse les membres de la famille des récepteurs tyrosine kinase ErbB et atténue leur signalisation, entraînant une inhibition de la croissance. Nous avons étudié les effets de la décorine sur la croissance des cellules de carcinome mammaire surexprimant ErbB2 en comparaison avec AG879, un inhibiteur établi de la kinase ErbB2. Des tests de prolifération cellulaire et de croissance indépendante de l'ancrage ont montré que la décorine était un puissant inhibiteur de la croissance des cellules du cancer du sein et un agent pro-apoptotique. Lorsque la décorine et l'AG879 ont été utilisées en combinaison, l'effet inhibiteur était synergique dans les tests de prolifération mais seulement additif dans les tests de formation de colonies et d'apoptose. Un noyau de protéine de décorine humaine recombinante active, AG879, ou une combinaison des deux a été administré par voie systémique à des souris portant des xénogreffes de carcinome mammaire orthotopique. La croissance et le métabolisme de la tumeur primaire ont été réduits d'environ 50 % par la décorine et l'AG879. Cependant, aucune synergie n'a été observée in vivo. La décorine ciblait spécifiquement les cellules tumorales et provoquait une réduction significative des niveaux d'ErbB2 dans les xénogreffes tumorales. Plus important encore, l'administration systémique de décorine a empêché la propagation métastatique aux poumons, comme cela a été détecté par la détection d'ADN spécifique à l'espèce et des tests quantitatifs. En revanche, AG879 n'a eu aucun effet. Nos données soutiennent le rôle de la décorine en tant qu'agent thérapeutique puissant et efficace contre le cancer du sein en raison de son inhibition à la fois de la croissance tumorale primaire et de la propagation métastatique.

La métastase pulmonaire est l'événement le plus crucial affectant le résultat thérapeutique de l'ostéosarcome. La prévention des métastases pulmonaires est donc importante pour améliorer le pronostic des patients atteints d'ostéosarcome. La décorine est une protéine majeure de la matrice extracellulaire qui est devenue l'objet de diverses études sur le cancer. Le rôle biologique de la décorine dans l'ostéosarcome n'a pas encore été clarifié. Le but de cette étude était d'examiner le potentiel de la décorine comme nouvelle cible biologique pour le traitement de l'ostéosarcome. Dans cette étude, la lignée cellulaire d'ostéosarcome murin LM8 (LM8) avec un potentiel métastatique élevé au poumon a été utilisée. Les deux lignées cellulaires établies étaient LM8-DCN qui exprimait de manière stable la décorine humaine (hDCN) et LM8-mock, établie comme témoin. La lignée cellulaire LM8-DCN a été injectée par voie sous-cutanée dans le dos de souris. Significativement moins de métastases pulmonaires ont été observées chez les souris avec LM8-DCN par rapport aux souris inoculées avec LM8 et LM8-mock (P<0.001). De plus, les souris du groupe inoculé LM8-DCN ont survécu significativement plus longtemps que celles du groupe inoculé LM8 et LM8-simulé, sur la base de l'analyse de survie de Kaplan-Meier et des tests de log-rank (P<0.005). L'effet de la décorine sur les taux de croissance, la motilité et la capacité d'invasion de LM8 a été étudié in vitro. Il n'y avait pas de différence dans la morphologie et les taux de croissance, mais la motilité et l'invasion de LM8 étaient inhibées par la décorine. Ces résultats suggèrent que la décorine a le potentiel thérapeutique pour prévenir les métastases pulmonaires dans l'ostéosarcome.

Oncologie. 200977(2):92-9. Publication en ligne du 7 juillet 2009
La décorine supprime les métastases osseuses dans une lignée cellulaire de cancer du sein.

Araki K, Wakabayashi H, Shintani K, Morikawa J, Matsumine A, Kusuzaki K, Sudo A, Uchida A. Département de chirurgie orthopédique, École supérieure de médecine de l'Université Mie, Mie, Japon.

La décorine, prototype d'une famille en expansion de petits protéoglycanes riches en leucine, est impliquée dans un certain nombre de processus cellulaires, notamment l'assemblage de la matrice, la fibrillogenèse et le contrôle de la prolifération cellulaire. Dans cette étude, nous avons étudié le rôle de la décorine dans la suppression de l'agressivité tumorale et des métastases osseuses. Nous avons utilisé une lignée cellulaire de cancer du sein métastatique, MDA-MB-231, pour montrer que la décorine provoque une suppression marquée de la croissance à la fois in vitro et in vivo. Un vecteur cytomégaloviral contenant le transgène de la décorine a entraîné une croissance cellulaire considérablement réduite, la motilité et des métastases observées. Les métastases osseuses ont diminué de >90% lors de la transfection de la décorine. Ces résultats démontrent un nouveau rôle de la décorine dans la réduction ou la prévention des métastases tumorales dans ce modèle de cancer du sein et pourraient éventuellement conduire à des thérapies améliorées pour le cancer du sein métastatique.

Les voies du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) et du récepteur des androgènes (AR) jouent un rôle central dans la progression du cancer de la prostate. Par conséquent, les agents ayant une capacité de double ciblage peuvent avoir un potentiel thérapeutique important. La décorine, un protéoglycane présent dans le microenvironnement tumoral, est connue pour réguler l'assemblage de la matrice, la liaison au facteur de croissance et l'activité du récepteur tyrosine kinase. Ici, nous montrons que chez les souris Pten(P-/-) spécifiques de la prostate, un modèle de souris immunocompétent et génétiquement défini du cancer de la prostate, l'administration systémique de décorine inhibe la progression tumorale en ciblant la prolifération cellulaire et les voies de survie. De plus, dans les cellules cancéreuses de la prostate humaine, nous montrons que la décorine inhibe spécifiquement la phosphorylation de l'EGFR et de l'AR et la diaphonie entre ces voies. Cela empêche la translocation nucléaire AR et inhibe la production d'antigène spécifique de la prostate. En outre, la voie de survie des cellules phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K)/Akt est supprimée, ce qui conduit à l'apoptose des cellules tumorales. Ces résultats mettent en évidence l'efficacité de la décorine en présence d'un puissant risque de cancer génétique et impliquent la décorine comme nouvel agent potentiel pour le traitement du cancer de la prostate en ciblant les voies EGFR/AR-PI3K-Akt.

La décorine, le membre prototype des petits protéoglycanes riches en leucine, réside dans le microenvironnement tumoral et affecte la biologie de divers types de cancer en régulant à la baisse l'activité de plusieurs récepteurs impliqués dans la croissance et la survie des cellules. La décorine se lie et module la signalisation du récepteur du facteur de croissance épidermique et d'autres membres de la famille ErbB des récepteurs tyrosine kinases. Il exerce son activité antitumorale par un double mécanisme : via l'inhibition de ces récepteurs clés par leur régulation physique à la baisse couplée à l'atténuation de leur signalisation, et en se liant et en séquestrant le TGFbeta. La décorine module également le récepteur du facteur de croissance analogue à l'insuline et la protéine 1 liée au récepteur des lipoprotéines de basse densité, qui affecte indirectement la voie du récepteur TGFbeta. Lorsqu'elle est exprimée dans des souris porteuses de xénogreffes tumorales ou injectée par voie systémique, la décorine inhibe à la fois la croissance tumorale primaire et la propagation métastatique. Dans cette revue, nous résumons les derniers rapports sur la décorine et les molécules apparentées pertinentes pour le cancer et avançons l'idée de la décorine en tant que marqueur thérapeutique anticancéreux et pronostique possible pour les patients atteints de divers types de tumeurs. Nous discutons également du rôle du lumican et du LRIG1, un nouvel inhibiteur de croissance cellulaire homologue à la décorine.

P63 comme inhibiteur du cancer

Il existe des preuves que la protéine P63 inhibe également la croissance du cancer.

Arch Dermatol Res. 2009 avril301(4):301-6. Le cuivre-GHK augmente l'expression de l'intégrine et la positivité de la p63 par les kératinocytes. Kang YA, Choi HR, Na JI, Huh CH, Kim MJ, Youn SW, Kim KH, Park KC. Département de dermatologie, Seoul National University College of Medicine, Yeongeon-dong, Jongno-gu, Séoul, République de Corée.

Le glycyl-L-histidyl-L-lysyl (GHK) possède une grande affinité pour les ions cuivre(II), avec lesquels il forme spontanément un complexe (cuivre-GHK). Il est bien connu que le cuivre-GHK joue un rôle physiologique dans le processus de cicatrisation des plaies et de réparation tissulaire en stimulant la synthèse de collagène dans les fibroblastes. Cette étude a été menée pour étudier les effets du cuivre-GHK sur les kératinocytes. Les effets prolifératifs ont été analysés et la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine et l'immunohistochimie ont été menées pour évaluer les effets du cuivre-GHK dans des modèles d'équivalent de peau (SE). De plus, un western blot a été réalisé. Dans les kératinocytes cultivés en monocouche, le cuivre-GHK a augmenté la prolifération des kératinocytes. Lorsque les modèles SE ont été évalués, les cellules basales sont devenues cubiques lorsque du cuivre-GHK a été ajouté. L'analyse immunohistochimique a révélé que le cuivre-GHK augmentait la positivité de l'antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA) et de la p63. De plus, l'expression des intégrines alpha6 et bêta1 a augmenté dans les modèles SE, et ces résultats ont été confirmés par Western blot. Les résultats de cette étude indiquent que le traitement avec le cuivre-GHK peut augmenter le potentiel prolifératif des kératinocytes basaux en modulant l'expression des intégrines, p63 et PCNA. De plus, des niveaux accrus de p63, un marqueur putatif des cellules souches de la peau, suggèrent que le cuivre-GHK favorise la survie des cellules souches basales de la peau.

La mort cellulaire diffère. 9 avril 2010. [Publication électronique avant impression]

Protéines de la famille p53 et leurs régulateurs : des plaques tournantes dans la suppression tumorale.
Collavin L, Lunardi A, Del Sal G. Laboratorio Nazionale CIB (LNCIB), AREA Science Park, Trieste, Italie, Dipartimento di Scienze della Vita, Università degli Studi di Trieste, Trieste, Italie.

Résumé
Le suppresseur de tumeur p53 est une plaque tournante dans un réseau moléculaire contrôlant la prolifération et la mort cellulaires en réponse à des conditions potentiellement oncogènes, et un large éventail de modifications covalentes et d'interactions protéiques modulent les activités nucléaires et cytoplasmiques de p53. Les parents de p53, p73 et p63, sont intriqués dans le même réseau de régulation, étant soumis au moins en partie aux mêmes modifications et interactions qui transmettent des signaux sur p53, et contribuant activement à la sortie cellulaire résultante. L'image émergente est celle d'une voie interconnectée, dans laquelle toutes les protéines de la famille p53 sont impliquées dans la réponse au stress oncogène et aux intrants physiologiques. Par conséquent, les interacteurs communs et spécifiques des protéines de la famille p53 peuvent avoir un large effet sur la fonction et le dysfonctionnement de cette voie. De nombreuses années de recherche ont découvert un nombre impressionnant de protéines interagissant avec p53, mais on en sait beaucoup moins sur les interactions protéiques de p63 et p73. Pourtant, de nombreux interacteurs peuvent être partagés par plusieurs protéines de la famille p53, avec des effets similaires ou différents. Dans cette étude, nous passons en revue les interacteurs partagés des protéines de la famille p53 dans le but d'encourager la recherche dans ce domaine. traitement.

Inhibition de la croissance de cellules cultivées et d'un fibrosarcome implanté par des analogues de l'aroylhydrazone du complexe Gly-His-Lys-Cu(II). Biochem Pharmacol 1983 décembre 1532(24):3868-71.

Pickart L, Goodwin WH, Burgua W, Murphy TB, Johnson DK, Biochem. Pharmacol., 32, 1983, 3868-71.

Les aroylhydrazones de pyridoxal et de salicylaldéhyde, une série d'agents chélatants tridentés, sont de puissants inhibiteurs de la synthèse de l'ADN et de la croissance cellulaire dans un certain nombre de lignées cellulaires humaines et de rongeurs cultivées. Un complexe de cuivre (II) du plus puissant des chélateurs, le salicylaldéhyde benzoyl hydrazone (SBH), présente une activité inhibitrice significativement plus élevée que le SBH lui-même. Bien que les formes bioactives et le mécanisme d'action de ces agents soient incertains, leur activité cytotoxique peut égaler ou dépasser celle de nombreux chélateurs et chélates connus précédemment pour posséder de telles propriétés, y compris les composés utilisés en clinique. Le SBH et son complexe de cuivre sont relativement non toxiques pour les souris et montrent une certaine sélectivité dans leurs effets sur différents types de cellules. Il est possible que les aroylhydrozones de ce type et/ou leurs complexes métalliques puissent s'avérer être des agents thérapeutiques utiles.

Les analogues de l'hydrzone de la région de liaison au cuivre du GHK sont des inhibiteurs très puissants de la synthèse de l'ADN et de la croissance cellulaire. De plus, la cellule réparatrice des plaies, le fibroblaste, semble être exceptionnellement sensible à certains types d'inhibiteurs du complexe de cuivre. Cela rend difficile la préparation de complexes de cuivre régénérant les tissus puisque même certains types de complexes de cuivre peptidique inhibent les fibroblastes comme le font d'autres petits complexes tels que diéthylamine-cuivre et triéthylamine-cuivre.


GHK-Cu et analogues d'hydrazone de la région de liaison du cuivre GHK qui sont des inhibiteurs très puissants de la réplication cellulaire

En haut : région de liaison au cuivre de GHK

Milieu : PCPH-Cu (2-Pyridinecarboxaldéhyde 2''-pyridylhydrazone hydrazone cuivre(2+))

En bas : SBH-Cu (salicylaldéhyde benzoyl hydrazone cuivre(2+))

Concentrations de PCPH-Cu, SBH-Cu, Cisplatine et synthèse de bléomycine 50%

Types de cellules en culture PCPH-Cu
Nanogrammes par ml pour une réduction cellulaire de 50 % SBH-Cu
Nanogrammes par ml pour une réduction cellulaire de 50 % Cisplatine
Nanogrammes par ml pour une réduction cellulaire de 50 % Bléomycine
Nanogrammes par ml pour une réduction cellulaire de 50 % Fibroblastes humains normaux 0.00003 0.1 Pas fini - Rein humain normal 45 - - Fibrosarcome de souris 0.511 2.4 32 Cancer de la vessie chez l'homme 12 34 95 7 Cancer épithélial du poumon humain 580 410 870 44 Mélanome humain 0.05 270 6,000 80,000

Références sur la chimie du GHK-Cu

Études sur GHK, structure et activité. Une variété d'analogues de GHK-Cu ont été synthétisés et testés pour leur stimulation de la synthèse d'ADN.

