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Quel est le rapport de charge ADN/protéine ?


Pour étudier l'interaction ADN-protéine, je souhaite effectuer un test de retardement de l'ADN en mélangeant la protéine avec de l'ADN et en la chargeant ensuite sur un gel d'agarose pour voir si l'ADN migre plus lentement. J'ai trouvé des articles où ils font cela et ils déclarent qu'ils mélangent l'ADN avec des protéines dans un rapport de charge de 1:8, mais je ne peux pas vraiment comprendre comment interpréter cela

Quelqu'un pourrait-il me dire comment calculer un rapport de charge ADN:protéine? Si 1:8 est indiqué, comment dois-je interpréter cela ?


Cela ressemble vraiment à une ligne directrice, un point de départ, pas nécessairement votre meilleur protocole.

En pratique, il est difficile d'être plus précis comme le dit MS. Le pH du tampon affectera la charge de la protéine, et dans une moindre mesure l'ADN.

De plus, la protéine peut avoir un pH idéal pour la liaison qui, vous pouvez le deviner, se situe dans la plage de 7,0 à 7,4, mais pourrait constater que la liaison la plus forte dépend d'un pH inattendu et de concentrations de sel, ou de l'ajout d'une petite molécule.

L'affinité de l'araC par exemple est fortement augmentée par la présence d'arabinose en concentration suffisante.

lac Repressor, en revanche, se libère de l'ADN en présence d'IPTG ou de lactose.


Quel est le rapport de charge ADN/protéine ? - La biologie

Une façon courante de séparer les macromolécules biologiques consiste à tirer parti du fait que bon nombre de ces molécules existent sous forme d'ions en solution ou peuvent être modifiées pour avoir des molécules ioniques associées et se déplaceront donc dans un champ électrique. Il existe un certain nombre de types différents d'électrophorèse, mais tous impliquent de générer un champ électrique entre des points et de placer une matrice quelconque entre les deux à travers laquelle les macromolécules doivent voyager. La vitesse à laquelle ils traversent cette matrice en présence du champ électrique est appelée leur mobilité électrophorétique. La mobilité électrophorétique est typiquement mesurée dans un sens relatif. C'est-à-dire que l'on utilise généralement une sorte de standard et détermine la mobilité d'autres molécules par rapport à ce standard.

La théorie de l'électrophorèse. Le concept ici est assez simple. Comme la centrifugation, les molécules ressentent une force les poussant dans une direction. Cependant, dans ce cas, la force impliquée est due au champ électrique agissant sur la charge de la molécule et est donnée par F = EQ où F est la force, E est le champ électrique et Q est la charge. Évidemment, plus la charge sur la molécule est grande, plus la force est grande. Ainsi, pour deux molécules de même taille, celle avec la plus grande charge se déplacera plus rapidement dans le champ électrique. Maintenant, il est moins évident que les molécules avec une plus grande masse se déplaceront plus lentement. Cela se produit en fait parce que les forces de friction qui ralentissent une molécule se déplaçant à travers la solution dépendent de la taille des molécules. La vitesse à laquelle les molécules traversent une solution est déterminée par le point auquel les forces qui la poussent vers l'avant sont juste équilibrées par les forces de friction générées par le mouvement. Plus la masse de la molécule est grande, plus la taille, en général, est grande et donc le frottement que la molécule générera lors de son déplacement dans la solution. Il s'avère qu'en fait la mobilité électrophorétique d'une molécule dépend de son rapport charge sur masse. Deux molécules de tailles différentes avec le même rapport charge/masse devraient fonctionner avec la même mobilité dans un champ électrique uniforme et un monde parfait.

Types d'électrophorèse. Il existe un certain nombre de types d'électrophorèse couramment utilisés. Il n'est pas possible de les parcourir tous en détail ici, mais une brève description de quelques-uns des types les plus courants suit :

FDS-PAGE. L'un des moyens les plus courants d'analyser les protéines par électrophorèse consiste à utiliser le sulfate de sodium dodécyl - électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Le SDS est un détergent qui dénature les protéines en se liant aux régions hydrophobes et en enrobant essentiellement la séquence protéique linéaire avec un ensemble de molécules SDS. Le SDS est chargé négativement et devient ainsi la charge dominante du complexe. Le nombre de molécules SDS qui se lient est simplement proportionnel à la taille de la protéine. Par conséquent, le rapport charge/masse ne devrait pas changer avec la taille. En solution (eau), en principe, toutes les protéines de tailles différentes recouvertes de SDS fonctionneraient à peu près à la même mobilité. Cependant, les protéines ne passent pas par l'eau. Au lieu de cela, ils sont passés à travers un polymère inerte, le polyacrylamide. La densité et la taille des pores de ce polymère peuvent varier selon la manière dont vous le fabriquez (concentration de monomère et d'agent de réticulation). Ainsi, la taille des molécules qui peuvent traverser la matrice peut être variée. Cela détermine dans quelle plage de poids moléculaire le gel aura le pouvoir de résolution le plus élevé.

Gels natifs. Il est également possible d'exécuter des gels de protéines sans le SDS. Ceux-ci sont appelés gels natifs dans la mesure où l'on ne dénature pas volontairement la protéine. Ici, la charge native de la protéine (divisée par sa masse) détermine à quelle vitesse la protéine se déplacera et dans quelle direction.

Gels d'électrofocalisation. Une autre variante de l'électrophorèse sur gel consiste à verser un gel qui a volontairement un gradient de pH d'une extrémité à l'autre. Au fur et à mesure que la protéine traverse ce gradient de pH, ses divers groupes ionisables ramassent ou perdent des protons. Finalement, il trouvera un pH où sa charge est nulle et il restera bloqué (focalisé) à ce point.

Gels d'agarose à l'ADN. Un moyen simple de séparer des fragments d'ADN assez gros les uns des autres par taille consiste à utiliser un gel d'agarose. L'agarose est un autre type de matrice utilisé à de nombreuses fins (comme le support de la croissance des bactéries sur les plaques). L'ADN n'a pas besoin d'un détergent, car il a déjà un grand nombre de groupes phosphate négatifs régulièrement espacés. Ainsi, comme avec SDS-PAGE, le rapport charge sur masse est constant. De même que SDS-PAGE, la séparation résulte de la matrice elle-même. La gamme de sensibilité à la taille peut être modifiée en changeant la densité de l'agarose.