Alors que de nombreux analogues similaires au GHK-Cu avaient une bioactivité, aucun n'égalait la bioactivité du GHK-Cu

Tripeptide plasmatique humain modulant la croissance : relation entre la structure moléculaire et la synthèse d'ADN dans les cellules d'hépatome. Pickart et Thaler FEBS Lett 1979, 104(1):119-22 Études en culture cellulaire des effets du GHK complexé avec du cuivre et du fer sur les modèles de croissance cellulaire. Observations expérimentales que le GHK est complexé avec les ions de métaux de transition Cu++ et Fe++ in vivo et peut exercer ses effets biologiques en tant que chélate de peptide-métal. Au pH physiologique in vitro, le GHK s'associe avec le cuivre ionique, le cobalt, le fer, le molybdène, le manganèse, le nickel , et le zinc, mais n'a aucune affinité pour le calcium, le manganèse, le potassium et le sodium. Le GHK agit en synergie avec le cuivre, le fer, le cobalt et le zinc pour modifier les schémas de croissance cellulaire dans les cultures monocouches. Ces métaux de transition induisent l'aplatissement cellulaire et l'adhésion aux surfaces de support, et inhibent la synthèse d'ADN et la production d'acide lactique lorsque la croissance est limitée par la réduction des concentrations sériques dans le milieu. Ces effets inhibiteurs sont neutralisés et l'adhésion et la croissance intercellulaires sont stimulées par la GHK en milieu à des concentrations nanomolaires. Cu et Fe sont les métaux les plus actifs lorsqu'ils sont combinés avec le GHK. GHK et métaux de transition, qui semblent former des complexes avant l'interaction avec les cellules. Tripeptide modulateur de croissance (glycylhistidyllysine) : association avec le cuivre et le fer dans le plasma, et stimulation de l'adhésivité et de la croissance des cellules d'hépatome en culture par des complexes tripeptide-ion métallique. Pickart et Thaler (Université de Californie, San Francisco, États-Unis) J Cell Physiol 1980, 102(2):129-39 Le GHK et le cuivre (II) transportent dans les cellules. L'association de GHK avec le cuivre et une similitude d'homologie entre le tripeptide et les sites de transport du cuivre sur l'albumine et l'alpha-foetoprotéine, où l'atome cuivrique est lié à un résidu histidyle adjacent à un résidu basique, a suggéré que GHK peut agir comme un transport de cuivre facteur. Il a été constaté que le GHK forme facilement des complexes avec le cuivre (II) et améliore l'absorption du métal dans les cellules en culture. Le tripeptide plasmatique modulant la croissance peut fonctionner en facilitant l'absorption du cuivre dans les cellules. Pickart, Freedman, Loker, Peisach, Perkins, Stenkamp et Weinstein Nature 1980, 288, 715-7 Un examen des informations sur les actions biologiques et les relations structure-fonction telles qu'elles étaient comprises en 1981. A cette époque, les actions chimiotactiques de GHK sur les globules blancs étaient inconnues. Il a été démontré que la glycylhistidyllysine (GHK), un tripeptide du plasma humain, modifie le taux de croissance de nombreux types de cellules et d'organismes dans les systèmes de culture. Le GHK est actif de manière optimale à des concentrations comprises entre 10 et 200 nanogrammes/millilitre. Les informations actuelles suggèrent que le GHK fonctionne comme un transporteur de métaux de transition, en particulier de cuivre, vers la surface cellulaire pour l'absorption dans la cellule. L'utilisation de la glycylhistidyllysine dans les systèmes de culture. Pickart In Vitro 1981,17(6):459-66 Détermination de l'efficacité de la chélation GHK pour le cuivre dans des conditions physiologiques. L'interaction entre Cu(II) et le tripeptide modulateur de croissance GHK en présence et en l'absence de L-histidine a été étudiée par titrage potentiométrique et spectrophotométrie d'absorption visible à 25 degrés C dans 0,15 M-NaCl. Des analyses dans la gamme de pH de 3,5 à 10,6 ont indiqué la présence de plusieurs espèces en solution dans le système binaire et des quantités importantes de complexes ternaires dans le système ternaire. La distribution des espèces et les constantes de stabilité ont été évaluées. Les résultats obtenus à partir des expériences de dialyse à l'équilibre ont montré que GHK était capable de rivaliser avec l'albumine pour Cu(II) à pH 7,5. À des concentrations équimolaires d'albumine et de peptide, environ 42 % du Cu(II) était lié au peptide.Aux concentrations physiologiquement pertinentes de Cu(II), d'albumine, de L-histidine et de ce peptide, environ 6 % du Cu(II) était associé aux composants de faible poids moléculaire. L'interaction du cuivre (II) et de la glycyl-L-histidyl-L-lysine, un tripeptide modulant la croissance du plasma. Lau et Sarkar Biochem J 1981 199 (3) : 649-56 Examen des interactions GHK-Métal Les preuves disponibles suggèrent que le GHK agit comme un complexe avec les métaux de transition Complexes peptidiques et protéiques de métaux de transition en tant que modulateurs de la croissance cellulaire. Pickart In : Chimie et biochimie des acides aminés, des peptides et des protéines (Marcel Dekker Pub.) 1982, 75-104. L'interaction de Cu(II) et Gly-His-Lys a été déterminée par 13C- et 1H-RMN et spectroscopie EPR. L'interaction de Cu(II) et de GHK, un tripeptide modulant la croissance du plasma, a été étudiée par 13C- et 1H-RMN et spectroscopie EPR. Le n.m.r. l'élargissement de la ligne a été interprété en termes d'espèces majeures et mineures formées en fonction du pH. L'élargissement de la ligne RMN a été interprété en termes d'espèces majeures et mineures formées en fonction du pH. Les paramètres EPR dans la plage de pH moyen, A parallèle = 19,5 mT et g parallèle = 2,21, cadrent bien avec l'affirmation selon laquelle Cu(II) est lié à Gly-His-Lys par un atome d'oxygène et trois atomes d'azote dans un carré- configuration planaire. N.m.r. et e.p.r. étude de l'interaction du cuivre(II) et de la glycyl-L-histidyl-L-lysine, un tripeptide plasmatique modulant la croissance. Laussac JP Haran R Sarkar B Biochem J 1983 fév 1209(2):533-9 Études de résonance magnétique du GHK et du cuivre Déterminer la stabilité du GHK-Cu en solution. Le GHK et le GHK-Cu échangent lentement du cuivre(II) en solution. Études PMR de l'interaction Cu(II) et Zn(II) avec la glycyl-l-histidyl-l-lysine et les peptides apparentés. Kwa E, Bor-Sheng L, Rose N, Weinstein B, Pickart L. Peptides 1983, 8, 805-808 Etudes sur la structure du GHK-Cu en solution. Des spectroscopies optiques, par résonance paramagnétique électronique et d'enveloppe d'écho de spin électronique ont été utilisées pour examiner la structure du complexe Cu(II) de la glycyl-L-histidyl-L-lysine (GHK) en solution.À pH neutre, la GHK forme un mononucléaire Composé Cu(II) 1:1 ayant un spectre RPE ressemblant à celui de Cu(II) coordonné équatoriale par deux ou trois atomes d'azote. Des études d'écho de spin électronique démontrent que l'un d'entre eux est situé dans le cycle histidyl imidazole. Un titrage du pH de Cu(II)-GHK montre trois transitions optiques avec des pK apparents de 3,6, 9,2 et 11,4 et des molécules, par rapport aux protons, de 2, 2 et 1, respectivement. Au pK le plus bas, le GHK se lie au Cu(II), formant les espèces présentes au pH physiologique. Ces études de solution sont cohérentes avec la coordination de l'azote de Cu(II) dans Cu(II)-GHK. Structure du complexe glycyl-L-histidyl-L-lysine cuivre(II) en solution. Freedman, Pickart, Weinstein, Mims et Peisach (Albert Einstein Medical School, New York, États-Unis) Biochimie 1982 21(19):4540-4

Détermination de la structure aux rayons X de cristaux aqueux de GHK-Cu.

La structure d'un complexe de cuivre du facteur de croissance glycyl-l-histidyl-l-lysine à une résolution de 1,1 angström. Perkins CM, Rose NJ, Weinstein B, Stenkamp RE, Jensen, LH, Pickart L. Inorg. Chem Acta 1984, 82, 93-99. Études des complexes de cuivre inhibiteurs cellulaires Une série d'analogues hydrophobes de la structure GHL-Cu a été synthétisée et testée. Les analogues hydrophobes de la structure GHL-Cu étaient inhibiteurs de la synthèse et de la croissance de l'ADN cellulaire Chélateurs cytotoxiques et chélates inhibition de la synthèse de l'ADN dans les cellules cultivées de rongeurs et humains par des analogues d'aroylhydrazone du complexe cuivre(II) gly-l-his-l-lys. Johnson, Pickart et Rose Inorg Chem Acta 67, p. 159-165, 1982 Synthèse d'analogues inhibiteurs de croissance de GHK-Cu. Une variété d'analogues inhibiteurs de croissance de liaison au cuivre de GHK-Cu très synthétisés et testés. Une variété d'analogues de liaison au cuivre de GHK-Cu avaient une puissante activité dans l'inhibition des fibroblastes et des cellules de fibrosarcome à des concentrations de 10exp (-16) M. Inhibition de la croissance de cellules cultivées et d'un fibrosarcome implanté par des analogues de l'aroylhydrazone du complexe Gly-His-Lys-Cu(II). Pickart, Goodwin, Burgua, Murphy et Johnson Biochem Pharmacol 1983, 32(24):3868-71 Un examen des informations sur les actions biologiques et les relations structure-fonction telles qu'elles étaient comprises en 1983. A cette époque, les actions chimiotactiques de GHK sur les globules blancs étaient inconnues. Les effets biologiques et le mécanisme d'action du tripeptide plasmatique glycyl-l-histidyl-l-lysine. Pickart Lymphokines 8, pp. 425-446, 1983 Études par résonance de spin électronique de l'action moléculaire des analogues de cuivre inhibiteurs de croissance de GHK-Cu avec des cellules. L'interaction de deux analogues cytotoxiques hydrophobes de GHK-Cu SBH-Cu (salicylaldéhydebenzol hydrazone-Cu) et PCPH-Cu (pyridine 2-carboxyl aldéhyde 2'-pyridyl hydrozonate-Cu) avec les cellules a été déterminée. SBH-Cu(II) et PCPH-Cu(II) interagissent d'abord avec les groupes sufhydyles dans les cellules. Le Cu(II) est d'abord réduit en Cu(I), puis réoxydé en Cu(II) Formation d'adduits entre les complexes cuivriques d'agents antitumoraux connus et les cellules d'ascite d'Ehrlich. Antholine, Lyman, Petering et Pickart (University of Wisconsin Milwaukee, USA) Biological and Inorganic Copper Chemistry, Adenine Press, pp. 125-137, 1985

Le GHK forme des complexes stables avec le palladium (II) La liaison du palladium par le GHK a été déterminée.

Conclusion : le GHK pourrait éventuellement participer au transport du Pd(II) dans les tissus et à son élimination par les reins

Études RMN sur les complexes binaires et ternaires de Pd(II) formés par le tripeptide glycylhistidyllysine et les nucléotides modulant la croissance. Laussac, Pasdeloup et Hadjiliadis J Inorg Biochem 30:227-38, 1987 Les auteurs ont caractérisé le mécanisme d'accumulation du cuivre par le cerveau, en utilisant des tranches de tissu hypothalamique de rat incubées avec 67Cu comme système modèle. Les deux processus étaient similaires en ce que chacun présentait : (a) une exigence de complexation du cuivre pour une accumulation optimale de 67Cu et (b) une large spécificité de ligand en ce qui concerne les acides aminés (histidine, cystéine, thréonine, glycine) et les peptides (Gly- His-Lys, glutathion) et l'inefficacité de l'albumine en tant que ligand facilitateur. Le tissu cérébral accumule 67cuivre par deux processus saturables dépendant du ligand. Un procédé à haute affinité, faible capacité et à faible affinité, haute capacité. Hartter et Barnea (Département d'obstétrique et de gynécologie, Centre des sciences de la santé de l'Université du Texas, Dallas, États-Unis) J Biol Chem 1988 Jan 15263(2):799-805 Etude de la dégradation de la GHK chez le rat Une méthode sélective et sensible de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) a été développée pour la détermination de la GHK. et son métabolite, la L-histidyl-L-lysine dans le plasma du rat. La limite de détection pour GHK et HK était de 50 et 15 ng/ml, respectivement, et les courbes d'étalonnage étaient linéaires dans la gamme 0,1-5,0 microg/ml. La méthode développée a été appliquée à l'étude pharmacocinétique de la GHK après administration d'une dose unique par voie intraveineuse à des rats. Le GHK a été rapidement dégradé en HK, qui a été rapidement éliminé. Dosage simultané de la glycyl-L-histidyl-L-lysine et de son métabolite, la L-histidyl-L-lysine, dans le plasma de rat par chromatographie liquide haute performance avec dérivatisation post-colonne. Endo, Miyagi et Ujiie (laboratoires pharmaceutiques, Kissei Pharmaceutical Co., Ltd., Minamiazumi, Nagano, Japon) J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997, 692(1) :37-42

Les expériences d'inversion du vieillissement et GHK

La découverte du GHK-Cu est née d'études sur le vieillissement humain et d'une recherche de méthodes pour inverser certains changements biochimiques délétères qui se produisent avec le vieillissement et s'intensifient chez les survivants d'une crise cardiaque. L'objectif initial était de trouver des méthodes pour réduire la concentration de la protéine sanguine fibrinogène. Le fibrinogène sanguin élevé réduit le flux sanguin à travers les tissus et augmente le taux de mortalité.

Des études sur le métabolisme du fibrinogène ont conclu qu'il y avait des facteurs dans la fraction d'albumine des protéines sanguines qui réduisaient la synthèse du fibrinogène et stimulaient fortement le métabolisme hépatique. Certains de ces effets étaient dus aux acides gras libres liés à l'albumine, mais l'analyse de cette fraction d'albumine a révélé un complexe tripeptide-cuivre (GHK-Cu) qui améliorait le métabolisme des cellules hépatiques et la survie en culture. La concentration plasmatique de GHK-Cu était plus élevée chez les hommes de 20 ans (

200 ng/ml) que chez les hommes de 70 ans (

80 ng/ml). En fin de compte, ce complexe de cuivre tripeptide (GHK-Cu) s'est avéré avoir de multiples actions qui ont activé la régénération et le remodelage des tissus. L'amélioration de la qualité et du renouvellement de la peau chez les personnes âgées par l'application de GHK-Cu pourrait être considérée comme un effet d'inversion du vieillissement.

Observation et question posée Type d'études Cause présumée au début des études. Résultat/Cause réelle Les références Les taux de fibrinogène dans le sang humain augmentent avec l'âge et la maladie - Cela augmente la coagulation sanguine et est associé à une forte augmentation du taux de mortalité.

Pourquoi le fibrinogène a-t-il été augmenté ?

Cause attendue - Le fibrinogène n'a pas été utilisé et s'est accumulé dans le sang

Cause réelle - Des études sur le renouvellement du fibrinogène humain ont révélé que l'augmentation du sang était due à une synthèse hépatique accrue de la protéine chez les personnes âgées et les survivants d'une crise cardiaque.

Pilgeram LO, Pickart, L Bandi, Z, Contrôle des acides gras du renouvellement du fibrinogène dans le vieillissement et l'athérosclérose. 7e Congrès international de gérontologie, juin 1964, pp. 451-460. Pickart L, Pilgeram LO. Le rôle de la thrombine dans la biosynthèse du fibrinogène. Hémorragie Thromb Diath. 1967 3117(3-4):358-64. Pilgeram LO, Pickart L. Contrôle de la biosynthèse du fibrinogène : le rôle des acides gras libres. J Atheroscler Res. 1968, 8 :155-66. Le fibrinogène est synthétisé dans le foie.

L'augmentation de la synthèse du fibrinogène observée chez les personnes âgées et les patients cardiaques était-elle due à des modifications du foie ou était-elle due à des facteurs sanguins qui perfusaient le foie ?

Mesurer la synthèse du fibrinogène dans le tissu hépatique humain isolé de personnes âgées de 20 à 30 ans et de personnes âgées de 60 à 80 ans. -80). p (60-80)

Supposer la cause - L'augmentation de la synthèse du fibrinogène avec l'âge était due à des modifications du tissu hépatique.

Cause réelle - L'augmentation de la synthèse du fibrinogène chez les personnes âgées n'était pas due à des modifications du tissu hépatique mais presque entièrement à des facteurs présents dans le sang plus âgé.