Gels de polyacrylamide dénaturant l'ADN (souvent appelés gels de séquençage). Pour examiner des molécules d'ADN plus petites avec une résolution beaucoup plus élevée, les gens dénaturent généralement l'ADN par la chaleur et le font passer à travers un gel de polyacrylamide mince qui est également maintenu près de la température de dénaturation. Ces gels contiennent généralement des composés dénaturants supplémentaires tels que l'urée. Deux morceaux d'ADN dont la taille diffère d'une base peuvent être distingués l'un de l'autre de cette façon.

Électrophorèse capillaire. Il est devenu courant de séparer les molécules par électrophorèse en les faisant passer dans et à travers un tube capillaire. Ceci est rapide et précis, mais ne permet pas de charger beaucoup d'échantillons sur le gel à la fois.


Détergents pour la lyse cellulaire et l'extraction de protéines

Les détergents sont des molécules amphipathiques, ce qui signifie qu'ils contiennent à la fois une "queue" non polaire ayant un caractère aliphatique ou aromatique et une "tête" polaire. Le caractère ionique du groupe de tête polaire constitue la base d'une large classification des détergents, ils peuvent être ioniques (chargés, soit anioniques soit cationiques), non ioniques (non chargés) ou zwitterioniques (ayant à la fois des groupes chargés positivement et négativement mais avec une charge nette de zéro ).

Détergents en solution

Comme les composants des membranes biologiques, les détergents ont des propriétés d'association hydrophobe en raison de leurs groupes de queue non polaires. Néanmoins, les détergents sont eux-mêmes solubles dans l'eau. Par conséquent, les molécules détergentes permettent la dispersion (miscibilité) de composés hydrophobes insolubles dans l'eau dans des milieux aqueux, y compris l'extraction et la solubilisation des protéines membranaires.

Les détergents à faible concentration en solution aqueuse forment une monocouche à l'interface air-liquide. À des concentrations plus élevées, les monomères détergents s'agrègent en structures appelées micelles. Une micelle est un agrégat colloïdal thermodynamiquement stable de monomères détergents dans lequel les extrémités non polaires sont séquestrées vers l'intérieur, évitant l'exposition à l'eau, et les extrémités polaires sont orientées vers l'extérieur en contact avec l'eau.

Structure idéalisée d'une micelle de détergent.

Le nombre de monomères détergents par micelle (nombre d'agrégation) et la plage de concentration de détergent au-dessus de laquelle les micelles se forment (appelée concentration micellaire critique, CMC) sont des propriétés spécifiques à chaque détergent particulier (voir tableau). La température critique des micelles (CMT) est la température la plus basse à laquelle les micelles peuvent se former. Le CMT correspond à ce que l'on appelle le point de trouble puisque les micelles de détergent forment des suspensions cristallines à des températures inférieures au CMT et redeviennent claires à des températures supérieures au CMT.

Les propriétés des détergents sont affectées par les conditions expérimentales telles que la concentration, la température, le pH du tampon et la force ionique, et la présence de divers additifs. Par exemple, la CMC de certains détergents non ioniques diminue avec l'augmentation de la température, tandis que la CMC des détergents ioniques diminue avec l'ajout de contre-ion en raison d'une répulsion électrostatique réduite parmi les groupes de tête chargés. Dans d'autres cas, des additifs tels que l'urée perturbent efficacement la structure de l'eau et provoquent une diminution de la CMC du détergent. Généralement, des augmentations spectaculaires du nombre d'agrégats se produisent avec l'augmentation de la force ionique.

Les détergents peuvent être dénaturants ou non dénaturants en ce qui concerne la structure des protéines. Les détergents dénaturants peuvent être anioniques comme le dodécyl sulfate de sodium (SDS) ou cationiques comme le bromure d'éthyl triméthyl ammonium. Ces détergents perturbent totalement les membranes et dénaturent les protéines en brisant les interactions protéine-protéine. Les détergents non dénaturants peuvent être divisés en détergents non ioniques tels que le Triton X-100, les sels biliaires tels que le cholate et les détergents zwitterioniques tels que le CHAPS.

Propriétés des détergents courants.

DétergentTaperAgg.#‡MW
mono
(micelle)
CMC
mm
(%p/v)
Nuage
point
°C
dialysable
Thermo Scientific Triton X-100Non ionique140647 (90K)0.24 (0.0155)64Non
Thermo Scientific Triton X-114Non ionique537 ( – )0.21 (0.0113)23Non
NP-40Non ionique149617 (90K)0.29 (0.0179)80Non
Thermo Scientific Brij-35Non ionique401225 (49K)0.09 (0.0110)>100Non
Thermo Scientific Brij-58Non ionique701120 (82K)0.08 (0.0086)>100Non
Thermo Scientific Tween 20Non ionique1228 ( – )0.06 (0.0074)95Non
Thermo Scientific Tween 80Non ionique601310 (76K)0.01 (0.0016)Non
OctylglucosideNon ionique27292 (8K)23-24 (

‡Agg.# = nombre d'agrégation, qui est le nombre de molécules par micelle.

Solutions détergentes purifiées

Bien que les détergents soient disponibles auprès de plusieurs sources commerciales et utilisés en routine dans de nombreux laboratoires de recherche, l'importance de la pureté et de la stabilité des détergents n'est pas largement appréciée. Les détergents contiennent souvent des traces d'impuretés provenant de leur fabrication. Certaines de ces impuretés, en particulier les peroxydes que l'on trouve dans la plupart des détergents non ioniques, détruiront l'activité des protéines. De plus, plusieurs types de détergents s'oxydent facilement lorsqu'ils sont exposés à l'air ou à la lumière UV, ce qui leur fait perdre leurs propriétés et leur puissance en tant qu'agents solubilisants. Nous proposons plusieurs détergents de haute pureté et à faible teneur en peroxyde qui sont conditionnés sous azote gazeux dans des ampoules en verre transparent. Ces solutions détergentes Thermo Scientific Surfact-Amps offrent une commodité, une qualité et une cohérence inégalées pour toutes les applications de détergent. Un kit d'échantillonnage comprend 10 détergents purifiés différents (sept au format Surfact-Amps et trois sous forme solide).

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Structure des membranes cellulaires

Un facteur majeur déterminant le comportement et l'interaction des molécules dans les échantillons biologiques est leur hydrophilie ou leur hydrophobie. La plupart des protéines et autres molécules avec des groupes fonctionnels chargés ou polaires sont solubles (ou miscibles) dans l'eau car elles participent à la structure intermoléculaire hautement ordonnée et liée à l'hydrogène de l'eau. Certaines autres protéines (ou au moins des parties de protéines), ainsi que les graisses et les lipides, manquent de groupes fonctionnels polaires ou chargés par conséquent, elles sont exclues de l'interaction ordonnée de l'eau avec d'autres molécules polaires et ont tendance à s'associer dans des structures ayant une surface minimale. zone de contact avec l'environnement polaire. Cette association de molécules non polaires dans des solutions aqueuses est communément appelée attraction hydrophobe, bien qu'elle soit plus précisément comprise comme une exclusion de l'environnement hydrophile.

La formation et la stabilité des membranes biologiques résultent dans une large mesure de l'attraction hydrophobe des phospholipides, qui forment des feuilles bicouches ayant des « queues » lipidiques hydrophobes orientées dans l'épaisseur de la feuille et des groupes « têtes » polaires orientés vers les environnements aqueux externe et interne. Les protéines membranaires s'étendent complètement sur l'épaisseur de la membrane ou sont incorporées sur un côté de la membrane en accord avec leur structure de chaînes latérales d'acides aminés hydrophobes et hydrophiles et d'autres groupes fonctionnels.

Rupture membranaire, liaison aux protéines et solubilisation

Généralement, des concentrations modérées de détergents doux (c'est-à-dire non ioniques) compromettent l'intégrité des membranes cellulaires, facilitant ainsi la lyse des cellules et l'extraction des protéines solubles, souvent sous forme native. En utilisant certaines conditions tampons, divers détergents pénètrent efficacement entre les bicouches membranaires à des concentrations suffisantes pour former des micelles mixtes avec des phospholipides isolés et des protéines membranaires.

Lyse cellulaire à base de détergent. Des réactifs de lyse cellulaire dénaturants et non dénaturants peuvent être utilisés pour les procédures d'extraction de protéines.

Les détergents dénaturants tels que le SDS se lient à la fois aux protéines membranaires (hydrophobes) et non membranaires (solubles dans l'eau, hydrophiles) à des concentrations inférieures à la CMC (c'est-à-dire sous forme de monomères). La réaction est conduite à l'équilibre jusqu'à saturation. Par conséquent, la concentration libre de monomères détermine la concentration en détergent. La liaison au SDS est coopérative (c'est-à-dire que la liaison d'une molécule de SDS augmente la probabilité qu'une autre molécule de SDS se lie à cette protéine) et modifie la plupart des protéines en bâtonnets rigides dont la longueur est proportionnelle au poids moléculaire.

Les détergents non dénaturants tels que le Triton X-100 ont des têtes non polaires rigides et volumineuses qui ne pénètrent pas dans les protéines hydrosolubles. Par conséquent, ils ne perturbent généralement pas les interactions et les structures natives des protéines hydrosolubles et n'ont pas de propriétés de liaison coopérative. Le principal effet des détergents non dénaturants est de s'associer aux parties hydrophobes des protéines membranaires, leur conférant ainsi une miscibilité.

À des concentrations inférieures à la CMC, les monomères détergents se lient aux protéines hydrosolubles. Au-dessus de la CMC, la liaison du détergent aux protéines entre en compétition avec l'auto-association des molécules de détergent en micelles. Par conséquent, il n'y a effectivement aucune augmentation des monomères détergents liés aux protéines avec une concentration croissante de détergent au-delà de la CMC.

Les monomères détergents solubilisent les protéines membranaires en se partageant dans la bicouche membranaire. Avec des quantités croissantes de détergents, les membranes subissent diverses étapes de solubilisation. Le stade initial est la lyse ou la rupture de la membrane. À des rapports molaires détergent:lipide membranaire de 0,1:1 à 1:1, la bicouche lipidique reste généralement intacte mais une extraction sélective de certaines protéines membranaires se produit. En augmentant le rapport à 2:1, la solubilisation de la membrane se produit, résultant en des micelles mixtes. Il s'agit notamment des micelles phospholipide-détergent, des micelles détergent-protéine et des micelles lipide-détergent-protéine. À un rapport de 10:1, toutes les interactions lipides membranaires:protéines natives sont efficacement échangées contre des interactions détergent:protéines.

La quantité de détergent nécessaire pour une extraction optimale des protéines dépend de la CMC, du nombre d'agrégats, de la température et de la nature de la membrane et du détergent. Le tampon de solubilisation doit contenir suffisamment de détergent pour fournir plus de 1 micelle par molécule de protéine membranaire afin de garantir que les molécules de protéine individuelles sont isolées dans des micelles séparées.

Détergents utilisés pour la lyse cellulaire. Principales caractéristiques des détergents dénaturants et non dénaturants utilisés pour l'extraction des protéines.


Chromatographie

La chromatographie sur colonne est l'une des méthodes les plus courantes de purification des protéines. Comme beaucoup de techniques sur ce site, c'est autant une forme d'art qu'une science. Les protéines varient énormément dans leurs propriétés, et les différents types de chromatographie sur colonne vous permettent d'exploiter ces différences. La plupart de ces méthodes ne nécessitent pas la dénaturation des protéines.

Pour être très général, une protéine est passée à travers une colonne conçue pour piéger ou ralentir le passage des protéines en fonction d'une propriété particulière (telle que la taille, la charge ou la composition).

Il y a trois étapes principales pour la purification des protéines :

1. Capturez. Vous devez obtenir votre protéine sous une forme concentrée. Si, par exemple, vous essayez d'isoler une protéine que vous avez synthétisée dans une cellule d'E. coli, vous pourriez avoir un rapport protéine/poubelle de 1:1 000 000. Pour la purification par capture, vous avez besoin d'une méthode de grande capacité qui est également rapide. Vous avez besoin d'une méthode rapide car votre solution brute est très susceptible de contenir également des protéases et celles-ci peuvent rapidement mâcher vos protéines.

2. Intermédiaire. La purification intermédiaire nécessite à la fois de la vitesse et une bonne résolution.

3. Polissage. Pour l'étape finale de purification, vous avez besoin d'un système qui a à la fois une bonne résolution et une bonne vitesse. La capacité n'a généralement pas d'importance à ce stade.

Certaines des colonnes les plus courantes incluent :

IEX : Chromatographie d'échange d'ions. Bon pour la capture, l'intermédiaire et le polissage.

HIC : Colonne d'interaction hydrophobe. Bon pour la purification intermédiaire.

CA : Chromatographie d'affinité. Bon pour la capture et la purification intermédiaire.

GF : Chromatographie par filtration sur gel (exclusion stérique). Bonne étape de polissage.

Examinons ces types de colonnes plus en détail.