Pickart L, Thaler MM. Suppression de l'hyperfibrinogénémie associée aux tumeurs et de l'acidémie grasse libre avec le p-phénoxybenzalbutyrate (clofibrate). Cancer Rés. 1979 Oct39(10):3845-8. Pickart, L. Métabolisme des graisses, système fibrinogène/fibrinolytique et flux sanguin : nouveaux potentiels pour le traitement pharmacologique de la maladie coronarienne. Pharmacology 198123(5):271-80 Pickart L Suppression de la synthèse de phase aiguë du fibrinogène par un médicament hypolipémiant (clofibrate). Int J Tissue React. 1981 3(2):65-72.

Quel(s) facteur(s) dans le sang ont stimulé ou inhibé la synthèse du fibrinogène ? Étudié l'effet de diverses fractions de protéines plasmatiques affectant la synthèse du fibrinogène chez la souris. Non. La fraction d'albumine du plasma avait une action suppressive sur la synthèse du fibrinogène qui restituait les schémas synthétiques à ceux d'une personne plus jeune. Certains effets semblaient être dus aux acides gras libres, mais cette fraction d'albumine elle-même stimulait également le métabolisme des cellules hépatiques. Pickart L, Thaler MM. Acides gras, fibrinogène et flux sanguin : un mécanisme général de l'hyperfibrinogénémie et ses conséquences pathologiques. Med Hypothèses. 1980 6 mai (5) : 545-57. Pickart L, Thaler MM. Acides gras libres et albumine comme médiateurs de la synthèse du fibrinogène stimulée par la thrombine. Suis J Physiol. 1976 Apr230(4):996-1002. Quel était le facteur de la fraction d'albumine qui stimulait le métabolisme hépatique ? Étudie la protéine albumine et diverses petites molécules associées à la protéine.

Cause attendue - Les effets étaient dus à la molécule d'albumine.

Cause réelle - Les effets n'étaient pas dus à l'albumine mais plutôt à un petit complexe peptide-métal associé à la protéine.

Un tripeptide dans le plasma humain qui augmente la survie des hépatocytes et la croissance des cellules d'hépatome. Ph.D. Pickart Thèse en biochimie, Université de Californie, San Francisco, 1973 Thaler MM, Pickart L Propriétés métaboliques et favorisant la croissance du tripeptide sérique et de son analogue synthétique. Dans : Expression génique et carcinogenèse dans le foie cultivé. (Academic Press, 1975) pp. 292-310. Quelle était la structure du complexe peptide-métal ? Isolement et analyse chimique. Le complexe était composé d'un tripeptide, la glycyl-l-histidyl-l-lysine plus du cuivre 2+ approximativement équimolaire ou GHK-Cu Schlesinger DH, Pickart L, Thaler MM. Articles connexes, Protéine Le tripeptide sérique modulant la croissance est la glycyl-histidyl-lysine. Expérience. 1977 mars 1533(3) :324-5. Quelle était la fonction du GHK-Cu ? Variantes synthétisées de GHK-Cu qui ont inhibé la croissance cellulaire en culture cellulaire, la réparation des plaies et certaines tumeurs chez les animaux. Au cours d'études sur les analogues de cuivre inhibiteurs de croissance du GHK-Cu sur la cicatrisation des plaies, il a été observé que le GHK-Cu, qui était utilisé comme substance témoin, cicatrisait les plaies tandis que les inhibiteurs arrêtaient la cicatrisation des plaies. Il a été conclu que le GHK-Cu avait une action stimulante sur la cicatrisation des plaies. Pickart L, Lovejoy S. Activité biologique du facteur de croissance de liaison au cuivre plasmatique humain glycyl-L-histidyl-L-lysine. Méthodes Enzymol. 1987147 :314-28.

Le GHK-Cu reste la meilleure molécule pour les traitements médicaux internes. La fonction physiologique du GHK-Cu dans le corps humain semble être un signal protecteur et réparateur pour les tissus endommagés. Il est possible que le GHK-Cu puisse être utilisé en clinique pour protéger et accélérer la réparation des organes endommagés. H. Paul Ehrlich a découvert que l'injection intramusculaire de GHK-Cu dans le muscle de la cuisse de lapins augmentait les macrophages circulants de la plaie dans le sang et accélérait la cicatrisation des plaies distantes dans l'oreille du lapin. Les patients peuvent être prétraités avec du GHK-Cu avant la chirurgie pour améliorer la réparation post-chirurgicale. Sur la base de modèles de lapin, une dose de 30 milligrammes de GHK-Cu devrait suffire. La molécule est également très bénéfique sur la culture d'organes rénaux. Ainsi, le GHK-Cu pourrait être perfusé à des patients atteints d'insuffisance rénale pour exercer ses actions de protection et de réparation des tissus. Les cibles cliniques potentielles seraient des lésions ou une défaillance du système de tissus tels que la peau, les os, les reins et le tractus gastro-intestinal. Le GHK-Cu peut être administré après une lésion tissulaire traumatique telle que des accidents de voiture. Les nouveaux peptides de cuivre hautement adhésifs et résistants à la rupture en cours de développement devraient s'avérer meilleurs pour les utilisations cosmétiques et superficielles telles que la cicatrisation dermatologique post-opératoire et le développement d'interventions chirurgicales sans cicatrice. Les peptides de cuivre semblent être très utiles pour la récupération post-opératoire après les peelings cutanés, la dermabrasion et le resurfaçage au laser. La combinaison d'acides hydroxylés et de ces peptides lentement, sur une période de plusieurs mois, réduit les cicatrices anciennes et les lésions cutanées. Cette méthode est économique et évite les complications qui surviennent souvent après les peelings chimiques ou les traitements au laser. Dans les études expérimentales, l'utilisation de ces types de peptides de cuivre après des interventions chirurgicales entraîne souvent une cicatrisation sans cicatrice ou presque sans cicatrice.

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Discussion

La protéine de capside de norovirus VP1 contient des déterminants de l'encapsulation du génome et de l'assemblage des particules ainsi que de la pénétration et de l'entrée membranaires, représentant ainsi une partie de la machinerie moléculaire requise pour l'infection. Ici, nous avons défini structurellement l'interaction entre le domaine MNoV P et le récepteur d'entrée CD300lf nouvellement découvert, une interaction qui semble nécessiter une coordination interfaciale des ions métalliques. En outre, nous identifions ici les acides biliaires en tant que cofacteurs de l'infection par MNoV et établissons les déterminants structurels du domaine P utilisés dans l'engagement des acides biliaires GCDCA et LCA. Ces résultats sont étayés par une série d'essais biophysiques qui ont incorporé l'analyse des mutations basées sur la structure. Ces études structurelles et fonctionnelles ont des implications importantes pour notre compréhension de la biologie des norovirus.

Interactions entre le domaine P et son récepteur cellulaire CD300lf.

En raison de sa position sur la face externe de la capside virale et de son ciblage par des anticorps neutralisants (18 ⇓ ⇓ ⇓ –23, 29, 34, 35), le sous-domaine P2 était un candidat de choix pour l'engagement du récepteur CD300lf. Conformément à cela, nous montrons que CD300lf entre en contact avec une fente dans P2 formée par les boucles AB et DE, avec deux récepteurs écartés de l'interface dimère du domaine P (Fig. 1). Le calicivirus félin (FCV) et le calicivirus Hom-1 utilisent la molécule d'adhésion jonctionnelle A (JAM-A) et des protéines apparentées comme récepteurs (36, 37). La structure cryo-EM de la capside FCV en complexe avec les deux domaines extracellulaires de type Ig de fJAM-A indique que ce récepteur se lie également au sous-domaine P2, bien que les récepteurs semblent engager le haut du domaine P près de l'interface dimère ( 38). Cette même région proximale d'interface dimère de P2 est utilisée par certains norovirus humains pour lier les glycanes HBGA (25, 28, 39, 40). Nos données structurelles sont solidement étayées par une analyse de liaison quantitative (SPR, BLI et ITC), où la mutation de déterminants critiques dans les boucles CD300lf CRD3 et CC′ ainsi que des mutations dans la boucle AB du domaine P, la boucle DE et le brin E résultent toutes dans la perturbation des interactions.

La liaison de CD300lf au domaine P de MNoV a été puissamment bloquée en utilisant l'anticorps neutralisant A6.2.1. Les modèles cryo-EM suggèrent que le site de liaison A6.2.1 couvre à la fois les boucles AB et EF de P2, une conclusion étayée à la fois par des mutants d'échappement et des études de mutagenèse dirigée (21, 26, 34, 41). Cela prédit que le site de contact A6.2.1 chevauche le site de contact CD300lf sur le domaine P vu dans notre structure cocomplexe (Annexe SI, Fig. S6), soutenant fortement le concept selon lequel A6.2.1 inhibe l'infection par MNoV en bloquant l'attachement cellulaire. L'anticorps monoclonal 2D3.7 neutralise largement les souches MNoV et par cryo-EM se lie très près du site A6.2.1 bien qu'à un angle qui lui permet d'établir plus de contact avec les boucles AB et EF (21). Sur la base de nos études structurelles, il semble probable que 2D3.7 neutralise également MNoV en bloquant le site de liaison CD300lf.

Le rôle de la multivalence dans l'attachement cellulaire.

Le domaine MNoV P enfouit ∼630 Å 2 de surface accessible au solvant à l'interface de contact CD300lf, une zone nettement plus petite que celle enfouie dans de nombreuses autres interfaces récepteur-virus. Par exemple, la zone de contact enterrée par le VIH gp120 et son récepteur CD4 est 742 2 (42), entre le rhinovirus HRV14 et son récepteur ICAM-1 est ∼990 Å 2 (43), entre le coxsackievirus A21 et son récepteur ICAM-1 est 970 2 (44), et entre le poliovirus et le récepteur du poliovirus CD155 est ∼ 1 300 Å 2 (45).En cohérence avec cette petite zone de contact, l'affinité entre le domaine P et CD300lf est relativement faible avec un K de ∼25 M pour la liaison monotypique telle que mesurée en solution par ITC. La liaison de faible affinité observée entre le domaine P et CD300lf suggère que l'attachement cellulaire pourrait être induit par l'avidité, nécessitant que les domaines P sur un virion engagent simultanément plusieurs protéines CD300lf sur la surface cellulaire. Nous avons donc amarré la structure aux rayons X du complexe sur un modèle dérivé de cryo-EM de la particule MNoV. Nous avons constaté que les domaines CD300lf se regroupent par trois à la surface du virion (Fig. 7UNE). La distribution des contacts CD300lf peut être vue en retirant les molécules CD300lf du modèle (Fig. 7B). Cette distribution indique clairement que chaque cluster CD300lf est composé de récepteurs de trois dimères différents du domaine P (Fig. 7C). Ce modèle d'amarrage entraîne un chevauchement mineur des domaines CD300 (Fig. 7C), qui peut être résolu par la mobilité des domaines P, qui sont connectés de manière flexible au domaine shell de VP1. Ces résultats prennent en charge un modèle dans lequel plusieurs engagements CD300lf peuvent être effectués par chaque virion pour piloter la liaison et l'entrée MNoV. Nous avons entrepris plusieurs études de liaison à l'aide d'une protéine de fusion Fc-CD300lf, révélant que le réactif bivalent peut lier le domaine P recombinant et le MNoV à partir de lysats cellulaires infectés avec une avidité au moins 50 fois supérieure aux affinités de liaison monotypiques que nous avons observées. Parce que nos données sont plus cohérentes avec un besoin d'interactions multivalentes entre le domaine P et plusieurs récepteurs CD300lf de surface cellulaire, la force de ces interactions bivalentes peut être physiologiquement pertinente.

Amarrage du complexe de domaine CD300lf-P sur un modèle dérivé de cryo-EM du virion MNoV. (UNE) Les surfaces accessibles aux solvants du CD300lf sont indiquées en jaune, avec les sous-unités du domaine P en bleu et vert. Les domaines CD300lf se groupent par trois à la surface du virion. Chaque trimère CD300lf est composé de récepteurs de trois dimères différents du domaine P. (B) Les contacts du CD300lf cartographiés en jaune sur la surface du modèle après avoir retiré le CD300lf. Les symétries quintuple, triple et double sont respectivement marquées d'un pentagramme, d'un triangle ou d'une ellipse blancs. (C) (Droit) Une vue de haut en bas (même orientation que dans UNE) pour trois dimères P dans un groupe de trimères avec la région de la coquille ci-dessous en bleu. (La gauche) Une vue latérale des trois dimères P. Notez comment les terminaisons CD300lf C (marquées par des cylindres rouges) se regroupent au centre de chaque trimère et se chevauchent légèrement. Les ovales magenta avec une lettre blanche B marquent des poches de liaison d'acide biliaire visibles.

Mimétisme moléculaire par MNoV dans l'engagement des récepteurs.

Notre structure de CD300lf en complexe avec la phosphocholine a défini le site de liaison du ligand hôte utilisé par le récepteur. Le groupe de tête de ligand est orienté de sorte que la queue d'acide gras s'étende hors de la poche loin de la surface cellulaire portant CD300lf, conformément à la fonction de CD300lf en tant que récepteur lipidique. L'orientation du ligand et la coordination des métaux sont très similaires à celles utilisées par TIM-4, une molécule de régulation immunitaire apparentée, pour lier la phosphatidylsérine (Annexe SI, fig. S8) (46). En comparant les structures CD300lf liées à la phosphocholine ou au domaine MNoV P, nous avons révélé avec des détails atomiques précis comment la capside virale imite la liaison d'un ligand CD300lf et le rôle des cations divalents dans ces deux processus. Cette forme de mimétisme moléculaire prédit que l'interaction entre le domaine P et CD300lf pendant l'infection serait incompatible avec la liaison simultanée de ligands à la poche de liaison lipidique de CD300lf, suggérant que l'infection pourrait être régulée par des ligands de récepteurs de haute affinité. Les ligands bactériens peuvent également se lier aux membres de la famille CD300 (10), ce qui soulève la possibilité que les interactions entre les bactéries et le virus puissent impliquer la liaison de ligands à CD300lf qui à leur tour entrent en compétition pour les interactions avec le domaine P.

Le rôle de la bile dans l'infection MNoV.

Nous avons précédemment montré qu'une liaison efficace du MNoV aux cellules et à l'infection nécessite un cofacteur sérique stable à la chaleur de faible poids moléculaire (5). Ici, nous montrons que l'acide biliaire GCDCA peut servir de cofacteur en augmentant la liaison cellulaire et l'infection. Nous ne savons pas si le GCDCA est responsable de l'activité initialement observée dans le sérum. Le rôle de cet acide biliaire est susceptible d'impliquer une liaison directe à la protéine de capside virale car nos structures cristallines du complexe de domaine CD300lf-P lié à la fois avec GCDCA et LCA ont révélé deux poches de liaison par dimère de domaine P pouvant accueillir ces acides biliaires. L'emplacement de la poche d'acide biliaire était surprenant pour plusieurs raisons. Premièrement, la poche d'acides biliaires est éloignée de l'interface du domaine CD300lf-P, ce qui suggère que si les acides biliaires fonctionnent en modifiant l'interaction du domaine CD300lf-P, cela doit être via un effet allostérique à longue distance. Deuxièmement, la poche d'acides biliaires est distincte des sites de liaison aux glycanes observés sur les domaines P des norovirus humains et murins (25, 40), ce qui suggère que les domaines P des norovirus sont de promiscuité dans leur capacité à se lier à diverses petites molécules biologiques et affirmant en outre que l'interaction entre les norovirus et les cellules cibles est régulée à plusieurs niveaux. Il semble probable que l'efficacité de l'infection par les norovirus des cellules en culture nécessite que chacun de ces différents niveaux de contrôle soit parfaitement adapté pour éviter une infection abortive. Troisièmement, la liaison de GCDCA et LCA au domaine P MNoV n'a pas induit de réarrangements structurels significatifs dans le domaine P ou dans l'interface CD300lf. Nous avons constaté que l'ajout de GCDCA avait un effet faible (environ deux fois) mais reproductible sur la liaison du CD300lf soluble au domaine P en présence de cations divalents. Il est possible que ce petit effet, additionné aux nombreuses copies du domaine P sur le virion, ait une signification biologique. Cependant, ceci est spéculatif, et le mécanisme moléculaire de la fonction cofacteur reste une question ouverte. Il est intéressant de considérer que les acides biliaires, plutôt que de moduler directement les interactions récepteur:domaine P, modifient plutôt les conversions structurelles qui se produisent lorsque le virus pénètre dans la cellule pour libérer son ARN dans le cytoplasme ou la conformation du virion lui-même d'une manière non détectée. en proposant des études du domaine P et du CD300lf en solution.