Chromatographie échangeuse d'ions

La chromatographie par échange d'ions est basée sur la charge de la protéine que vous essayez d'isoler. Si votre protéine a une charge positive élevée, vous voudrez la faire passer dans une colonne avec une charge négative. La charge négative sur la colonne liera la protéine chargée positivement et d'autres protéines traverseront la colonne. Vous utilisez ensuite une procédure appelée « relargage » pour libérer votre protéine chargée positivement de la colonne chargée négativement. La colonne qui fait cela s'appelle une colonne échangeuse de cations et utilise souvent des résidus sulfonés. De même, vous pouvez lier une protéine chargée négativement à une colonne chargée positivement. La colonne qui fait cela s'appelle une colonne échangeuse d'anions et utilise souvent des résidus d'ammonium quaternaire.

Saler libérera ou éluera votre protéine de la colonne. Cette technique utilise une solution à forte concentration en sel. La solution saline surpassera la protéine en se liant à la colonne. En d'autres termes, la colonne a une plus grande attraction pour la charge de sels que pour la protéine chargée, et elle libérera la protéine en faveur de la liaison des sels à la place. Les protéines avec des interactions ioniques plus faibles seront éluées à un niveau de sel inférieur, vous voudrez donc souvent éluer avec un gradient de sel. Différentes protéines éluent à différentes concentrations de sel, vous voudrez donc être sûr de bien connaître les propriétés de vos meilleurs résultats de protéines.

Sachez également que les changements de pH modifient les charges des protéines. Assurez-vous de connaître le point isoélectrique de votre protéine (le point isoélectrique est le pH auquel la charge d'une protéine est nulle) et assurez-vous que le pH de votre système est ajusté et tamponné en conséquence.

Les étapes de base de l'utilisation d'une colonne échangeuse d'ions sont les suivantes :

1. Préparez la colonne. Versez votre tampon sur la colonne pour vous assurer qu'il s'est équilibré au pH requis.

2. Chargez votre solution de protéines. Certaines protéines de la solution ne se lient pas et s'élueront pendant cette phase de chargement.

3. Salez. Augmenter la concentration en sel pour éluer les protéines liées. Il est préférable d'utiliser un gradient de sel pour éluer progressivement les protéines avec différentes forces ioniques. À la fin, frappez le système avec une concentration en sel très élevée (2-3M) pour vous assurer que toutes les protéines sont hors de la colonne.

4. Enlevez les sels. Utilisez la dialyse pour éliminer les sels de votre solution de protéines.

La température n'a pas un effet énorme sur la chimie de la colonne. Cependant, il est préférable de travailler à froid car les protéines sont plus stables à froid.

Chromatographie d'interaction hydrophobe

Là où la chromatographie échangeuse d'ions repose sur les charges de protéines pour les isoler, la chromatographie d'interaction hydrophobe utilise les propriétés hydrophobes de certaines protéines. Les groupes hydrophobes sur la protéine se lient aux groupes hydrophobes sur la colonne. Plus une protéine est hydrophobe, plus elle se liera fortement à la colonne.

Charger les protéines en présence d'une forte concentration de sulfate d'ammonium (ne pas ammonium parsulfate). Le sulfate d'ammonium est un agent chaotrope. Il augmente le chaos (entropie) dans l'eau, et augmente ainsi les interactions hydrophobes (plus l'eau est désordonnée, plus les interactions hydrophobes sont fortes). Le sulfate d'ammonium stabilise également les protéines. Ainsi, grâce à l'utilisation d'une colonne HIC, vous pouvez vous attendre à ce que votre protéine soit sous sa forme la plus stable.

La colonne hydrophobe est garnie d'une matrice de phényl agarose. En présence de concentrations élevées de sel, les groupes phényle de cette matrice se lient aux portions hydrophobes des protéines. Vous pouvez contrôler l'élution de différentes protéines liées à la colonne en réduisant la concentration en sel ou en ajoutant des solvants.

Chromatographie d'affinité.

La chromatographie d'affinité repose sur les fonctions biologiques d'une protéine pour la lier à une colonne. Le type le plus courant implique un ligand, une petite biomolécule spécifique. Cette petite molécule est immobilisée et attachée à une matrice de colonne, telle que la cellulose ou le polyacrylamide. Votre protéine cible est ensuite passée à travers la colonne et liée à celle-ci par son ligand, tandis que d'autres protéines sont éluées. L'élution de votre protéine cible se fait généralement en faisant passer à travers la colonne une solution qui contient une forte concentration de ligand libre. Il s'agit d'une méthode de purification très efficace car elle repose sur la spécificité biologique de votre protéine cible, telle que l'affinité d'une enzyme pour un substrat.

Chromatographie par filtration sur gel (exclusion stérique) d

La filtration sur gel, ou la chromatographie d'exclusion stérique, sépare les protéines en fonction de leur taille. La colonne est garnie d'une matrice de fines billes poreuses.

Cela fonctionne un peu comme un tamis, mais à l'envers. Les perles ont de très petits trous. Au fur et à mesure que la solution de protéines est versée sur la colonne, de petites molécules pénètrent dans les pores des billes. Les molécules plus grosses sont exclues des trous et passent rapidement entre les billes.

Ces molécules plus grosses sont éluées en premier. Les molécules plus petites ont un chemin plus long à parcourir, car elles se coincent encore et encore dans le labyrinthe de pores allant de bille à bille. Ces molécules plus petites mettent donc plus de temps à traverser la colonne et sont éluées en dernier.


La PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide) est une méthode analytique utilisée pour séparer les composants d'un mélange de protéines en fonction de leur taille. La technique est basée sur le principe qu'une molécule chargée migrera dans un champ électrique vers une électrode de signe opposé. Les techniques générales d'électrophorèse ne peuvent pas être utilisées pour déterminer le poids moléculaire des molécules biologiques car la mobilité d'une substance dans le gel dépend de à la fois la charge et la taille. Pour surmonter cela, les échantillons biologiques doivent être traités afin qu'ils acquièrent une charge uniforme, puis la mobilité électrophorétique dépend principalement de la taille. Pour cela, différentes molécules de protéines de formes et de tailles différentes doivent être dénaturées (à l'aide de SDS) afin que les protéines perdent leur structure secondaire, tertiaire ou quaternaire. Les protéines couvertes par le SDS sont chargées négativement et lorsqu'elles sont chargées sur un gel et placé dans un champ électrique, il va migrer vers l'anode (électrode chargée positivement) sont séparés par un effet de tamisage moléculaire en fonction de la taille. Après la visualisation par une technique de coloration (protéine-spécifique), la taille d'une protéine peut être calculée en comparant sa distance de migration avec celle d'une échelle de poids moléculaire connue (marqueur).