Nous avons également constaté que l'ajout de calcium et de magnésium augmente également l'infection. Nos données structurelles indiquent qu'il existe au moins trois sites de liaison de cations divalents associés à la liaison de CD300lf à chaque monomère de domaine P. Deux d'entre eux se trouvent dans l'interface de liaison entre le domaine P et CD300lf et facilitent probablement l'interaction. Un troisième ion métallique est situé à mi-chemin entre le récepteur et les sites de liaison aux acides biliaires du domaine P, ne participant directement à aucune interaction. Les structures cristallines et la liaison ITC du domaine MNoV P avec CD300lf ont montré que le magnésium ou le calcium peuvent favoriser la formation de complexes. D'un intérêt particulier, le Ca 2+ est présent en concentrations élevées dans la bile (47), ce qui rend raisonnable l'hypothèse que le calcium pourrait être présent sur les sites d'infection par MNoV (48). Il est intéressant de supposer que la disponibilité de cations divalents dans le corps, qui peuvent ne pas être disponibles dans l'environnement, pourrait favoriser l'infectiosité du virus une fois qu'il atteint sa cible.

Implications de ces études.

Ces études soutiennent le concept selon lequel les norovirus ont évolué pour dépendre de petites molécules soit par mimétisme moléculaire des lipides de l'hôte, soit en dépendant de cofacteurs tels que les acides biliaires et les cations divalents pour les étapes critiques de l'infection. Physiologiquement, il est intéressant de considérer que la présence d'acides biliaires et de Ca 2+ dans l'intestin en aval de la voie biliaire principale, associée au tropisme du virus pour les cellules tuft comme seule cellule épithéliale exprimant CD300lf (7), explique la tropisme du virus. Cela s'ajoute à la découverte antérieure selon laquelle le tropisme des cellules touffues est conféré par les effets combinatoires de la cytokine hôte IFNλ et de la protéine non structurale MNoV NS1 (49). En outre, bien que nous n'ayons pas pu observer de manière reproductible un effet de l'ajout de LCA sur la liaison ou l'infectivité en raison de problèmes de solubilité, cet acide biliaire secondaire peut également se lier au domaine MNoV P dans la poche utilisée par GCDCA. Cela indique que les acides biliaires secondaires pourraient jouer un rôle physiologiquement important in vivo. Cependant, l'amélioration semble être assez spécifique car plusieurs autres acides biliaires n'augmentent pas l'infection. Parce que nous n'avons pas échantillonné de manière exhaustive les acides biliaires primaires et secondaires dans l'intestin, il est tout à fait possible que des cofacteurs supplémentaires ou même des inhibiteurs de l'infection à norovirus soient découverts à l'avenir.

En plus d'identifier que le domaine P du norovirus interagit avec un cofacteur soluble, les études structurelles présentées ici soulèvent la possibilité de concevoir des analogues d'acides biliaires biodisponibles par voie orale efficaces pour le traitement de l'infection humaine à norovirus, qui s'est également avéré être amélioré par la bile ( 30). De plus, nous avons précédemment montré que les bactéries intestinales jouent un rôle essentiel dans l'établissement d'une infection entérique persistante à MNoV (50). Étant donné que les bactéries intestinales sont impliquées dans la métabolisation des acides biliaires primaires en acides biliaires secondaires, cela soulève la possibilité que les interactions transroyales entre les norovirus et les bactéries entériques se fassent via des altérations des acides biliaires dans l'intestin. En effet, les antibiotiques à large spectre pourraient modifier l'infection à norovirus via des altérations du métabolisme des acides biliaires (50, 51).


Méthodes

Déclaration d'éthique

Tous les participants ont fourni un consentement éclairé écrit. Ce protocole a été approuvé par le Conseil d'examen institutionnel du Centre de recherche sur le cancer Fred Hutchinson, le Comité de recherche et d'éthique de l'École de médecine de l'Université Makerere (SOMREC) et le Conseil national ougandais pour la science et la technologie (UNCST).

Cohorte d'étude et prélèvement d'échantillons

Des échantillons ont été obtenus auprès de participants inscrits à l'étude « HIPPOS », une étude de cohorte prospective en cours, commencée en 2012, de patients atteints de SK commençant un traitement à l'Uganda Cancer Institute (UCI) à Kampala, en Ouganda. Les participants étaient éligibles pour l'étude HIPPOS s'ils étaient âgés de plus de 18 ans avec un SK prouvé par biopsie, et naïfs de traitement antirétroviral (TAR) et de chimiothérapie au moment de l'inclusion. Les participants ont assisté à 12 visites d'étude sur une période d'un an et ont reçu un traitement pour le SK consistant en un TAR et une chimiothérapie (une combinaison de bléomycine et de vincristine ou de paclitaxel) selon les protocoles standard des médecins de l'UCI. À chaque visite, les participants ont reçu un examen physique détaillé pour évaluer la réponse clinique à l'aide des critères de réponse ACTG KS [57].

Les participants ont fourni des échantillons de plasma à chaque visite pour les tests de charge virale KSHV, CD4 et VIH, et en outre, ont fourni jusqu'à 12 biopsies de lésions KS avant, pendant et après le traitement KS. Les biopsies de tumeur KS ont été obtenues à l'aide d'outils de biopsie au poinçon de 4 mm après avoir nettoyé la peau avec de l'alcool, et soit congelées sur le site de la clinique et stockées dans de l'azote liquide (LN2), soit placées dans RNAlater (Sigma-Aldrich, Cat. # R0901) et stockées à -80°C. Les cliniciens de l'étude ont prélevé des écouvillons de la muqueuse buccale à chaque visite d'étude et les participants ont auto-collecté des écouvillons buccaux à domicile pendant 1 semaine après la visite après avoir été informés sur la technique de prélèvement d'échantillons, comme précédemment validé par notre groupe en Ouganda [58]. En bref, un écouvillon en Dacron est inséré dans la bouche et frotté vigoureusement le long de la muqueuse buccale, des gencives et du palais dur. L'écouvillon est ensuite placé dans 1 mL de tampon de digestion stérilisé par filtre [59] et conservé à température ambiante [60] avant d'être placé à -20°C pour le stockage.

Préparation de l'ADN

L'ADN a été extrait de 300 L de lysats tumoraux homogénéisés à l'aide du kit AllPrep DNA/RNA Mini (QIAGEN, Cat. # 80204) et élue dans 100 L de tampon EB. Pour les échantillons sur écouvillon buccal, l'ADN a été extrait de l'éluat de la pointe de l'écouvillon à l'aide du kit QIAamp Mini (Qiagen, réf. 51304) en suivant le protocole du fabricant. La purification de l'ADN de la salive stabilisée dans RNAprotect Saliva Reagent (Qiagen) a été effectuée selon le protocole du fabricant avec les modifications suivantes : il n'y a pas eu de granulation initiale ni de lavage PBS, 20 L de protéinase K ont été utilisés pour 200 L d'échantillon et l'ADN a été élué dans 50 L d'eau. L'ADN a été quantifié à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop 1000 (ThermoScientific).

Toutes les préparations PCR ont été effectuées dans une salle blanche PCR, à l'exception de l'ajout de modèles de contrôle. La PCR a été réalisée en utilisant le kit PrimeSTAR GXL (Takara, Cat. # R050B) avec ThermaStop (Thermagenix) ajouté. Les conditions de cyclage étaient : 98°C pendant 2 min 35 cycles de 98°C pendant 10 s, 60–65°C (selon l'amorce) pendant 15 s, 68°C pendant 1 min/kb 68°C pendant 3 min puis maintenir à 4°C. Les séquences d'amorces sont répertoriées dans Tableau S1.

Chiffrage du nombre de copies

Le nombre de copies du génome KSHV a été quantifié par PCR numérique par gouttelettes (ddPCR) à l'aide du générateur et lecteur de gouttelettes QX200 (Bio-Rad), avec ddPCR SuperMix for Probes (pas de dUTP) (Bio-Rad, Cat. # 186-3024). Amorces et sondes (Tableau S1) ont été conçus pour détecter 4 gènes uniques de KSHV K2/vIL-6, ORF16/vBCL-2, ORF50/RTA et ORF73/LANA (Figure 1A), avec le nombre de copies du génome KSHV indiqué comme la moyenne des 4 mesures. 420 ng d'ADN de lignée cellulaire BCBL-1 dilué au 1:10 000 (

475 copies du génome) a été utilisé comme contrôle positif, 1 ng d'ADN génomique humain (Bioline, Cat. # BIO-35025) comme contrôle négatif et de l'eau comme contrôle sans matrice. Les conditions de cycle étaient : 95°C pendant 10 min 40 cycles de : 94°C pendant 30 s, 56°C pendant 30 s, 60°C pendant 1 min un cycle à 98°C 10 min, puis maintenir à 12° C. Le pourcentage de KSHV sur la cible a été calculé en utilisant la quantification du nombre de copies par ddPCR normalisée à la concentration totale d'acide nucléique.

(A) Représentation schématique d'un génome linéaire de KSHV, avec des gènes colorés en vert et les principales régions de répétition en orange. Les emplacements des gènes K1, vIL-6, vBCL-2, RTA, LANA et K15 utilisés pour la quantification du génome sont indiqués en caractères verts. (B) Couverture de lecture brute (bleu clair), sUMI-consensus (bleu) et dUMI-consensus (bleu foncé) le long de la de novo assemblé, génome BCBL-1 KSHV. (C) Graphique à bulles de variantes de séquences mineures. Chaque bulle représente une position dans le génome à laquelle une base variante ou un indel a été détecté, colorée selon qu'il s'agissait de mutations silencieuses ou modifiant les protéines. Les mutations susceptibles d'être silencieuses comprenaient des mutations ponctuelles synonymes et intergéniques, tandis que les mutations modifiant les protéines comprenaient des mutations non synonymes, non-sens et de décalage du cadre de lecture. La hauteur de la bulle représente la fréquence de base variable parmi les lectures dUMI-consensus à cette position. Les colonnes grises verticales représentent les régions répétées masquées dans lesquelles aucun alignement fiable n'était possible.

Ajout d'UMI et préparation de la bibliothèque (Fig 2)

Des fragments d'ADN de 500 pb, 10 à 20 ng/μL d'extrait d'ADN dans 100 L de tampon TLE réfrigéré (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) ont été cisaillés à l'aide d'un Bioruptor (Diagenode) à haute puissance pendant jusqu'à 15 min. Les tailles des fragments ont été évaluées sur des gels d'agarose à 1,5 %. L'ADN cisaillé a été purifié par billes en utilisant un volume de 1,2X de billes Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter Cat. # A63880) et élue dans 50 L d'eau. La préparation de la bibliothèque (réparation des extrémités, queue A et ligature de l'adaptateur) a été réalisée à l'aide du kit de préparation de bibliothèque KAPA HyperPrep (Cat. # KR0961/KK8503). Les adaptateurs d'ADN double brin contenaient une séquence dUMI aléatoire de 12 pb et une séquence d'espacement définie de 5 pb ajoutée aux séquences d'adaptateur Illumina TruSeq [61] (S1 Figue). Par la suite, l'ADN a été purifié par billes avec un volume de billes 1X et élue dans 50 L d'eau.

Chaque participant à l'étude a contribué à plusieurs tumeurs SK et écouvillonnages oraux, mais seuls les échantillons présentant les charges virales les plus élevées ont été signalés ici. Des bibliothèques de séquençage ont été préparées à partir d'extraits d'ADN de chaque échantillon avec des adaptateurs contenant des identifiants moléculaires uniques duplex (dUMI, voir S1 Figue). Des bibliothèques d'ADN marquées par adaptateur ont été enrichies à l'aide d'appâts d'ARN biotinylés homologues aux séquences de KSHV. L'ADN capturé a été amplifié par PCR à des niveaux suffisants pour le séquençage Illumina HiSeq. Pour la plupart des échantillons, les bibliothèques ont été soumises à un deuxième cycle d'enrichissement et d'amplification par PCR. Lors du séquençage, les génomes entiers de KSHV ont d'abord été assemblés de novembreo à partir de chaque échantillon sans l'utilisation de dUMI. Les génomes spécifiques à l'échantillon générés (échantillon-consensus) ont ensuite été utilisés comme référence pour cartographier le consensus des lectures avec des balises dUMI identiques (c'est-à-dire des lectures dUMI-consensus).

Les bibliothèques d'ADN ont été soumises à une amplification de pré-enrichissement avec les amorces mws13 & mws20 (Tableau S1 et S1 Figue). Les conditions de PCR étaient : 95°C 4 min 5-8 cycles de 98°C 20 s, 60°C 45 s, 72°C 45 s 72°C 3 min, maintien à 4°C. Si l'élution purifiée par billes de l'étape de réparation finale et d'adaptation avait plus de 240 ng au total, elle était divisée en 50 L de réactions PCR de 240 ng et regroupées après amplification. Les produits PCR ont ensuite été purifiés par billes comme ci-dessus avec des billes de volume 1,2X et élués dans 100 L d'eau, quantifiés avec Nanodrop, et leurs tailles évaluées à l'aide d'un Bio-analyseur (Agilent DNA 7500) ou Qiaxcel (QIAGEN AM420).

Enrichissement de la bibliothèque et séquençage des amplis

Les appâts à ARN biotinylé pour enrichir les séquences de KSHV dans la bibliothèque étaient ceux conçus dans [62] et ont été obtenus auprès d'Agilent, Inc. (Santa Clara, CA). La conception était un pavage de 120 pb, 12X du génome de l'isolât de KSHV GK18 (Genbank ID : AF148805.2). La diversité de la bibliothèque d'appâts a été encore augmentée en incluant les séquences K1, ORF75, K15, ORF26 et TR des souches JSC-1 (Genbank ID : GQ994935.1), DG1 (Genbank ID : JQ619843.1), BC-1 (Genbank ID : U75698.1), BCBL-1 (ID Genbank : HQ404500.1), Sau3A (ID Genbank : U93872.2), et de tous les isolats occidentaux et africains dans [29,33] (ID Genbank : AF130259, AF130266, AF130267, AF130281, AF130305, AF133039, AF133040, AF133043, AF133044, AF151687, AF171057, AF178780, AF178810, AF220292, AF220293, AY329032, KT271453-KT271468).

L'enrichissement de la cible a été effectué à l'aide du kit d'enrichissement de la cible SureSelect v1.7 (Agilent) avec tous les volumes suggérés réduits de moitié. L'ADN hybride à des appâts à ARN biotinylé a été capturé avec des billes de streptavidine (Dynabeads MyOne Streptavidin T1, Invitrogen) et remis en suspension dans 20 μL d'eau. Le mélange de billes d'ADN et de streptavidine a été utilisé directement dans l'amplification PCR post-enrichissement avec les amorces mws13 et mws21, cette dernière comprenant une séquence d'index d'échantillon (Tableau S1 et S1 Figue). Le nombre de cycles de PCR variait de 10 à 16, avec des produits contrôlés tous les 2 à 3 cycles sur une TapeStation (Agilent) pour garantir des tailles de fragments correctes (

500 pb). Lorsque la suramplification a entraîné des tailles de fragments de bibliothèque beaucoup plus grandes que prévu, un seul cycle de PCR de « reconditionnement » avec des réactifs frais a été effectué [63]. Les produits de PCR ont été nettoyés à l'aide de billes AMPure XP de volume 1,2X et la banque d'ADN éluée a été séquencée à l'aide d'Illumina HiSeq 2500 avec des lectures d'extrémité appariées de 100 pb.Pour certains échantillons de tumeur avec un faible nombre de copies de KSHV et tous les échantillons d'écouvillonnage buccal, un deuxième enrichissement de la bibliothèque a été effectué.

De novo assemblage de génomes échantillon-consensus

Initialement, un échantillon-consensus du génome du KSHV (Figure 2) a été généré de novo à partir de lectures appariées de chaque échantillon à l'aide de scripts personnalisés (S2 Fig, https://github.com/MullinsLab/HHV8-assembly-SPAdes). A ce stade, les 17 premières pb des extrémités de lecture ont été coupées pour éliminer les séquences dUMI. Ensuite, les lectures ont été soumises à un filtrage de qualité fenêtré en utilisant faucille pe [64] avec un seuil de qualité de 30 et une taille de fenêtre de 10 % de la longueur de lecture. Les lectures filtrées ont été alignées sur un génome humain (GRCh38 p12, GenBank GCA_000001405.27) en utilisant bwa mem [65]. Les lectures non mappées ont été utilisées comme entrée dans l'assembleur de novo SPAdes v3.11.1 [66], avec le paramètre -k 21,35,55,71,81. Cela a souvent donné 3 à 4 échafaudages qui, ensemble, englobaient l'ensemble des régions de séquence unique de 131 kb de KSHV, délimitées par les principales régions de répétition : répétition interne 1 (IR1), répétition interne 2 (IR2), répétition centrale LANA et répétitions terminales (TR ) (Figure 1A). Ensuite, tous les échafaudages de plus de 500 pb ont été alignés en utilisant bwa mem au génome de l'isolat KSHV de référence GK18. À partir des échafaudages alignés, un projet de génome a été généré dans Geneious (Biomatters, Ltd) avec une correction manuelle si nécessaire. Pour terminer l'assemblage, GapFiller v1.1 [67] a été utilisé, en définissant bwa comme l'aligneur et les paires filtrées se lisent comme la bibliothèque d'entrée. Les génomes ont été annotés dans Geneious sur la base de la référence GK18, en ajoutant également l'annotation pour l'ARN long non codant T1.4 sur la base de [68]. Les principales régions de répétition ont été masquées avec Ns car elles étaient mal résolues par l'assemblage de lectures courtes pouvant être mappées à plusieurs emplacements dans les régions de répétition.

Identification des variantes à partir des lectures dUMI-consensus

Les lectures appariées, y compris leurs balises de séquence dUMI, ont été mappées par bwa pour échantillonner des génomes consensuels (Figure 2) en utilisant un Makefile adapté de [61] (https://github.com/MullinsLab/Duplex-Sequencing). En bref, toutes les lectures mappées à la même position génomique ont été réduites par des UMI simple brin (sUMI) pour faire des lectures sUMI-consensus (S2 Fig). Les balises UMI complémentaires des brins opposés ont été appariées pour créer des lectures dUMI-consensus, supprimant ainsi presque tous les artefacts de mauvaise incorporation de polymérase PCR et de chimères. Neuf bases des deux extrémités de lecture ont ensuite été rognées pour minimiser les artefacts de fin de lecture. Les écarts entre les lectures de consensus dUMI cartographiées et les génomes de consensus d'échantillons ont été inspectés manuellement dans Geneious et les désalignements autour des analyses d'homopolymères ont été corrigés. Seules les divergences restantes ont été considérées comme des variants de séquence qui existaient avant l'amplification par PCR.

Tous les alignements de séquences de génomes et de sous-génomes ont été générés à l'aide de MAFFT [69] [algorithme FFT-NS-i x1000, matrice de notation 1PAM/k = 2], et tous les arbres phylogénétiques ont été déduits à l'aide de RAxML [70] (-fd, GTR gamma, N = 100 arbres de départ), en utilisant un génome KSHV représentatif de chaque individu. Le réseau phylogénétique NeighborNet a été généré à l'aide de SplitsTree5, en excluant les sites de brèche [71]. Les séquences du génome consensus ont été déposées dans GenBank (numéros d'accès MT510648—MT510670, MT936340, voir Tableau 1) annoté avec les réarrangements génomiques, lorsqu'ils sont présents.

Analyse d'intégration

Des recherches systématiques pour l'intégration de KSHV dans le génome humain ont été effectuées de deux manières. Tout d'abord, chaque bibliothèque a été recherchée en utilisant BLASTN local contre les séquences humaines et KSHV, puis en utilisant le script Perl SummonChimera [72] pour extraire les coordonnées des sites d'intégration potentiels. Deuxièmement, un échantillon de génome de KSHV consensuel a été ajouté en tant que chromosome supplémentaire à la référence du génome humain GRCh38 p12. La référence du génome humain jointe a été utilisée pour cartographier les lectures consensuelles sUMI via Speedseq [73] pour générer des fichiers d'alignement avec uniquement des lectures discordantes ou fractionnées. Ceux-ci ont été entrés dans LUMPY pour l'analyse des variantes structurelles [74]. Les séquences chromosomiques humaines liées aux séquences KSHV ont été considérées comme des sites d'intégration putatifs.


Structure de l'ADN

Dans les années 1950, Rosalind Franklin, Maurice Wilkins, Francis Crick et James Watson étudiaient activement la structure moléculaire de l'ADN. Franklin utilisait la cristallographie aux rayons X dans le laboratoire de Wilkins pour observer les motifs formés par les rayons X tirés à travers les fibres d'ADN cristallisées. Watson et Crick ont ​​pu reconstituer le puzzle en utilisant les données de Franklin et des informations clés sur l'appariement des nucléotides dans une molécule d'ADN. En 1953, Wilkins et Franklin ont publié des articles sur leurs données radiographiques dans le même La nature problème avec l'article de Watson et Crick sur la structure de l'ADN. Franklin est décédée d'un cancer en 1958, et bien que les recherches de Franklin sur les virus aient été appréciées de son vivant, ses contributions à la découverte de la structure de l'ADN ont été largement reconnues à titre posthume. En 1962, le prix Nobel de physiologie ou médecine a été décerné à Watson, Crick et Wilkins pour avoir résolu la structure de l'ADN.

ADN, ou acide désoxyribonucléique, est le matériel héréditaire chez l'homme et presque tous les autres organismes. Presque toutes les cellules du corps d'une personne ont le même ADN. La majorité de l'ADN se trouve dans le noyau de la cellule (où il est appelé ADN nucléaire ), mais une petite quantité d'ADN peut également être trouvée dans les mitochondries (où on l'appelle ADN mitochondrial ou ADNmt). Le complément complet d'ADN d'une cellule est appelé son génome. Normalement, les molécules d'ADN sont des molécules linéaires à double brin, filiformes, liées à des protéines dans le noyau de chaque cellule. Étirées de bout en bout, les molécules d'ADN dans une seule cellule humaine sont estimées à environ 6 pieds de longueur.

Les informations contenues dans l'ADN sont stockées sous la forme d'un code composé de quatre bases chimiques : adénine (UNE), guanine (G), cytosine (C), et thymine (T). L'ADN humain se compose d'environ 3 milliards de bases, et plus de 99% de ces bases sont les mêmes chez tous. L'ordre ou la séquence de ces bases détermine les informations disponibles pour la construction et le maintien d'un organisme, de la même manière que les lettres de l'alphabet apparaissent dans un certain ordre pour former des mots et des phrases.

Les bases de l'ADN s'apparient les unes aux autres, l'adénine avec la thymine (A-T) et la cytosine avec la guanine (C-G), pour former des unités appelées paires de bases. Chaque base est également attachée à une molécule de sucre et à une molécule de phosphate. Ensemble, une base, un sucre et un phosphate sont appelés un nucléotide. Les nucléotides sont disposés en deux longs brins qui forment une échelle en spirale appelée double hélice. La structure en échelle de la double hélice est formée avec les paires de bases comme barreaux et les molécules de sucre-phosphate comme pièces latérales verticales (Figure 2.12).

Une propriété importante de l'ADN est qu'il remplit deux fonctions : se répliquer, ou faire des copies de lui-même, et produire des protéines. Pendant réplication (Figure 2.13), chaque brin d'ADN de la double hélice peut servir de motif pour dupliquer la séquence de bases. Ceci est essentiel lorsque les cellules se divisent, car chaque nouvelle cellule doit avoir une copie exacte de l'ADN présent dans l'ancienne cellule. La réplication de l'ADN commence par la séparation des liaisons qui maintiennent les paires de bases ensemble dans le brin parent, créant deux brins matrices.

Graphique 2.12 : Différentes structures chimiques de l'ADN et de l'ARN

Figure 2.13 : Processus de réplication de l'ADN résultant en deux molécules d'ADN complètes

Les bases non appariées sur les brins matrices s'attirent et se lient aux nucléotides libres complémentaires dans des directions opposées. Lorsque toutes les nouvelles paires de bases sont formées sur chaque brin, la réplication est terminée et il y a maintenant deux molécules d'ADN complètes.

Il y a un deuxième acide nucléique dans toutes les cellules appelé acide ribonucléique, ou ARN (Figure 2.12). Comme l'ADN, l'ARN est composé de nucléotides comprenant une base, du sucre et du phosphate. Les nucléotides d'ARN contiennent les bases chimiques adénine, cytosine et guanine, mais ils ne contiennent pas de thymine, qui est plutôt remplacée par uracile (U). De plus, l'ARN existe sous la forme d'une molécule simple brin plutôt que d'une hélice double brin. Cette molécule joue un rôle clé dans le transport des acides aminés pour la construction de la chaîne protéique lors de la synthèse des protéines.

Lors de la production de protéines, les bases d'ARN sont disposées en séquences de trois, appelées codons. Ces séquences déterminent l'assemblage des différents acides aminés. Par exemple, la combinaison et l'arrangement de la thymine, de l'adénine et de la guanine codent pour l'acide aminé isoleucine, qui aide à reconstruire le tissu musculaire. Les acides aminés se réunissent en chaînes pour produire différentes protéines, qui sont des composés chimiques nécessaires à la structure et aux processus opérationnels des cellules du corps. Il existe 20 acides aminés différents qui peuvent se réunir dans différentes combinaisons et quantités pour produire des millions de protéines différentes fondamentales à la vie.


Fond

Maïs (Zea mays) est l'une des cultures les plus plantées au monde, utilisée pour la consommation humaine, l'alimentation animale et comme matière première pour les biocarburants et autres produits (examiné dans [1]). En plus de son importance agricole, le maïs est une plante modèle pour la génétique des monocotylédones, avec des séquences génomiques complètes de B73 [2] et 34 autres génomes de maïs déposés dans Maize Genetics and Genomics Database (maizeGDB.org). Cependant, peu d'outils génomiques pour le phénotypage des impacts de gènes individuels sont disponibles. La transformation du maïs est techniquement difficile, coûteuse et longue (revue dans [3]). Ainsi, des alternatives à la transformation de transgéniques stables sont précieuses. Les outils basés sur les virus développés pour le silençage génique induit par le virus (VIGS) à haut débit pourraient aider à combler le vide pour les études de la fonction des gènes du maïs.

De nombreux virus végétaux ont été développés en tant qu'outils bénéfiques pour l'expression de protéines ou de VIGS (examinés dans [4,5,6,7,8,9,10]). VIGS a été utilisé pour des analyses fonctionnelles de gènes dans des plantes hôtes [11,12,13,14], en utilisant des fragments de gènes cibles dans des vecteurs viraux dans des orientations sens ou antisens ou des structures en épingle à cheveux (voir les exemples dans [15]), avec des fragments de séquence d'insertion comme petite que 100-300 nt étant efficace pour faire taire les gènes cibles [13]. Les virus végétaux ont également été largement utilisés pour l'expression de protéines dans de nombreuses espèces végétales différentes (examiné dans [5, 16, 17, 18]). Dans un cas, un vecteur de virus végétal dérivé du virus de la marbrure des gousses du haricot (BPMV) a même été développé pour l'expression simultanée d'un seul gène et l'extinction d'un seul gène [19]. Pour le maïs, plusieurs virus ont été développés comme outils d'expression ou de silençage génique, notamment le virus de la mosaïque du brome (BMV) [20, 21], le virus de la mosaïque du concombre (CMV) [13] et le virus du rayado fino du maïs (MRFV) [22] pour le silençage génique [23], le virus de la mosaïque des stries du blé (WSMV) [24,25,26] et le virus de la mosaïque de la canne à sucre [27] pour l'expression protéique, le virus de la mosaïque de la sétaire (FoMV) pour le silençage génique [28] ou l'expression protéique [29] et guide d'administration d'ARN pour l'édition de gènes CRISPR/Cas9 [30], le virus de la mosaïque de l'orge pour l'extinction des gènes [23] ou l'expression de protéines [31] ou pour l'administration d'ARN guide [32] et le virus de la mosaïque jaune de l'orge (BYSMV) pour un guide simultané Expression de l'ARN et des protéines à haute capacité de chargement [33].

Les virus dans la famille Potyviridae, ou potyvirus, ont été développés en tant que vecteurs d'expression de gènes hétérologues dans divers hôtes végétaux, permettant le suivi du mouvement du virus et d'autres expériences. Les virus dans la famille Potyviridae ont des particules virales flexibles en forme de bâtonnet avec un génome d'ARN simple brin à sens positif encapsidé par une protéine d'enveloppe virale, et constituent le plus grand groupe de virus végétaux (examiné dans [34]). Le génome du potyvirus code une polyprotéine qui est clivée par ses propres protéases virales pour produire 10 protéines virales fonctionnelles matures pour la réplication virale, la pathogénicité, la transmission des pucerons et d'autres fonctions par interaction avec de nombreuses protéines hôtes végétales (examinées dans [34]). Les potyvirus développés pour l'expression des protéines comprennent le virus de la morsure du tabac (TEV) [35, 36], le virus de la mosaïque jaune de la courgette (ZYMV) [37], le virus de la sharka du prunier (PPV) [38], le virus A de la pomme de terre (PVA) [39, 40, 41], le virus de la mosaïque du navet (TuMV) [42, 43], le virus de la mosaïque des bandes veineuses du tabac (TVBMV) [44], le WSMV [24] et le SCMV [27]. En raison de leur puissant suppresseur d'extinction, les potyvirus n'étaient pas favorisés pour le développement de vecteurs VIGS, cependant, le PVA a été développé pour l'extinction transitoire des gènes [45]. Les sites d'insertion les plus courants dans ces vecteurs à base de potyvirus sont les jonctions de séquences codantes P1/HCPro et NIb/CP, avec quatre autres sites de jonction dans le cadre de lecture ouvert (ORF) de la polyprotéine ou à l'extrémité 5' de l'ORF de la polyprotéine utilisé dans certains vecteurs.

Étant donné que plus d'un site d'insertion de séquence peut être utilisé pour certains potyvirus et que leurs virions extensibles en forme de bâtonnet sont généralement plus tolérants aux séquences d'insertion que les virus avec des virions icosaédriques et des contraintes d'empaquetage inhérentes, l'expression de deux à cinq protéines à partir d'un seul vecteur a été atteint dans certains de ces systèmes [36, 41, 42, 43].