Emballage de l'ADN, du génome, des protéines chromosomiques, de l'ADN chez les procaryotes & les eucaryotes

Les procaryotes sont des organismes vivants dont le matériel génétique n'est pas entouré d'une membrane nucléaire, mais trouvé libre dans le cytoplasme comme les bactéries, les molécules d'ADN des mitochondries et les chloroplastes (organites des cellules eucaryotes) sont très similaires à ceux des procaryotes, les plasmides se trouvent dans le cellules de levure (provenant d'eucaryotes).

ADN chez les procaryotes

ADN de la bactérie Escherichia coli comme exemple pour les procaryotes :

  1. L'ADN existe sous la forme d'une double hélice avec ses extrémités jointes les unes aux autres pour former un cercle.
  2. Si l'ADN était étiré en ligne droite, il aurait une longueur d'environ 1,4 millimètre, alors que la cellule elle-même n'a qu'une longueur d'environ 2 microns.
  3. L'ADN est plié plusieurs fois et occupe une zone nucléaire d'environ 0,1 % du volume de la cellule.
  4. La molécule d'ADN est attachée à la membrane plasmique en un point ou plus.

Certaines bactéries contiennent une ou plusieurs molécules d'ADN supplémentaires, beaucoup plus petites et circulaires, appelées « plasmides ». Les plasmides sont des molécules d'ADN circulaires beaucoup plus petites et non complexées avec des protéines.

Importance des plasmides : les plasmides sont largement utilisés dans le domaine du génie génétique, où la cellule bactérienne réplique tout plasmide à l'intérieur lors de la réplication de son ADN principal et les scientifiques tirent parti de cette activité en introduisant des plasmides artificiels dans les cellules bactériennes, afin pour en obtenir plusieurs exemplaires.

Emballage d'ADN

ADN chez les eucaryotes

Les eucaryotes sont des organismes vivants dont le matériel génétique est entouré d'une membrane nucléaire qui le sépare du cytoplasme et l'ADN est organisé en plusieurs chromosomes, La cellule somatique humaine contient 46 chromosomes, Les chromosomes apparaissent dans les cellules eucaryotes lors de la division cellulaire.

Structure des chromosomes

Chaque chromosome contient une seule molécule d'ADN, s'étendant d'une extrémité du chromosome à l'autre extrémité, la molécule d'ADN est enroulée et repliée plusieurs fois et associée à diverses protéines, formant une "chromatine" qui contient des quantités à peu près égales d'ADN et de protéines .

La chromatine est une molécule d'ADN qui est enroulée et repliée plusieurs fois et associée à des protéines. Les protéines chromosomiques sont divisées en protéines histones et protéines non histones.

Protéines histones

Les histones sont un groupe bien défini de petites protéines structurelles, où elles ont une teneur élevée en acides aminés basiques “arginine” et “lysine” et présentes en grande quantité dans la chromatine de n'importe quelle cellule.

Au pH normal de la cellule, les acides aminés “arginine” et “lysine” ont des groupes alkyle chargés positivement (R), donc, ils se lient fortement aux groupes phosphates chargés négativement de la molécule d'ADN, Les protéines histones sont responsables du raccourcissement de la molécule d'ADN par dix en formant une chaîne de nucléosomes.

Protéines non histones

Les non-histones sont des groupes hétérogènes de protéines structurelles et régulatrices avec de nombreuses fonctions trouvées dans la structure de la chromatine et elles sont présentes en petite quantité, Les protéines non histones ont de nombreuses fonctions différentes car elles contiennent :

  • Les protéines structurelles entrent dans la structure de certaines parties définies de la molécule d'ADN et jouent le rôle principal dans l'organisation spatiale de l'ADN dans le noyau car elles sont responsables du raccourcissement de l'ADN d'environ 100 000 fois en formant la chromatine emballée.
  • Les protéines régulatrices déterminent si le code ADN sera utilisé ou non pour fabriquer de l'ARN, des protéines et des enzymes.
Emballage d'ADN

Si nous imaginons que la double hélice d'ADN de chaque chromosome était alignée et étirée, elle ferait environ 2 mètres de long. Les histones et autres protéines sont responsables de l'emballage de cette longue molécule dans le noyau de la cellule de 2 : 3 microns en diamètre.

Étapes de l'emballage de l'ADN

L'analyse biochimique et les micrographies électroniques ont montré que l'ADN est emballé, comme suit :

  1. L'ADN est enroulé autour d'amas d'histones, formant une chaîne de particules appelées « nucléosomes ». Cela raccourcit la molécule d'environ dix fois, mais elle doit être emballée environ 100 000 fois plus étroitement pour s'intégrer dans le noyau.
  2. La chaîne de nucléosomes est enroulée pour emballer les nucléosomes ensemble. Cependant, même cela ne suffit pas pour raccourcir la molécule d'ADN à la longueur requise.
  3. Les chaînes de nucléosomes étroitement enroulées sont disposées en grandes boucles qui sont maintenues ensemble par les protéines structurelles non histones pour former la chromatine. La chromatine est emballée aussi étroitement que possible pour être condensée dans le chromosome.

Les nucléosomes sont une chaîne de particules qui se trouvent dans les chromosomes et consistent en une molécule d'ADN blessée (enroulée) autour d'amas d'histones pour raccourcir la molécule d'ADN d'environ dix fois.

Lorsque l'ADN est emballé sous forme de chromatine, les enzymes de réplication ne peuvent apparemment pas l'atteindre. Cet emballage doit être déroulé au moins en une chaîne de nucléosomes avant que l'ADN puisse servir de matrice pour la synthèse d'ADN ou d'ARN.

Structure du génome

En 1977, les chercheurs ont trouvé des méthodes qui peuvent être utilisées pour déterminer la séquence de nucléotides dans les molécules d'ADN et d'ARN. Cela a fourni les outils pour décrire précisément comment les gènes sont disposés dans la molécule d'ADN de la cellule. Le génome est le total de tous les gènes (tous l'ADN) trouvés dans la cellule.

L'ADN contient des gènes qui portent des instructions pour construire :

  • Séquence de nucléotides responsable de la fabrication des protéines.
  • Séquence de nucléotides qui transcrit l'ARN ribosomique (ARNr) qui entre dans la construction des ribosomes.
  • Séquence de nucléotides qui transcrit l'ARN de transfert (ARNt) qui transporte les acides aminés lors de la synthèse des protéines.

Les gènes chez les procaryotes sont les gènes responsables de la synthèse de l'ARN et des protéines et représentent la majeure partie du génome.

Les gènes chez les eucaryotes : moins de 70 % du génome servent à la synthèse de l'ARN et des protéines et le reste du génome n'est pas comptabilisé (a une fonction inconnue).