Compte tenu des caractéristiques des potyvirus et de l'intérêt pour d'autres outils pour le maïs, le virus de la mosaïque naine du maïs (MDMV) était une option intéressante pour le développement. Le MDMV a été signalé pour la première fois en Ohio en 1963 [46]. Le MDMV est naturellement transmis par les pucerons de manière non persistante [47], et est facilement transmissible par inoculation par frottement en laboratoire [48]. Les plantes infectées par le MDMV présentent des symptômes de mosaïque sur les feuilles des cultivars de maïs sensibles qui peuvent être visibles dès 5–7 jours après l'inoculation par friction. Le MDMV est courant aux États-Unis et est capable de réduire les rendements, mais une sélection de résistance et une gestion des maladies réussies ont limité les pertes de rendement importantes (examinées dans [49]). En plus du maïs, la gamme d'hôtes du MDMV comprend certains cultivars de sorgho et Johnsongrass (Halepense de sorgho L.), qui est un important réservoir de virus hivernant [50, 51]. La séquence consensus presque complète d'un isolat MDMV OH2 maintenu en laboratoire (numéro d'accès GenBank JQ403609) et la séquence complète d'un clone infectieux dérivé (numéro d'accès MDMV OH1 GenBank JQ403608) de l'Ohio ont été précédemment rapportées [52]. Nous rapportons ici le clonage et le séquençage d'un nouvel isolat Ohio MDMV de Johnsongrass, MDMV OH5, le développement de clones infectieux MDMV OH5 et des constructions conçues pour l'expression simultanée des gènes et l'extinction multigénique dans le maïs. Nous rapportons le premier développement d'un vecteur à base de virus pour l'expression simultanée des gènes et le VIGS multi-cibles dans le maïs.


RÉSULTATS

Couplage de la transcription avec la détection d'ARN

Ici, nous présentons le pr ofiling basé sur S HERLOCK de in vitro t ranscription (SPRINT) et montrer comment cette méthodologie peut mesurer les concentrations de diverses molécules effectrices et surmonter les limitations des méthodes existantes. Dans une réaction isotherme, en une étape et en un seul lot, Cas13a cible un site d'ARN qui est transcrit à partir d'une matrice d'ADN. Comme Cas13a ne clive pas l'ADN, il ne détectera sa séquence cible que lorsqu'il sera transcrit en ARN. Cas13a clive ensuite les oligonucléotides pentauridine marqués par fluorescence, produisant un signal fluorescent. Ce test a été utilisé pour quantifier l'activation ou la répression de la transcription dans diverses conditions. Étant donné que la transcription peut être régulée par des aTF ou des riboswitchs d'une manière dépendante du ligand, SPRINT peut être utilisé pour quantifier ces ligands dans des échantillons avec une sortie fluorométrique (figure 1D).

Optimisation et benchmark de SPRINT

Comme preuve de principe, le riboswitch synthétique sensible à la guanine bien décrit xpt/pbuE*6U (30) a été utilisé pour établir les conditions de réaction pour détecter la transcription avec Cas13a. Les xpt/pbuE*6U contient le domaine d'aptamère du B. subtilis xpt-pbuX riboswitch qui répond au ligand guanine et à quelques composés apparentés tels que l'hypoxanthine (61, 62). Les xpt l'aptamère est couplé au pbuE*plate-forme d'expression 6U, qui est dérivée de la B. subtilis pbuE riboswitch sensible à l'adénine (63). La nomenclature de aptamère/plateforme d'expression pour les riboswitches chimériques sera utilisé tout au long du manuscrit. En l'absence de guanine, le terminateur intrinsèque au sein de la xpt/pbuE*Le riboswitch 6U provoque l'interruption de la synthèse de l'ARN polymérase en présence de guanine, des transcrits de lecture intégrale sont synthétisés et peuvent être détectés par Cas13a.

Assembler in vitro transcription et détection d'ARN médiée par Cas13a, des conditions de dosage ont dû être établies pour une réaction isotherme, en une étape et en un seul lot. Cependant, la combinaison des composants de la réaction à 37°C dans du tampon SHERLOCK (44) a donné un signal de fond élevé en l'absence de ligand (figure 2A). Pour surmonter ce problème, nous avons testé un tampon qui a été utilisé précédemment pour tester les riboswitchs synthétiques (30), appelé tampon SPRINT. Le tampon SPRINT non modifié a réduit le signal de fond et a permis la détection du ligand avec une induction de signal de 2,8 fois (figure 2A). Pour réduire davantage le signal de fond, la contribution de Cas13a au signal de fond a été évaluée. Les réactions SHERLOCK ont été exécutées dans les tampons SPRINT et SHERLOCK (figure 2B) et l'ARN a pu être quantifié de manière fiable dans les deux tampons avec un signal de fond négligeable (figure supplémentaire S1a). Cela indique que les composants SHERLOCK fonctionnent efficacement dans le tampon SPRINT et à la place in vitro la transcription doit être au centre de l'optimisation de la plage dynamique du test SPRINT.

Optimisation des conditions et benchmark du signal. Toutes les mesures de fluorescence ont été corrigées en arrière-plan, les barres indiquent la valeur moyenne et les barres d'erreur indiquent le s.d. à partir de la moyenne n = 3. Toutes les mesures ont été normalisées à 125 nM de fluorescéine. (UNE) Les réactions SPRINT ont été réalisées avec le riboswitch guanine xpt/pbuE*6U dans le tampon SPRINT ou le tampon SHERLOCK. La transcription de l'ARN cible a été régulée par le riboswitch en réponse à ± 100 M d'hypoxanthine. Les mesures affichées ont été prises à 20 minutes de temps de réaction. (B) Les réactions SHERLOCK ont été réalisées dans du tampon SHERLOCK ou du tampon SPRINT à différentes concentrations d'ARN cible ajouté. Les mesures affichées ont été prises à 20 min de temps de réaction. (C, D) Les réactions SPRINT ont été réalisées avec le riboswitch de guanine xpt/pbuE*6U avec des concentrations variables de rNTP et de matrice de transcription. La fluorescence a été mesurée en réponse à ± 10 M de guanine à 25 minutes de temps de réaction. (E) Les réactions de SPRINT étaient régulées par le riboswitch de la guanine xpt/pbuE*6U en réponse à ±10 M de guanine. Des tests de renouvellement unique ont été effectués avec 66 ug/ml d'héparine, des tests de renouvellement multiples ont été effectués sans héparine.

Optimisation des conditions et benchmark du signal. Toutes les mesures de fluorescence ont été corrigées en arrière-plan, les barres indiquent la valeur moyenne et les barres d'erreur indiquent le s.d. à partir de la moyenne n = 3. Toutes les mesures ont été normalisées à 125 nM de fluorescéine. (UNE) Les réactions SPRINT ont été réalisées avec le riboswitch de guanine xpt/pbuE*6U dans le tampon SPRINT ou le tampon SHERLOCK. La transcription de l'ARN cible a été régulée par le riboswitch en réponse à ± 100 M d'hypoxanthine. Les mesures affichées ont été prises à 20 minutes de temps de réaction. (B) Les réactions SHERLOCK ont été réalisées dans du tampon SHERLOCK ou du tampon SPRINT à différentes concentrations d'ARN cible ajouté. Les mesures affichées ont été prises à 20 min de temps de réaction. (C, D) Les réactions SPRINT ont été réalisées avec le riboswitch de guanine xpt/pbuE*6U avec des concentrations variables de rNTP et de matrice de transcription. La fluorescence a été mesurée en réponse à ± 10 M de guanine à 25 minutes de temps de réaction. (E) Les réactions de SPRINT étaient régulées par le riboswitch de la guanine xpt/pbuE*6U en réponse à ±10 M de guanine. Des tests de renouvellement unique ont été effectués avec 66 ug/ml d'héparine, des tests de renouvellement multiples ont été effectués sans héparine.

Le tampon SPRINT a été systématiquement modifié pour identifier des conditions améliorées (Figure supplémentaire S1B). Le tampon SPRINT est basé sur Tris, tandis que le tampon SHERLOCK est basé sur HEPES et lors de l'utilisation de HEPES au lieu du tampon Tris pour les réactions SPRINT, la suppression du signal en l'absence de ligand a été abolie. Cela indique que l'absence de HEPES dans le tampon SPRINT est essentielle pour permettre la terminaison de la transcription par le xpt/pbuE*Riboswitch 6U. Étant donné que la sérumalbumine bovine (BSA) n'a pas affecté le test, elle a été retirée du tampon (figure supplémentaire S1C) pour réduire le risque de contamination par la RNase des préparations de BSA. Étant donné que de nombreuses petites molécules hydrophobes d'intérêt potentiel ne peuvent pas être dissoutes dans l'eau mais peuvent être dissoutes dans le DMSO, la réponse des réactions SPRINT a également été mesurée en quantités croissantes de DMSO (Figure supplémentaire S1D). Bien que le DMSO augmente légèrement à la fois le bruit de fond et le signal, les concentrations finales de 10 % de DMSO n'ont pas inhibé le test. Cependant, la plupart des modifications apportées à la composition du tampon SPRINT n'ont entraîné aucun changement ou une diminution de la détection de la transcription par lecture induite par le ligand (figure supplémentaire S1B).

Pour optimiser davantage à la fois l'intensité du signal et le temps de réaction, la concentration de NTP et de matrice d'ADN dans la réaction SPRINT a été systématiquement modifiée. Les concentrations les plus faibles d'ADN et de NTP ont entraîné le plus grand changement de pli lorsque la lecture de la transcription a été induite avec de la guanine (figure 2C). Cependant, parce que ces conditions ont conduit à des signaux relativement faibles (figure 2D), nous avons décidé de compromettre une induction plus élevée pour des signaux plus forts et avons choisi une matrice d'ADN de 2,5 nM et 20 M de NTP pour permettre une détection de signal fiable à 20 min de temps de réaction. Ce tampon SPRINT modifié (figure 2A) est utilisé dans toutes les expériences de cette étude, sauf indication contraire. Comme les concentrations de NTP et de matrice d'ADN ont un effet important sur l'inductibilité et la vitesse du signal, elles peuvent être considérées comme des paramètres essentiels pour l'optimisation et l'adaptation des tests SPRINT.

L'effet de l'héparine sur SPRINT a été évalué car in vitro les tests de transcription contiennent généralement de l'héparine pour restreindre l'ARN polymérase à un seul renouvellement de la transcription. dosages SPRINT avec le xpt/pbuE* Les riboswitchs de guanine 6U ont été testés avec et sans héparine (Figure 2E). La répression du signal de fond est plus efficace dans les tests de renouvellement unique avec l'héparine, mais le signal induit dans les tests de renouvellement multiples était ∼35 fois plus important et a atteint son maximum environ deux fois plus rapidement. Cela montre que la transcription de renouvellement multiple est principalement responsable de la force du signal fluorescent par opposition aux réactions de renouvellement multiples de l'enzyme Cas13a. Cette observation est cohérente avec les résultats précédents qui ont montré que l'amplification de l'entrée d'ARN est nécessaire pour un signal SHERLOCK fort (44, 45). Pour cette raison, la plupart des tests SPRINT ont été effectués sans héparine, mais notez que SPRINT peut être exécuté comme un seul test de renouvellement chaque fois qu'un signal de fond minimal est préféré à une réponse rapide.

Pour évaluer sa sensibilité, la réaction SPRINT a été comparée à l'approche standard de quantification des produits de transcription en séparant les transcrits d'ARN marqués au 32P à l'aide d'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant (58). La réponse transcriptionnelle du riboswitch guanine xpt/pbuE*6U et le riboswitch d'adénine pbuE/pbuE ‡ (64) à leur ligand respectif a été mesuré par SPRINT et la méthode de radiomarquage (Figure 3A, B). Les T50 valeur, la concentration de ligand à l'activation semi-maximale de la transcription, a été obtenue à partir d'un ajustement aux données et utilisée pour comparer les méthodes. Pour les deux riboswitchs, le T50 était similaire entre le SPRINT à rotation multiple, le radiomarquage à rotation unique et les valeurs de la littérature qui ont également été obtenues avec le radiomarquage à rotation unique. Cela indique que les résultats obtenus avec SPRINT sont comparables à ceux obtenus avec le radiomarquage tout en augmentant la vitesse, la facilité et le débit des tests de transcription. Ensemble, ces données établissent que nous avons efficacement combiné la régulation transcriptionnelle dépendante de petites molécules et la détection d'ARN médiée par Cas13a en une seule réaction.

Dose-réponse de divers riboswitchs mesurée avec SPRINT. Toutes les mesures de fluorescence ont été corrigées en arrière-plan, les barres indiquent la valeur moyenne et les barres d'erreur indiquent le s.d. de la moyenne m = 3. (UN B) Les réponses du riboswitch guanine xpt/pbuE*6U et l'adénine riboswitch pbuE/pbuE ‡ à leurs ligands apparentés ont été mesurés. Les résultats des mesures SPRINT sont marqués en bleu, les résultats des mesures de radiomarquage sont marqués en rouge. Les mesures affichées ont été prises à 20 min de temps de réaction. Les réponses de divers riboswitchs à leurs ligands apparentés et à des composés chimiquement similaires ont été mesurées : (C) un riboswitch de détection SAM, () un riboswitch de détection de mononucléotide flavine, (E) un riboswitch de détection de fluorure (signal mesuré à 60 minutes), et (F) un riboswitch sensible à la sérotonine. (g) Le natif infliger Le riboswitch de détection SAM est un interrupteur OFF et atténue la transcription avec des concentrations croissantes de ligand. De l'héparine a été ajoutée à 66 µg/ml. Signal de la infliger réaction a été mesurée à 100 minutes de temps de réaction. *(30), # (68), (23), § (73), (31).

Dose-réponse de divers riboswitchs mesurée avec SPRINT. Toutes les mesures de fluorescence ont été corrigées en arrière-plan, les barres indiquent la valeur moyenne et les barres d'erreur indiquent le s.d. de la moyenne m = 3. (UN B) Les réponses du riboswitch guanine xpt/pbuE*6U et le riboswitch d'adénine pbuE/pbuE ‡ à leurs ligands apparentés ont été mesurés. Les résultats des mesures SPRINT sont marqués en bleu, les résultats des mesures de radiomarquage sont marqués en rouge. Les mesures affichées ont été prises à 20 min de temps de réaction. Les réponses de divers riboswitchs à leurs ligands apparentés et à des composés chimiquement similaires ont été mesurées : (C) un riboswitch de détection SAM, () un riboswitch de détection de mononucléotide flavine, (E) un riboswitch de détection de fluorure (signal mesuré à 60 minutes), et (F) un riboswitch sensible à la sérotonine. (g) Le natif infliger Le riboswitch de détection SAM est un interrupteur OFF et atténue la transcription avec des concentrations croissantes de ligand. L'héparine a été ajoutée à 66 µg/ml. Signal de la infliger réaction a été mesurée à 100 minutes de temps de réaction. *(30), # (68), (23), § (73), (31).

SPRINT peut être implémenté avec différents riboswitchs

Pour tester la polyvalence et la spécificité de SPRINT, la détection d'autres petites molécules et ions via des riboswitches a été évaluée. Le riboswitch d'adénine pbuE/pbuE a répondu sélectivement à l'adénine mais pas à la guanine (figure 3B). Les S-riboswitch sensible à l'adénosylméthionine (SAM) yitJ/pbuE*6U détecté SAM mais pas le composé associé S-adénosylhomocystéine (SAH), comme attendu (30). Les T50 valeur pour SAM était comparable aux mesures antérieures en utilisant le test de marquage 32 P (figure 3C). Le riboswitch flavine mononucléotide (FMN) nervureD/pbuE*On a observé que le riboswitch 7U avait une réponse de haute affinité à la FMN avec un T50 valeur d'environ 1,01 ± 0,03 M, une réponse de faible affinité à la flavine adénine dinucléotide (FAD) étroitement liée ( 30, 65), et aucune réponse au ribocil, qui est un agoniste sélectif de la parenté nervureB riboswitch (66, 67) (Figure 3D). Ceci est cohérent avec les résultats publiés (30, 65-67). Les quatre riboswitchs (xpt/pbuE*6U, pbuE/pbuE ‡ , yitJ/pbuE*6U et nervureD/pbuE*7U) sont synthétiques avec des variations du pbuE plate-forme d'expression (30), mettant en évidence l'utilité des riboswitches artificiels en tant que biocapteurs robustes.