ADN répétitif

La plupart des gènes ne sont présents que dans une ou quelques copies dans le génome, tels que :

Gènes nécessaires pour synthétiser l'ARN ribosomique et les histones dont la cellule a besoin en grande quantité, où il est raisonnable de supposer que le fait d'avoir plusieurs copies de ces gènes pour accélérer la production de nouveaux ribosomes et histones par la cellule. souvent des centaines de copies des gènes dans toutes les cellules eucaryotes.

Certaines séquences de nucléotides de l'ADN ont été répétées plusieurs fois. Le rôle de la plupart de cet ADN répétitif n'est pas encore clair. Par exemple, chez la mouche des fruits (Drosophila), la brève séquence de nucléotides (AGAAG) est répétée environ 100 000 fois au milieu de un chromosome, Ceci et de nombreuses autres séquences répétées sont de l'ADN non codant.

Autre ADN non codant

L'ADN satellite de certains chromosomes est non codant, les génomes eucaryotes contiennent beaucoup d'autres ADN non codants, où les généticiens observent que la quantité d'ADN dans le génome de l'espèce a peu de rapport avec la complexité de l'organisme ou le nombre de protéines qui sont produit par celui-ci, peu d'ADN des plantes et des animaux code en fait pour la synthèse des protéines.

Exemple : Le plus grand génome connu appartient à la salamandre, ses cellules contiennent environ 30 fois la quantité d'ADN trouvée dans les cellules humaines, bien qu'elles produisent moins de protéines, cela est dû au non-codage d'une grande quantité d'ADN.

Fonctions de l'ADN non codant :

  1. Perhaps some of the noncoding DNA act on keeping the chromosomes structure.
  2. Some regions of DNA are references to the places at which the messenger RNA (mRNA) synthesis should start and these regions are important in the protein synthesis.

We can compare between prokaryotic DNA and eukaryotic DNA, as follows:

Prokaryotic DNA

It exists as a double helix, its ends are joined together, it is attached to the plasma membrane at one point or more and it is not organized in the form of chromosomes, It is found in the cytoplasm (not surrounded by the nuclear membrane), It is not complexed with proteins.

The most are coding, It starts from the attachment point with the plasma membrane, Plasmids present and not complexed with proteins, Most of them are responsible for making the RNA and proteins.

Eukaryotic DNA

Eukaryotic DNA exists as a double helix, its ends are free and it is organized in several chromosomes, It is found in the nucleus (surrounded by the nuclear membrane), It is complexed with histone and non-histone proteins.

Some are non-coding, It starts at any point along the DNA molecule, Plasmids present in the yeast only, Less than 70% serve the function of RNA and protein synthesis and the rest of the genome is unaccounted (has unknown function).


Acides aminés

Protéines sont l'une des molécules organiques les plus abondantes dans les systèmes vivants et ont la gamme de fonctions la plus diversifiée de toutes les macromolécules. Les protéines peuvent être structurelles, régulatrices, contractiles ou protectrices, elles peuvent servir au transport, au stockage ou aux membranes ou elles peuvent être des toxines ou des enzymes. Chaque cellule d'un système vivant peut contenir des milliers de protéines, chacune ayant une fonction unique. Leurs structures, comme leurs fonctions, varient considérablement. Ce sont tous, cependant, des polymères de acides aminés, disposés dans une séquence linéaire.

Figure 1. Les acides aminés ont un carbone asymétrique central auquel un groupe amino, un groupe carboxyle, un atome d'hydrogène et une chaîne latérale (groupe R) sont attachés.

Acides aminés sont les monomères qui composent les protéines. Chaque acide aminé a la même structure fondamentale, qui se compose d'un atome de carbone central, également connu sous le nom d'alpha (??) carbone, lié à un groupe amino (NH2), un groupe carboxyle (COOH) et à un atome d'hydrogène. Chaque acide aminé a également un autre atome ou groupe d'atomes lié à l'atome central connu sous le nom de groupe R (Figure 1).

Le nom « acide aminé » est dérivé du fait qu'ils contiennent à la fois un groupe aminé et un groupe acide carboxylique dans leur structure de base. Comme mentionné, il y a 20 acides aminés présents dans les protéines. Dix d'entre eux sont considérés comme des acides aminés essentiels chez l'homme car le corps humain ne peut pas les produire et ils sont obtenus à partir de l'alimentation.

Pour chaque acide aminé, le groupe R (ou chaîne latérale) est différent (figure 2).

Question de pratique

Figure 2. Il existe 20 acides aminés communs que l'on trouve couramment dans les protéines, chacun avec un groupe R différent (groupe variant) qui détermine sa nature chimique.

Quelles catégories d'acides aminés vous attendriez-vous à trouver à la surface d'une protéine soluble, et lesquelles vous attendriez-vous à trouver à l'intérieur ? Quelle distribution d'acides aminés vous attendriez-vous à trouver dans une protéine intégrée dans une bicouche lipidique ?

La nature chimique de la chaîne latérale détermine la nature de l'acide aminé (c'est-à-dire s'il est acide, basique, polaire ou non polaire). Par exemple, l'acide aminé glycine a un atome d'hydrogène comme groupe R. Les acides aminés tels que la valine, la méthionine et l'alanine sont de nature non polaire ou hydrophobe, tandis que les acides aminés tels que la sérine, la thréonine et la cystéine sont polaires et ont des chaînes latérales hydrophiles. Les chaînes latérales de la lysine et de l'arginine sont chargées positivement et, par conséquent, ces acides aminés sont également appelés acides aminés basiques. La proline a un groupe R qui est lié au groupe amino, formant une structure en forme d'anneau. La proline est une exception à la structure standard d'un acide aminé puisque son groupe amino n'est pas séparé de la chaîne latérale (Figure 2).

Les acides aminés sont représentés par une seule lettre majuscule ou une abréviation de trois lettres. Par exemple, la valine est connue par la lettre V ou le symbole à trois lettres val. Tout comme certains acides gras sont essentiels à un régime, certains acides aminés sont également nécessaires. Ils sont connus sous le nom d'acides aminés essentiels et, chez l'homme, ils comprennent l'isoleucine, la leucine et la cystéine. Les acides aminés essentiels font référence à ceux nécessaires à la construction des protéines dans le corps, bien que non produits par le corps, les acides aminés essentiels varient d'un organisme à l'autre.

Figure 3. La formation de liaisons peptidiques est une réaction de synthèse par déshydratation. Le groupe carboxyle d'un acide aminé est lié au groupe amino de l'acide aminé entrant. Dans le processus, une molécule d'eau est libérée.