Parfois, les conditions de réaction devaient être optimisées pour s'adapter aux nouveaux riboswitches. L'induction dépendante du ligand du riboswitch FMN était initialement très faible. Pour améliorer cela, la concentration en magnésium dans la réaction SPRINT a été augmentée. Sur les quatre riboswitchs qui ont été testés à un MgCl plus élevé2 concentrations, seuls les nervureD riboswitch a montré une augmentation significative de l'induction de pli (figure supplémentaire S2). Par conséquent, les réactions de SPRINT avec le nervureD/pbuE*Riboswitch 7U ont été effectués à 10 mM de MgCl2 au lieu de 2,5.

Certains ligands ont inhibé le test SPRINT lorsqu'ils sont ajoutés à des concentrations élevées. Le riboswitch du fluorure crcB active la lecture de la transcription en répondant sélectivement au fluorure. En utilisant le test SPRINT, nous avons mesuré une T50 valeur de 11 ± 1 M (figure 3E), ce qui est, étonnamment, inférieur à celui observé précédemment K valeurs de ∼60 μM résultant du sondage en ligne ( 68). Ceci peut s'expliquer en partie par une inhibition observée du dosage à des concentrations de fluorure supérieures à 100 M. Pour comprendre si cet effet inhibiteur provient de l'inhibition de la E. coli RNAP ou inhibition de Cas13a, les réactions de SHERLOCK ont été menées à différentes concentrations de fluorure de sodium. Cas13a a été progressivement inhibé avec l'augmentation des concentrations de fluorure et le signal a fortement chuté 600 M (figure supplémentaire S3A). Pour mesurer la réponse de E. coli RNAP au fluorure, un protocole en deux lots a été développé (Figure supplémentaire S3B) pour d'abord transcrire l'ARN en présence de fluorure, puis éliminer le fluorure et ajouter les transcrits lavés à une réaction SHERLOCK. La transcription induite par le fluorure à partir du riboswitch de fluorure de manière linéaire jusqu'à des concentrations de 100 M, mais au-dessus des concentrations de 125 M de fluorure, l'activité transcriptionnelle globale a considérablement réduit (Figure supplémentaire S3C). Cela suggère que E. coli RNAP lui-même est le composant le plus sensible au fluorure dans les réactions SPRINT. Études avec crcB souches knock-out de E. coli appuient ces résultats en montrant une inhibition de croissance significative lorsque les concentrations de fluorure dans le milieu dépassent 100 M ( 68). Ces résultats montrent comment le test en deux étapes peut être utilisé pour séparer in vitro réactions de transcription à partir de réactions Cas13a ou potentiellement éliminer les composés inhibiteurs de Cas13a après la transcription qui interféreraient autrement avec le test.

De nouveaux aptamères d'ARN sont générés en routine via l'évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel (SELEX) contre des composés d'intérêt (23, 69-71) et l'incorporation de ces aptamères synthétiques dans SPRINT peut considérablement étendre son répertoire de biodétection. Un aptamère synthétique qui se lie au 5-hydroxytryptophane (5HTP) (23) a été précédemment incorporé dans la plateforme d'expression pbuE’ pour générer un ON-riboswitch qui répond à la fois au 5HTP et à la sérotonine ( 72). Ce riboswitch, appelé P1/pbuE'7U, a été utilisé avec SPRINT pour détecter avec succès la sérotonine. Les T50 la valeur a été mesurée à 5 ± 3 M pour la sérotonine et le riboswitch a discriminé le composé apparenté à la tryptamine (figure 3F). Étonnamment, la sérotonine a inhibé à la fois la transcription et la réaction Cas13a à des concentrations > 100 M, alors que des composés similaires tels que le 5HTP n'ont pas provoqué d'effets inhibiteurs (Figure supplémentaire S3D-F). Pour cette raison, la courbe dose-réponse affichée doit être interprétée avec prudence car les effets inhibiteurs faussent le signal à des concentrations ∼ 100 M. Malgré l'inhibition idiosyncratique par la sérotonine, ces résultats démontrent comment les plates-formes d'expression peuvent être combinées avec des aptamères synthétiques de manière plug-and-play pour créer de nouveaux biocapteurs pour la plate-forme SPRINT.

SPRINT peut évaluer rapidement la fonction native du riboswitch

Tous les riboswitchs décrits dans cette étude jusqu'à présent sont des commutateurs « ON » qui induisent la transcription en présence de ligands (30, 31, 68, 72) et sont donc prédisposés à bien fonctionner dans le contexte du test SPRINT, alors que la plupart des riboswitches natifs sont « » interrupteurs "OFF". Pour évaluer si SPRINT peut surveiller de manière robuste les interrupteurs OFF, nous avons examiné le infliger riboswitch de B. subtilis qui interrompt la transcription en réponse à SAM (73). La séquence native du riboswitch a été amplifiée à partir du B. subtilis génome par PCR et dans une seconde étape de PCR le tac le promoteur a été ajouté à l'extrémité 5' et le transcrit cible Cas13a à l'extrémité 3' afin que le produit de PCR résultant puisse être utilisé directement comme matrice d'ADN pour SPRINT (Figure supplémentaire S4A). Initialement, des concentrations très élevées de SAM étaient nécessaires pour réprimer le signal (figure supplémentaire S4B). Pour contourner ce problème, l'héparine a été ajoutée au test SPRINT pour restreindre l'ARN polymérase à un seul chiffre d'affaires de la transcription. Bien que la réaction ait été ralentie, la sensibilité du dosage a été grandement améliorée. Le titrage SAM a donné un T50 valeur d'environ 1 M (figure 3G), ce qui est similaire aux valeurs précédemment établies de 0,5 et 2 M ( 31, 73). Cela démontre que les riboswitchs ON et OFF peuvent être intégrés dans un modèle d'ADN pour SPRINT.

SPRINT peut détecter de petites molécules via des protéines répresseurs transcriptionnelles

Les méthodes développées précédemment utilisent des facteurs de transcription allostériques (aTF) pour détecter les composés. Jung et al. (54) a développé un système appelé ROSALIND qui détecte les composés avec des aTF pour réguler la transcription induite par l'ARNT T7 d'un aptamère de liaison aux fluorophores (74) et produisant ainsi une sortie fluorométrique (figure 1A). De cette manière, 16 composés divers, dont des tétracyclines, des macrolides, des petites molécules et des ions métalliques ont été détectés. Pour incorporer le large répertoire de biocapteurs aTF dans SPRINT, nous avons exploré les conditions qui permettent une réaction isotherme, en un lot et en une étape qui détecte les composés avec des aTF et génère un signal via Cas13a.

Le tampon ROSALIND a été adopté pour les réactions SPRINT à base de TF, bien que certaines modifications aient été apportées au tampon afin d'optimiser la sensibilité et la vitesse de la réaction. L'enzyme pyrophosphatase inorganique (IPPase) a été jugée inutile et supprimée du tampon ROSALIND. D'autres adaptations incluent la réduction des concentrations de rNTP de 2,85 mM à 40 M, la matrice d'ADN de 25 à 15 nM et l'ARN T7 de 10 à 6,7 ng/μl.

En utilisant le tampon et les conditions adaptés, les réponses des répresseurs TetR et SmtB ont été mesurées avec SPRINT. Le répresseur SmtB a permis la transcription de manière zinc-dépendante avec une T50 de 4,8 ± 0,3 M et a montré une sélectivité élevée contre le cuivre (figure 4A). Le répresseur TetR a répondu à des concentrations croissantes d'anhydrotétracycline avec une T50 de 1,9 ± 0,2 M, ce qui se situe dans la plage de 1 à 2,5 M mesurée précédemment (54) (Figure 4B). Cela montre que SPRINT peut non seulement mesurer la régulation de E. coli RNAP par des riboswitches, mais aussi régulation de T7 RNAP par des facteurs de transcription. La combinaison de ces deux mécanismes de détection des ligands élargit considérablement le champ des molécules pouvant être détectées avec SPRINT.

Régulation de la transcription par des facteurs de transcription. Le signal fluorescent des réactions SPRINT a été mesuré à un temps de réaction de 20 minutes. Le bruit de fond a été soustrait et le signal normalisé à 125 nM de fluorescéine. Les barres indiquent la valeur moyenne, les barres d'erreur indiquent le s.d. de la moyenne. m = 3. (UNE) SmtB dé-réprime la transcription en réponse au zinc, mais pas au cuivre. (B) TetR dé-réprime la transcription en réponse à l'anhydrotétracycline. *(54).

Régulation de la transcription par des facteurs de transcription. Le signal fluorescent des réactions SPRINT a été mesuré à un temps de réaction de 20 minutes. Le bruit de fond a été soustrait et le signal normalisé à 125 nM de fluorescéine. Les barres indiquent la valeur moyenne, les barres d'erreur indiquent le s.d. de la moyenne. m = 3. (UNE) SmtB dé-réprime la transcription en réponse au zinc, mais pas au cuivre. (B) TetR dé-réprime la transcription en réponse à l'anhydrotétracycline. *(54).

SPRINT peut cribler des composés dans un format à haut débit

Il existe un intérêt croissant pour l'administration de structures d'ARN (75-79), y compris des cibles telles que l'élément TAR du VIH (80), les répétitions d'expansion humaine (75, 81) ou les riboswitches (82-85), mais en développant des plates-formes pour le criblage à haut débit. des interactions ARN-médicament reste difficile. Comme preuve de concept, la réponse du riboswitch guanine xpt/pbuE* 6U à 30 petites molécules organiques différentes ont été mesurées dans un format de criblage à haut débit (figure 5A, figure supplémentaire S5A). Pour tous les composés, le signal SPRINT à haute concentration a été tracé par rapport au signal à faible concentration pour visualiser la relation dose-réponse pour chaque composé. Les concentrations exactes et les noms complets des composés peuvent être trouvés dans le tableau supplémentaire S3 . Des composés tels que la guanine qui ont provoqué une activation transcriptionnelle tout aussi forte à des concentrations faibles et élevées se trouvent dans le quadrant supérieur droit du graphique et devraient être de puissants agonistes de la cible. Des composés tels que NLa 2-méthylguanine que l'on trouve dans le quadrant supérieur gauche devrait avoir moins d'activité agoniste vis-à-vis de l'ARN cible. Composés non liants tels que NLa 6-méthyladénine se trouve dans le quadrant inférieur gauche. Des composés tels que la 7-déazaguanine qui ont montré une certaine activation de la transcription à de faibles concentrations mais une activation réduite ou inexistante à des concentrations élevées sont soupçonnés d'inhiber le dosage à des concentrations plus élevées. Notamment, les résultats de cet écran sont cohérents avec les rapports antérieurs sur la liaison de composés individuels à la xpt domaine des aptamères à l'aide d'approches ITC ou d'empreinte (61, 86-89). Par conséquent, le criblage de composés avec SPRINT nous a permis d'évaluer rapidement l'effet de divers composés sur la cible d'ARN pour trouver des composés d'intérêt.

SPRINT peut être utilisé pour les criblages de composés et les tests à couplage enzymatique. Le signal fluorescent des réactions SPRINT a été soustrait du bruit de fond et normalisé à 125 nM de fluorescéine. (UNE) Le riboswitch guanine xpt/pbuE* Transcription régulée par 6U en réponse à 30 composés différents. Le signal avec solvant uniquement a été soustrait du signal avec ligand pour corriger les différences dans les solvants des ligands. Les points représentent la valeur moyenne, m = 3. (B) L'effet des composés sur la transcription à partir d'un promoteur constitutif a été mesuré. Le signal avec solvant uniquement a été soustrait du signal avec ligand pour corriger les différences dans les solvants des ligands. Les points représentent une réplique biologique. (C) SPRINT a mesuré la transcription constitutive de la cible Cas13a car la transcription était inhibée à des concentrations croissantes de rifampicine. Les barres indiquent la valeur moyenne, les barres d'erreur indiquent le s.d. de la moyenne. m = 3. () Schéma d'un essai couplé enzymatique. L'enzyme hPNP convertit l'inosine en hypoxanthine, qui est détectée par la guanine riboswitch xpt/pbuE*6U et déclenche le signal SPRINT. (E) Le dosage couplé enzymatique a été utilisé pour mesurer l'activité enzymatique du hPNP. La concentration d'inosine était de 1 mM, le hPNP a été ajouté à une activité de 10 mU/μl, la concentration d'Immucilline-H était de 10 M. Les barres indiquent la valeur moyenne, les barres d'erreur indiquent le s.d. de la moyenne. m = 3. p-la valeur a été calculée à l'aide d'un t-test. (F) Le dosage couplé enzymatique a été utilisé pour mesurer la conversion du substrat en fonction de la concentration. hPNP a été ajouté à une activité de 1 mU/μl. Les barres indiquent la valeur moyenne, les barres d'erreur indiquent le s.d. de la moyenne. m = 3.

SPRINT peut être utilisé pour les criblages de composés et les tests à couplage enzymatique. Le signal fluorescent des réactions SPRINT a été soustrait du bruit de fond et normalisé à 125 nM de fluorescéine. (UNE) Le riboswitch guanine xpt/pbuE* Transcription régulée par 6U en réponse à 30 composés différents. Le signal avec solvant uniquement a été soustrait du signal avec ligand pour corriger les différences dans les solvants des ligands. Les points représentent la valeur moyenne, m = 3. (B) L'effet des composés sur la transcription à partir d'un promoteur constitutif a été mesuré. Le signal avec solvant uniquement a été soustrait du signal avec ligand pour corriger les différences dans les solvants des ligands. Les points représentent une réplique biologique. (C) SPRINT a mesuré la transcription constitutive de la cible Cas13a car la transcription était inhibée à des concentrations croissantes de rifampicine. Les barres indiquent la valeur moyenne, les barres d'erreur indiquent le s.d. de la moyenne. m = 3. () Schéma d'un essai couplé enzymatique. L'enzyme hPNP convertit l'inosine en hypoxanthine, qui est détectée par la guanine riboswitch xpt/pbuE*6U et déclenche le signal SPRINT. (E) Le dosage couplé enzymatique a été utilisé pour mesurer l'activité enzymatique du hPNP. La concentration d'inosine était de 1 mM, le hPNP a été ajouté à une activité de 10 mU/μl, la concentration d'Immucilline-H était de 10 M. Les barres indiquent la valeur moyenne, les barres d'erreur indiquent le s.d. de la moyenne. m = 3. p-la valeur a été calculée à l'aide d'un t-test. (F) Le dosage couplé enzymatique a été utilisé pour mesurer la conversion du substrat en fonction de la concentration. hPNP a été ajouté à une activité de 1 mU/μl. Les barres indiquent la valeur moyenne, les barres d'erreur indiquent le s.d. de la moyenne. m = 3.

Lors du dépistage des médicaments inhibiteurs cibles, il est essentiel d'identifier de manière fiable les composés interférentiels pan-essai (PAINS) ( 90) qui pourraient apparaître comme des faux positifs. À cette fin, le panel de médicaments a été testé dans des réactions SPRINT qui transcrivent de manière constitutive une cible Cas13a sans composants régulateurs tels que les riboswitches ou les aTF. Cette configuration ne mesure que les effets des composés sur le test de base lui-même. Ainsi, des composés tels que la 7-déazaguanine, NLa 2-méthylguanine, la 2,5,6-triamine pyrimidine-4-one (2,5,6-TAP) et dans une moindre mesure la 2-fluoroadénine ont pu être identifiées avec succès comme des composés interférant avec le dosage (Figure 5B, S5B supplémentaire, Tableau supplémentaire S3).