La séquence et le nombre d'acides aminés déterminent en fin de compte la forme, la taille et la fonction de la protéine. Chaque acide aminé est lié à un autre acide aminé par une liaison covalente, appelée liaison peptidique, qui est formée par une réaction de déshydratation. Le groupe carboxyle d'un acide aminé et le groupe aminé de l'acide aminé entrant se combinent, libérant une molécule d'eau. La liaison résultante est la liaison peptidique (figure 3).

Les produits formés par de telles liaisons sont appelés peptides. Au fur et à mesure que davantage d'acides aminés se joignent à cette chaîne en croissance, la chaîne résultante est connue sous le nom de polypeptide. Chaque polypeptide a un groupe amino libre à une extrémité. Cette extrémité est appelée N terminal, ou amino terminal, et l'autre extrémité a un groupe carboxyle libre, également connu sous le nom de C ou carboxyle terminal. Alors que les termes polypeptide et protéine sont parfois utilisés de manière interchangeable, un polypeptide est techniquement un polymère d'acides aminés, alors que le terme protéine est utilisé pour un polypeptide ou des polypeptides qui se sont combinés, ont souvent lié des groupes prothétiques non peptidiques, ont une forme distincte , et ont une fonction unique. Après la synthèse des protéines (traduction), la plupart des protéines sont modifiées. Celles-ci sont connues sous le nom de modifications post-traductionnelles. Ils peuvent subir un clivage, une phosphorylation ou nécessiter l'ajout d'autres groupes chimiques. Ce n'est qu'après ces modifications que la protéine est complètement fonctionnelle.

L'importance évolutive du cytochrome c

Le cytochrome c est un composant important de la chaîne de transport d'électrons, une partie de la respiration cellulaire, et il se trouve normalement dans l'organite cellulaire, la mitochondrie. Cette protéine a un groupe prothétique hème, et l'ion central de l'hème est alternativement réduit et oxydé pendant le transfert d'électrons. Parce que le rôle de cette protéine essentielle dans la production d'énergie cellulaire est crucial, elle a très peu changé au cours de millions d'années. Le séquençage des protéines a montré qu'il existe une quantité considérable d'homologie de séquence d'acides aminés du cytochrome c entre différentes espèces, en d'autres termes, la parenté évolutive peut être évaluée en mesurant les similitudes ou les différences entre les différentes espèces d'ADN ou de séquences de protéines.

Les scientifiques ont déterminé que le cytochrome c humain contient 104 acides aminés. Pour chaque molécule de cytochrome c provenant de différents organismes qui a été séquencée à ce jour, 37 de ces acides aminés apparaissent dans la même position dans tous les échantillons de cytochrome c. Cela indique qu'il peut y avoir eu un ancêtre commun. En comparant les séquences des protéines humaines et de chimpanzé, aucune différence de séquence n'a été trouvée. Lorsque les séquences de l'homme et du singe rhésus ont été comparées, la seule différence trouvée était dans un acide aminé. Dans une autre comparaison, le séquençage humain à levure montre une différence en 44e position.


Native Protein Electrophoresis

Proteins run on PAGE in the absence of SDS will separate on the basis of their charge to mass ratio. While native (nondenaturing) PAGE does not provide direct measurement of molecular weight, the technique can provide useful information such as protein charge or subunit composition. Native PAGE also has the potential for separating proteins of identical molecular weight which cannot be resolved with SDS - PAGE. In addition, proteins on native PAGE usually retain their activity. This allows enzymes to be detected by sensitive and specific activity stains and delicate proteins to be resolved and recovered in a biologically active form.

The interpretation of native gels is more complex than the interpretation of SDS - PAGE gels. Not only can differences in relative mobility reflect differences in charge, mass or both, but also, proteins may have a pI at or above the pH of the buffer, in which case they will not migrate or will "retro-phorese" backward into the upper buffer chamber.

The equation governing protein mobility in native gels is as follows:

  • RF = relative mobility, normalized to the dye front or some other standard.
  • Ouio = relative mobility of the protein in the absence of any sieving matrix.
  • KR = "retardation coefficient," the extent to which the gel matrix affects mobility.
  • T = % monomer of the gel matrix.

In the presence of SDS, all proteins have the same Yo, so that a simple relationship exists between RF et KR at any given T. In other words, SDS treated proteins, having identical charge to mass ratio, migrate at the same speed in free solution under electric force. With such proteins, if you know the mechanical resistance exerted by the gel, you can determine the mobility. This mechanical resistance, KR, is directly related to molecular weight, so that a determination of KR allows calculation of molecular weight. In native gels, the situation is more complicated. Both Y0 et KR can vary between proteins. Oui0 is related to the charge, while KR varies with the mass.

Ferguson Plots

Separation of protein mixtures and protein standards on gels of varying percentages allows the determination of both charge and mass of the sample proteins. The graphic analysis used is known as the Ferguson plot. On the Ferguson plot, the logarithm of RF is graphed versus T for a range of T (the originators of this system covered 7 different percentage gels). By the above equation, the graph should have a slope of KR and a Y intercept (at T = 0) of Yo. Comparison with standards of known charge and size allows determination of the charge and molecular weight of the samples.

Native Gradient Gels

Another less laborious way of simplifying the interpretation of native PAGE gels is to run a gradient gel. Native gradient gels are poured in the same manner as gradient SDS PAGE gels. As proteins migrate through the increasing acrylamide concentration, into regions of ever smaller pore sizes, their mobility decreases. Eventually, each protein reaches its "pore-limit", at which point it slows to a minimum migration rate, which is constant for all proteins at their pore limit. The band pattern is stabilized at this point, so that gradient native gel PAGE approaches an equilibrium system, in that beyond a certain run length only minimal changes occur in the gel pattern.

Once proteins reach their pore limit, their relative positions are a direct reflection of their molecular weight. In a linear gradient, the logarithm of the molecular weight is proportional to log RF over a wide range, although the curve is actually sigmoid in shape. This type of analysis is more subject to artifacts than the Ferguson plot, but is easier to carry out.

Finally, native gradient gels may be analyzed with activity stains, which simplify the pattern by only visualizing enzyme activities of interest. This can be useful when purifying an enzyme from a mixture of isozymes, or when studying the expression or activity of enzyme families. It also allows for the isolation of electrophoretically pure, active enzyme. Used in conjunction with gradient gels, activity stains can provide molecular weight information about otherwise uncharacterized enzymes. Of course, the technique is limited to enzymes for which chromogenic or chemiluminescent assays exist. Often an assay can be adapted from existing techniques with little effort. The critical requirement is that a colored compound be deposited in the gel in an insoluble form, either by the enzyme (positive stain) or in a reaction inhibited by the enzyme (negative stain).


Protéines

Proteins are the most diverse biomolecules and play a significant role in various biological processes. Enzymes are the most important functional proteins that catalyse biological reactions. Proteins are sensitive to heat and pH changes. They often undergo irreversible changes in structure, called protein denaturation, due to extreme change in temperature or pH. Amino acids are the monomers of complex proteins.

Peptide bonds and polypeptides

Carboxyl group of one amino acid reacts with amino group of another amino acid to form a dipeptide linked through a peptide bond. When 100 or more amino acids link through peptide bonds, the resulting chain of amino acids is called polypeptide. One or more polypeptide chains constitute a protein.

Structure of proteins

Proteins have four levels of structural organization including primary, secondary, tertiary and quaternary structures. Chain of amino acids joined by peptide bond forming a polypeptide is known as the primary structure of protein. The polypeptide chains may further bend or fold to form the secondary structure. There are two types of secondary structures including α-helix and β-sheets. The α-helix is a chain of amino acids that coil into a helix shape and stabilized by the formation hydrogen bonds between C=O and NH groups of various amino acids. The β-sheets are formed when the polypeptide chains arrange side by side and held together by hydrogen bonds between C=O and NH groups.

The side chain R groups of amino acids in polypeptide chain interact to through various interatomic forces like hydrogen bonds, hydrophobic bonds, disulphide bonds or van der Waals forces. This level of organization is known is tertiary structure. Two or more polypeptide chains may interact through hydrogen bonds, covalent bonds and/or hydrophobic interactions to form the quaternary structure. This is the most stable structure of proteins and gives a final 3-dimensional shape to the proteins.


What is the DNA/protein charge ratio? - La biologie

The human genome encodes over 20,000 genes each of the 23 pairs of human chromosomes encodes thousands of genes. The DNA in the nucleus is precisely wound, folded, and compacted into chromosomes so that it will fit into the nucleus. It is also organized so that specific segments can be accessed as needed by a specific cell type.

The first level of organization, or packing, is the winding of DNA strands around histone proteins. Histones package and order DNA into structural units called nucleosome complexes, which can control the access of proteins to the DNA regions (Figure 1a). Under the electron microscope, this winding of DNA around histone proteins to form nucleosomes looks like small beads on a string (Figure 1b). These beads (histone proteins) can move along the string (DNA) and change the structure of the molecule.

Figure 1. DNA is folded around histone proteins to create (a) nucleosome complexes. These nucleosomes control the access of proteins to the underlying DNA. When viewed through an electron microscope (b), the nucleosomes look like beads on a string. (credit “micrograph”: modification of work by Chris Woodcock)

If DNA encoding a specific gene is to be transcribed into RNA, the nucleosomes surrounding that region of DNA can slide down the DNA to open that specific chromosomal region and allow for the transcriptional machinery (RNA polymerase) to initiate transcription (Figure 2). Nucleosomes can move to open the chromosome structure to expose a segment of DNA, but do so in a very controlled manner.

Question de pratique

Figure 2. Nucleosomes can slide along DNA. When nucleosomes are spaced closely together (top), transcription factors cannot bind and gene expression is turned off. When the nucleosomes are spaced far apart (bottom), the DNA is exposed. Transcription factors can bind, allowing gene expression to occur. Modifications to the histones and DNA affect nucleosome spacing.

In females, one of the two X chromosomes is inactivated during embryonic development because of epigenetic changes to the chromatin. What impact do you think these changes would have on nucleosome packing?

How closely the histone proteins associate with the DNA is regulated by signals found on both the histone proteins and on the DNA. These signals are functional groups added to histone proteins or to DNA and determine whether a chromosomal region should be open or closed (Figure 3 depicts modifications to histone proteins and DNA). These tags are not permanent, but may be added or removed as needed. Some chemical groups (phosphate, methyl, or acetyl groups) are attached to specific amino acids in histone “tails” at the N-terminus of the protein. These groups do not alter the DNA base sequence, but they do alter how tightly wound the DNA is around the histone proteins. DNA is a negatively charged molecule and unmodified histones are positively charged therefore, changes in the charge of the histone will change how tightly wound the DNA molecule will be. By adding chemical modifications like acetyl groups, the charge becomes less positive, and the binding of DNA to the histones is relaxed. Altering the location of nucleosomes and the tightness of histone binding opens some regions of chromatin to transcription and closes others.

The DNA molecule itself can also be modified by methylation. DNA methylation occurs within very specific regions called CpG islands. These are stretches with a high frequency of cytosine and guanine dinucleotide DNA pairs (CG) found in the promoter regions of genes. The cytosine member of the CG pair can be methylated (a methyl group is added). Methylated genes are usually silenced, although methylation may have other regulatory effects. In some cases, genes that are silenced during the development of the gametes of one parent are transmitted in their silenced condition to the offspring. Such genes are said to be imprinted. Parental diet or other environmental conditions may also affect the methylation patterns of genes, which in turn modifies gene expression. Changes in chromatin organization interact with DNA methylation. DNA methyltransferases appear to be attracted to chromatin regions with specific histone modifications. Highly methylated (hypermethylated) DNA regions with deacetylated histones are tightly coiled and transcriptionally inactive.

Figure 3. Histone proteins and DNA nucleotides can be modified chemically. Modifications affect nucleosome spacing and gene expression. (credit: modification of work by NIH)

Epigenetic changes are not permanent, although they often persist through multiple rounds of cell division and may even cross generational lines. Chromatin remodeling alters the chromosomal structure (open or closed) as needed. If a gene is to be transcribed, the histone proteins and DNA in the chromosomal region encoding that gene are modified in a way that opens the promoter region to allow RNA polymerase and other proteins, called transcription factors , to bind and initiate transcription. If a gene is to remain turned off, or silenced, the histone proteins and DNA have different modifications that signal a closed chromosomal configuration. In this closed configuration, the RNA polymerase and transcription factors do not have access to the DNA and transcription cannot occur (Figure 3).

View this video that describes how epigenetic regulation controls gene expression.

In Summary: Eukaryotic Epigenetic Gene Regulation

In eukaryotic cells, the first stage of gene expression control occurs at the epigenetic level. Epigenetic mechanisms control access to the chromosomal region to allow genes to be turned on or off. These mechanisms control how DNA is packed into the nucleus by regulating how tightly the DNA is wound around histone proteins. The addition or removal of chemical modifications (or flags) to histone proteins or DNA signals to the cell to open or close a chromosomal region. Therefore, eukaryotic cells can control whether a gene is expressed by controlling accessibility to transcription factors and the binding of RNA polymerase to initiate transcription.


Voir la vidéo: From DNA to Protein (Janvier 2022).