Des études antérieures visaient à identifier de nouveaux antibiotiques en ciblant la machinerie transcriptionnelle des bactéries (91, 92). Cela peut inclure le ciblage de riboswitches (66, 82-84, 93), de facteurs de transcription (94, 95) ou de l'ARN polymérase elle-même (96, 97). La rifampicine inhibe le RNAP bactérien (98) en bloquant l'allongement (99) et est le principal médicament pour traiter les infections mycobactériennes telles que la tuberculose (100). Nous avons mesuré l'effet inhibiteur de la rifampicine sur le RNAP avec SPRINT. Une réaction de transcription constitutive a été titrée avec différentes concentrations de rifampicine (figure 5C). UNE T50 une valeur de 5,9 ± 0,6 nM a été obtenue, ce qui est très proche de la valeur établie K de 3 nM (101). Cela démontre comment SPRINT peut être utilisé pour cribler des médicaments qui ciblent la transcription et quantifier rapidement l'efficacité des médicaments.

Dosage couplé enzymatique

SPRINT peut générer des signaux fluorescents rapides en réponse à divers composés et pourrait donc être utilisé pour détecter les produits de réactions enzymatiques. La plupart des dosages couplés enzymatiques sont limités à la détection d'un métabolite particulier tel que l'ADP généré dans une réaction de kinase ou le NADH généré dans une réaction redox (102). La détection de produits enzymatiques avec un riboswitch ou un facteur de transcription est une alternative intéressante en raison de la grande diversité de composés pouvant être détectés avec ces systèmes. Nous avons examiné la purine nucléoside phosphorylase humaine (hPNP) ( 103, 104), qui fait partie de la voie de récupération des purines, qui catalyse la phosphorylation de la fraction ribose de divers nucléosides puriques et l'élimination simultanée du sucre de la nucléobase et évalué les conditions d'un isotherme, Dosage SPRINT à couplage enzymatique en un lot et en une étape.

La conversion de l'inosine en hypoxanthine par hPNP a été couplée à la guanine synthétique riboswitch xpt/pbuE*6U (Figure 5D). Le riboswitch guanine répond à l'hypoxanthine (30) mais ne se lie pas aux nucléosides tels que l'inosine. Ce test couplé enzymatique a permis l'observation de l'activité enzymatique par l'enzyme hPNP (figure 5E) sans modifier aucun composant du tampon SPRINT, à l'exception de l'ajout des substrats inosine et phosphate (figure supplémentaire S6). Le titrage de la réaction couplée avec l'inosine a montré une augmentation dépendante de la concentration de la production d'hypoxanthine par l'enzyme hPNP (figure 5F). La conversion de la désoxyguanosine en guanine par le hPNP peut être inhibée avec des analogues nucléosidiques tels que l'Immucilline-H (forodésine) qui conduit à l'accumulation de désoxyguanosine et à l'apoptose qui en résulte dans les lymphocytes T activés. Par conséquent, le hPNP est une cible médicamenteuse importante pour le traitement de la leucémie, de l'arthrite, de la sclérose en plaques et du rejet de greffe ( 105–111). L'ajout de l'inhibiteur compétitif Immucillin-H à une concentration 100 fois inférieure à celle du substrat inosine a entraîné une réduction significative de l'activité enzymatique telle que mesurée dans le test SPRINT (figure 5E). Ensemble, ces résultats démontrent comment SPRINT peut être utilisé pour évaluer l'activité d'enzymes, mesurer l'inhibition de ces enzymes avec des médicaments et détecter indirectement des composés tels que l'inosine qui ne sont pas liés par des aTF ou des riboswitchs.

Formats d'analyse portables

Pour répondre au besoin d'appareils de diagnostic au point de service, SPRINT doit être adaptable aux appareils portables tels que les dosages à flux latéral (LFA) (45, 112) ou les appareils fluorométriques portables (37, 54, 113, 114). Un appareil portatif peu coûteux qui peut être fabriqué avec une imprimante 3D a été précédemment développé pour détecter les contaminants de l'eau par fluorescence (54). Cet appareil portable éclaire les tubes de réaction avec une lumière bleue ∼470 nm et les sondes fluorescentes peuvent être vues à travers un film jaune utilisé comme filtre optique passe-long. La fluorescence des réactions SPRINT était facilement visible à l'œil humain à l'aide de l'appareil et aucune adaptation n'était nécessaire, à l'exception de l'augmentation de la concentration d'ARN marqué FAM dans les réactions SPRINT à 1,25 M (figure supplémentaire S7). À l'aide du riboswitch de fluorure, différentes concentrations de fluorure peuvent être différenciées à l'œil nu après 20 minutes de temps de réaction (figure 6A) à 30 °C, ce qui peut être facilement atteint en tenant fermement les tubes dans la main. En outre, le facteur de transcription sensible au zinc SmtB a été utilisé pour détecter le zinc dans des échantillons d'eau municipale qui ont été collectés, filtrés et expédiés de Paradise, en Californie, où les niveaux de zinc ont été affectés par l'incendie de camp de 2018 (54) (figure 6B). En comparant la fluorescence des échantillons avec une courbe d'étalonnage, la concentration en zinc des échantillons pourrait être estimée à l'œil nu à environ 0-1 M (I), 2,5-5 M (II) et ∼5 M (III), respectivement . La concentration de zinc dans les échantillons d'eau municipale a été préalablement déterminée par spectroscopie d'absorption atomique de flamme (FAAS) (54) à des fins de comparaison. Ces résultats démontrent que SPRINT peut être adapté à des formats portables peu coûteux et montrent comment le test pourrait être utilisé pour des tests sur le terrain.

Détection d'analytes avec un appareil portatif. Les tests SPRINT ont été assemblés et ajoutés à des échantillons d'eau contenant diverses concentrations de l'analyte. Les concentrations indiquées se réfèrent à la concentration finale de l'analyte après mélange de l'échantillon avec les composants du dosage. Une fois les composants de l'échantillon et du test mélangés, les tubes ont été placés dans le dispositif LED et des photographies ont été prises juste après (0 min). Les différentes apparences des échantillons fluorescents en A et B sont dues aux variations de la lumière ambiante lors de la prise de vue. (UNE) Les réactions SPRINT ont été exécutées avec un riboswitch au fluorure crcB. (B) Les réactions SPRINT ont été exécutées avec le facteur de transcription SmtB qui répond au zinc. Les cinq réactions de gauche contenaient ddH2O avec ZnCl ajouté2. Les trois réactions à droite étiquetées I, II et III contenaient des échantillons d'eau municipale de Paradise, en Californie.

Détection d'analytes avec un appareil portatif. Les tests SPRINT ont été assemblés et ajoutés à des échantillons d'eau contenant diverses concentrations de l'analyte. Les concentrations indiquées se réfèrent à la concentration finale de l'analyte après mélange de l'échantillon avec les composants du dosage. Une fois les composants de l'échantillon et du test mélangés, les tubes ont été placés dans le dispositif LED et des photographies ont été prises juste après (0 min). Les différentes apparences des échantillons fluorescents en A et B sont dues aux variations de la lumière ambiante lors de la prise de vue. (UNE) Les réactions SPRINT ont été exécutées avec un riboswitch au fluorure crcB. (B) Les réactions SPRINT ont été exécutées avec le facteur de transcription SmtB qui répond au zinc. Les cinq réactions de gauche contenaient ddH2O avec ZnCl ajouté2. Les trois réactions à droite étiquetées I, II et III contenaient des échantillons d'eau municipale de Paradise, en Californie.


Renseignements à l'appui

S1 Fig. Localisation et conditions climatiques des sites de collecte des accessions.

(A) Distribution des 44 accessions naturelles utilisées dans cette étude. La couleur des points représente le gradient altitudinal. La carte est ombrée suivant le gradient de température. (B) Précipitations annuelles moyennes et température annuelle moyenne pour les sites où les accessions ont été collectées, par rapport aux principaux types de biomes du monde selon la classification de Whittaker. 1–9 : Toundra, forêt boréale, prairies tempérées désertiques, forêts arbustives, forêt tempérée, forêt pluviale tempérée, savane forestière tropicale, forêt tropicale humide et désert. (C) Relations altitude et indicateurs climatiques sur les sites de collecte.

S2 Fig. Taux d'expansion de la rosette de 39 UNE. thaliana accessions dans des conditions de contrôle à une durée de jour de 8 h.

Les barres sont une moyenne de ± 95% CI du taux d'expansion de la rosette (mm 2 j -1 ) 30 jours après l'inoculation (n = 3) de plantes cultivées dans des conditions d'inoculation fictive : bien arrosé.

S3 Fig. Moyenne des moindres carrés pour la masse sèche aérienne après ANOVA de 39 UNE. thaliana les accessions cultivées dans des conditions d'infection virale et d'arrosage contrastées.

La masse sèche au-dessus du sol a subi une transformation logarithmique avant l'analyse. Les barres sont des moyennes ± IC à 95 %. pour les plantes cultivées sous quatre traitements : conditions d'inoculation simulée:WW, d'infection CaMV:WW, d'inoculation simulée:WD et d'infection CaMV:WD. WW : bien arrosé WD : déficit hydrique. Les données proviennent de l'expérience 1.

S4 Fig. Relation entre le changement relatif de la masse sèche aérienne (ADM) de 39 UNE. thaliana accessions en réponse à l'infection par le CaMV et au déficit hydrique.

Chaque point représente la variation relative moyenne de chaque accession. Les couleurs des points font référence aux différents groupes de réponses, comme déterminé dans la figure 1. Les lignes pleines représentent des régressions linéaires significatives : (A) r = 0.39, P = 0,015 (B) r = 0.41 P = 0,003. Les lignes pointillées représentent la ligne d'identité (1:1), c'est-à-dire la ligne de réponse égale. Les données proviennent de l'expérience 1. WW : conditions bien arrosées WD : déficit hydrique.

S5 Fig. Relation entre le R-score et le changement relatif de la masse sèche aérienne (%) en réponse à l'infection par le CaMV et au déficit hydrique pour cinq groupes de réponse.

Chaque point représente un groupe de réponse tel que déterminé dans la figure 1. Les plantes ont été infectées par le CaMV ou inoculées dans des conditions de bien arrosé (WW) et de déficit hydrique (WD) Les couleurs sont similaires aux groupes de réponse I-IV de la figure 1. Les lignes représentent régressions linéaires significatives.

S6 Fig. Effets de l'infection par le CaMV et de l'arrosage sur la masse foliaire par surface (LMA) de 39 UNE. thaliana adhésions.

(A) Les barres sont des moyennes ± 95% CI de la masse foliaire par surface (LMA mg mm -2 ) à 30 dpi (n = 3) de plantes cultivées dans des mock-inoculés:WW (barres blanches), CaMV-infected:WW ( barres gris foncé), conditions d'inoculation simulée:WD (barres gris clair) et d'infection CaMV:WD (barres noires). (B) Changement relatif (± se) de LMA (%) dans simulé: WW (cercle blanc), CaMV-infecté:WW (triangle gris foncé), simulé: WD (losange gris clair) et CaMV-infecté :conditions WD (carré noir). Les données proviennent de l'expérience 1.

S7 Fig. Effets de l'infection par le CaMV et de l'arrosage sur la teneur en matière sèche des feuilles (LDMC) de 39 UNE. thaliana adhésions.

(A) Les barres sont des moyennes ± 95% CI de la teneur en matière sèche des feuilles (LDMC mg g -1 ) à 30 dpi (n = 3) de plantes cultivées dans des plantes inoculées:WW (barres blanches), infectées par le CaMV:WW ( barres gris foncé), conditions d'inoculation simulée:WD (barres gris clair) et d'infection CaMV:WD (barres noires). (B) Changement relatif (± se) de LDMC (%) dans simulé: WW (cercle blanc), CaMV-infecté: WW (triangle gris foncé), simulé: WD (losange gris clair) et CaMV-infecté :conditions WD (carré noir). Les données proviennent de l'expérience 1.

S8 Fig. Comparaison des relations entre le LMA et le LDMC et les taux de croissance inhérents à une durée de jour de 8 h et de 12 h.

(A) Relation entre la masse foliaire par surface (LMA mg mm -2 ) et la teneur en matière sèche des feuilles (LDMC mg g -1 ) dans l'expérience 1. (B) Relation entre LMA et LDMC dans l'expérience 2. Chaque point représente la moyenne relative changement de chaque génotype. Les lignes représentent des régressions linéaires significatives (P < 0,001). Inoculé de manière simulée :WW (cercle blanc), infecté par le CaMV :WW (triangle gris foncé), inoculé de manière simulée :WD (losange gris clair) et infecté par le CaMV :WD (carré noir). Les données proviennent des expériences 1 et 2 (n = 39, durée du jour de 8 h et n = 20, durée du jour de 12 h, respectivement). (C) Relation entre le taux d'expansion (mm 2 j -1 ) à 8h et 12h de jour le 15 UNE. thaliana adhésions (r = 0,71, p = 0,003).

S9 Fig. Relation entre la croissance végétative et les traits morphologiques des feuilles de 39 UNE. thaliana adhésions.

Chaque point représente une accession dans des conditions bien arrosées (cercle bleu foncé WW) ou de déficit hydrique (triangle bleu clair WD). (A) Relation entre le changement relatif de la production de masse sèche aérienne (ADM %) dans les plantes infectées par le CaMV et la teneur en matière sèche des feuilles (LDMC mg g -1 Pearson's r = –0.43, P < 0,007 pour WW et r = –0.20, P = 0,23 pour WD). (B) Relation entre le changement relatif de l'ADM (%) dans les plantes infectées par le CaMV sous WW et sous WD et la masse foliaire par surface (LMA mg mm -2 r = –0.52, P < 0,001 pour WW et r = –0.35, P = 0,031 pour WD). Les lignes représentent des régressions linéaires significatives à P < 0.05. Les données proviennent de l'expérience 1.

S10 Fig. Effets de l'infection par le CaMV et du traitement d'arrosage sur les caractères phénologiques de 20 UNE. thaliana adhésions.

(A) Jours jusqu'au boulonnage. (B) Jours jusqu'à la floraison. Les barres et les barres d'erreur sont des moyennes ± intervalles de confiance bootstrap à 95% de plantes cultivées sous inoculation simulée:WW (barres blanches), inoculation simulée:WD (barres gris foncé), infectées par le CaMV:WW (barres gris clair) et CaMV- infecté:conditions WD (barres noires). WW : conditions bien arrosées WD : déficit hydrique Les accessions sont ordonnées selon leur surface projetée finale de la rosette en condition d'infection virale. Les données proviennent de l'expérience 2.

S11 Fig. Relations entre les traits morphologiques des feuilles, la rudéralité et la phénologie de 20 accessions de UNE. thaliana.

Relations entre le nombre de jours et la montaison par rapport à (A) la teneur en matière sèche des feuilles (LDMC mg g-1), (B) la masse foliaire par surface (LMA mg mm-2) et (C) le score rudéral (R %) et les jours à la floraison vs. (D) LDMC, (E) LMA et (F) R. Chaque point représente une accession cultivée dans les conditions de contrôle (bien arrosé x simulacre d'inoculation). Les lignes sont des régressions linéaires significatives à P < 0.05. Les données proviennent de l'expérience 2.

S12 Fig. Dynamique des symptômes viraux dans 20 accessions de UNE. thaliana infectés par le CaMV dans des conditions d'abreuvement et de déficit hydrique.

(A) Temps de latence d'apparition des symptômes. (B) Taux d'apparition des symptômes. Les barres et les barres d'erreur sont des moyennes à ± 95% des intervalles de confiance extraits de l'ajustement de la courbe sigmoïde de la dynamique des symptômes dans des conditions d'abreuvement (barres grises) et de déficit hydrique (barres noires). Les marques au-dessus des barres indiquent une diminution significative (–) ou une augmentation (+) au niveau de 5% en réponse au déficit hydrique. Les accessions sont ordonnées en fonction de l'augmentation de la surface projetée finale de la rosette. Les données proviennent de l'expérience 2.


Voir la vidéo: Les virus dans lévolution du vivant (Janvier 2022).